Содержание к диссертации
Введение
Материалы и методы исследования 43
1. Изучение нейропротективных и антиамнестических свойств веществ 43
1.1. Изучение эффективности ампассе на модели массивной кортикальной ишемии 43
1.2. Изучение эффективности ампассе на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) 44
1.3. Изучение эффективности ампассе на модели естественного старения 45
1.4. Изучение эффективности ампассе на модели холинергического дефицита у крыс 46
1.5. Изучение эффективности ампассе на модели ареколинового тремора 46
1.6. Изучение эффективности ампассе на модели моторного дефицита, вызванного этанолом 47 1.7. Изучение эффективности ампассе на модели нарушения ориентировочно-исследовательского поведения, вызванные этанолом 47
1.8. Модель гипобарической гипоксии 48
1.9. Модель гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме 48
1.10. Методика амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной скополамином 48
1.11. Методика амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной максимальным электрошоком 48
2. Методы исследования влияния веществ на обучение 49
2.1. Методика обучения условному питьевому рефлексу в Т-образном лабиринте 49
2.2. Методика обучения условной реакции пассивного избегания (УРПИ) 49
2.3. Методика обучения условной реакции активного избегания (УРАИ), в условиях модели «Шаттл – бокс» 50
3. Методы исследования неврологтческого статуса и двигательной активности животных 51
3.1. Методика приподнятого крестообразного лабиринта 51
3.2. Оценка ориентировочно - исследовательского поведения и двигательной активности животных. Методика открытого поля 51
3.3. Исследование неврологического дефицита по шкале Stroke-index McGrow 51
3.4. Исследование нарушения координации движений в тесте вращающегося стержня 52
3.5. Определение болевой чувствительности и агрессивности 53
4. Формирование синдрома отмены 53
Результаты и обсуждение 54
1. Исследование нейропротективных свойств ампассе на различных моделях нейродегенерации 54
1.1. Изучение эффектов ампассе на модели массивной кортикальной ишемии 54
1.1.1. Изучение влияния ампассе на площадь ишемического поражения коры на модели массивной кортикальной ишемии 55
1.1.2. Изучение влияния ампассе на обучение и память животных с массивной кортикальной ишемией 56
1.2. Изучение эффектов ампассе на модели геморрогического инсульта, вызванного посттравматической гематомой 57
1.2.1. Изучение влияния ампассе на гибель и неврологический дефицит крыс с ГИ 1.2.2.Изучение влияния ампассе на обучение и память животных с ГИ 59
1.3. Изучение эффектов ампассе на когнитивный и неврологический дефицит у крыс в условиях естественного старения 61
1.3.1 Изучение влияния ампассе на нарушения обучения и памяти у старых крыс (в возрасте 24 месяцев) 61
1.3.2. Изучение влияния ампассе на неврологический дефицит у старых крыс (в возрасте 24 месяцев) 61
1.4. Изучение эффектов ампассе на память и неврологический дефицит у крыс в
условиях дефицита холинергической системы (на модели ускоренного старения) 63
1.4.1. Изучение влияния ампассе на обучение УРАИ крыс с холинергическим дефицитом 63
1.4.2. Изучение влияния ампассе на обучение УРПИ крыс с холинергическим дефицитом 66
1.4.3. Изучение влияния ампассе на ориентировочно-исследовательское поведение и эмоциональное статус крыс с холинергическим дефицитом 67
1.4.4. Изучение влияния ампассе на неврологические нарушения крыс с холинергическим дефицитом 70
1.5. Изучение эффектов ампассе на тремор, вызванный холиномиметиком ареколином 72
1.6. Изучение эффектов ампассе на память и неврологический дефицит у крыс в условиях острой алкогольной интоксикации 72
1.6.1. Изучение влияния ампассе на вызванный этанолом неврологический дефицит 73
1.6.2. Изучение влияния ампассе на нарушения двигательного и ориентировочно исследовательского поведения, вызванные этанолом 74
1.6.3.Изучение влияния ампассе на обучение УРПИ, нарушенное этанолом 75
2. Исследование ноотропных и антиамнестических свойств ампассе у интактных крыс и на моделях различных амнезий 79
2.1. Изучение эффектов ампассе на модели гипобарической гипоксии и гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме 79
2.2. Изучение ноотропного эффекта ампассе в Т-образном лабиринте 80
2.3. Изучение антиамнестического эффекта ампассе на различных моделях амнезии 82
2.3.1. Изучение влияния ампассе на модели амнезии УРПИ, вызванной скополамином 82
2.3.2. Изучение влияния ампассе на модели амнезии УРПИ, вызванной МЭШ 83
3. Исследование возможных побочных эффектов ампассе при длительном применении и после его отмены у крыс 85
3.1. Изучение эффектов ампассе на поведение и память животных при хроническом и однократном введении 85
3.1.1. Изучение основного антиамнестического действия ампассе при хроническом введении 86
3.1.2. Изучение влияния длительного введения ампассе на поведение крыс в тесте открытого поля 87
3.1.3. Изучение влияния длительного введения Ампассе на болевую чувствительность и агрессивность крыс 87
3.1.4. Изучение влияния длительного введения ампассе на судорожную готовность крыс, вызванную коразолом 88
3.2. Изучение влияния отмены хронического введения ампассе на поведение крыс 3.2.1. Изучение влияния ампассе на ориентировочно-исследовательское поведение у крыс после отмены хронического введения 89
3.2.2. Изучение влияния ампассе на эмоциональный статус крыс после отмены хронического введения 90
3.2.3. Изучение влияния отмены хронического введения ампассе на болевую чувствительность и агрессивность крыс 91
3.2.4. Изучение влияния отмены длительного введения ампассе на судорожную готовность крыс, вызванную коразолом 92
Заключение 94
Выводы 110
Список литературы 112
- Изучение эффективности ампассе на модели естественного старения
- Оценка ориентировочно - исследовательского поведения и двигательной активности животных. Методика открытого поля
- Изучение эффектов ампассе на модели массивной кортикальной ишемии
- Изучение влияния длительного введения ампассе на поведение крыс в тесте открытого поля
Введение к работе
Актуальность проблемы
Каждый год от болезней, сопровождающихся нейродегенерацией, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, цереброваскулярные расстройства, инсульты, травмы и др., погибают или становятся нетрудоспособными миллионы людей в мире. В частности, в ряде стран болезнь Альцгеймера занимает одно из первых мест среди других болезней в качестве причины смерти (Brookmeyer R, Johnson Е. et al. 2007). Инсульт занимает третье место среди болезней, вызывающих смерть пациентов, а травмы мозга являются наиболее частыми заболеваниями, приводящими к нетрудоспособности лиц в молодом возрасте (СкворцоваВ.И., 2013).
Препараты с ноотропным действием, применяемые в настоящее время для лечения когнитивных расстройств, недостаточно эффективны. Выделяют истинные ноотропы, ведущее свойство которых - улучшение когнитивных функций, и ноотропоподобные средства - препараты поливалентного комплексного нейропротективного действия (Т.А. Воронина и СБ. Середенин, 1993). Препараты с нейропротективным действием часто направлены только на локализацию драматических последствий. Однако у ряда имеющихся лекарственных препаратов нейропротективные свойства выражены довольно слабо; также они обладают побочными действиями, ограничивающими возможности их длительного и широкого применения. А терапевтический эффект ноотропов наступает только через продолжительный срок применения и требует достаточно высоких доз.
Эффекты нейропротективных средств могут реализоваться за счет церебральной вазодилатации (ницерголин), антагонизма кальциевых каналов (нимодипин), антиоксидантного действия (мексидол), влияния на ГАМК-систему (пантогам), активации метаболизма (ацетил-Ь-карнитин), ингибиро-вания микроглии (НПВС), активации нейрогенеза (ростовые факторы) и др. Эффект ряда ноотропных средств опосредуется через нейромедиаторные си-
стемы мозга среди которых наибольшее значение имеют моноаминергиче-ская, холинергическая, глутаматергическая (Ковалев Г.И., 1993, Zhao, 2001, Marchi, 1992, Петров В.И., 2003, Бачурин CO., 2008, Григорьев В.В., 2008). Эффективны подходы поиска нейропротекторов и когнитивных стимуляторов, основанных на представлениях о важнейшей роли NMDA и АМРА типов глутаматных рецепторов в механизмах памяти и выживании нейрона. В настоящее время активно разрабатываются препараты для лечения когнитивных расстройств и неиродегенеративных процессов с глутаматергическим механизмом действия.
Очевидно, что фармакологическая коррекция неиродегенеративных расстройств, сопровождающихся развитием неврологического и когнитивного дефицитов, относится к одной из наиболее важных проблем фармакологии и неврологии.
Цель и задачи исследования
Целью работы является изучение нейропсихотропных свойств кальциевой соли М-(-5-гидроксиникотиноил)-Ь-глутаминовой кислоты (ампассе) в качестве потенциального лекарственного средства.
Задачи исследования:
-
Изучение нейропротективных эффектов ампассе на модели массивной кортикальной ишемии на крысах.
-
Изучение нейропротективных эффектов ампассе на модели посттравматической интрацеребральной гематомы (геморрагический инсульт) на крысах.
-
Изучение эффектов ампассе у крыс на модели естественного старения.
-
Изучение эффектов ампассе на модели болезни Альцгей-мера у крыс.
-
Изучение антиалкогольных свойств ампассе в условиях острого алкогольного отравления на крысах.
-
Изучение антиамнестического действия ампассе на моделях амнезии условного рефлекса пассивного избегания, вызванной скополамином и максимальным электрошоком.
-
Изучение влияния ампассе на процессы памяти на модели условнорефлекторного обучения крыс питьевому рефлексу в Т-образном лабиринте.
-
Изучение процессов толерантности при хроническом применении ампассе и синдрома отмены при отмене его длительного введения.
Научная новизна работы
В работе впервые выявлены нейропротективные, антиамнестические и антиалкогольные свойства нового оригинального соединения кальциевой соли М-(-5-гидроксиникотиноил)-Ь-глутаминовой кислоты. Показано, что ампассе при однократном и длительном введении способно корректировать когнитивные и неврологические нарушения, возникающие при различных моделях патологии (инсульты, ишемия мозга, экспериментальная болезнь Аль-цгеймера, изменения сопряженные с процессами естественного старения). Антиамнестические эффекты препарата исследования сопоставимы или превышают таковые у препарата сравнения пирацетама. При длительном применении ампассе не развиваются толерантность и синдром отмены после прекращения применения.
Научно-практическая значимость
Экспериментальные результаты, полученные в настоящем исследовании, позволяют рассматривать кальциевую соль М-(-5-гидроксиникотиноил)-L-глутаминовой кислоты в качестве перспективного соединения для создания безопасного эффективного лекарственного средства, обладающего нейропротекторными и ноотропными свойствами. Ампассе может быть использовано для лечения ряда заболеваний и состояний (инсульты, абстинент-
ный синдром, дисциркуляторная энцефалопатия, болезнь Альцгеймера и другие). Материалы диссертационной работы вошли в регистрационное досье препарата ампассе для подачи в Минздрав РФ.
Положения выносимы на защиту
-
Ампассе обладает выраженным нейропротективным эффектом на модели массивной кортикальной ишемии и модели геморрагического инсульта.
-
Ампассе на модели естественного старения и модели болезни Альцгеймера устраняет когнитивные и неврологические нарушения.
-
Ампассе проявляет отчетливые антиамнестические свойства в условиях острого алкогольного отравления и амнезий вызванных скополамином и максимальным электрошоком.
-
Ампассе при длительном введении проявляет выраженные ноо-тропные свойства.
-
Ампассе при хроническом введении в терапевтических дозах не приводит к появлению, неврологических побочных эффектов.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы были представлены на теоретическом семинаре Института Химической Физики им. Н.Н.Семенова Российской академии наук, 11-ом Региональном съезде ECNP (Санкт-Петербург, 2011); 14-ом биеннале EBPS (Amsterdam, 2011); XXIII симпозиуме «Современная Химическая Физика» (Туапсе, 2011); Международном конгрессе «28th World CINP Congress of Neuropsychopharmacology» (Stockholm, 2012).
Публикации
Основные положения диссертации опубликованы в 7 печатных работах: 4 статьи - в журналах рекомендованных ВАК; 3 публикации - в трудах конференций и съездов.
Личный вклад
Автор является непосредственным исполнителем всех этапов проведенного исследования: поиска и анализа литературы по теме диссертации, проведения радиолигандного анализа, поведенческих экспериментов, обработки и анализа полученных результатов, формулирования положений и выводов работы. При активном участии автора подготовлены основные публикации по материалам диссертации.
Структура и объём работы
Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, приложение и список литературы. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и 3 рисунка. Библиографический указатель включает 145 отечественных и иностранных источников.
Изучение эффективности ампассе на модели естественного старения
Дендритное дерево нейронов гиппокампа и зубчатой фасции обычно плотно усеяно шипиками; исключение могут составлять безшипиковые дендриты интернейронов (Buckmaster P.S., 2002; Lubke J., Frotscher 1998). Дендритные шипики образуют постсинаптические точки контакта для большинства возбудительных синапсов. Регуляция морфологии шипиковой сети осуществляется белками, регулирующими длину нитей F-актина, главными из которых являются профилин, кофилин, дребрин (Ivanov A., 2009). Профилин – белок, регулирующий полимеризацию основного цитоскелетного элемента F-актина, распределяется в зависимости от синаптической активности и в зависимости от подвижности шипиков.
Активирование глутаматом в культуре клеток гиппокампа постсинаптических N methyl-D-aspartate (NMDA) рецепторов приводит к накоплению профилина в дендритных шипиках, которое блокировалось, если клетки обрабатывали антагонистами NMDA рецепторов. Электрическая стимуляция нейронов также может вести к накоплению профилина в шипиках. Однако эффективными оказались лишь определенные паттерны электрической активности. Интересно то, что они оказались теми же паттернами, которые вызывают долгосрочные изменения в синаптической эффективности (synaptic efficacy). Стабилизация шипиков зависит от перераспределения профилина. Если заблокировать накопление профилина в шипиках, то меняется их форма, вместо грибовидной на неправильно-продолговатую. Эти опыты дают возможность моделировать стабилизацию шипиков. В работе Рогачевского В.Ю. из института биофизики РАН продемонстрировано, что в поздней фазе ДП, через 6 ч после индукции путем тетанической стимуляции перфорантного пути гиппокампа, в среднем молекулярном слое зубчатой фасции не выявляется изменения плотности синапсов (количества синапсов в 100мкмЗ ткани), но изменяется их соотношение и структура. Значительно, с 62% до 75% увеличивается доля синапсов на тонких шипиках, при этом доля стволовых синапсов уменьшается с 9% до 5%, а доля синапсов на пенковых шипиках уменьшается с 17% до 9%. Доля самых крупных, грибовидных шипиков, не меняется (12%). Существенно увеличиваются объемы шипиков (грибовидных на 75%, тонких на 95%), а также объемы постсинаптического уплотнения (ПСУ) у грибовидных на 62%, у тонких на 84%. Совокупность выявленных ультраструкгурных изменений позволяет говорить о наличии корреляции между поддержанием повышенной эффективности синаптической передачи и увеличением размеров структур, ответственных за ее осуществление. По всей вероятности, именно увеличение размеров постсинаптического уплотнения, соответственно и содержания в них глутаматных рецепторов, обеспечивает высокую эффективность синаптической передачи в поздней фазе ДП в системе перфорантный путь - гранулярнные нейроны зубчатой фасции (Рогачевский В.Ю. 2007). Кроме того, сохранение высокой эффективности синаптической передачи в поздней фазе ДП in vivo не связано с увеличением общего числа синапсов, но сопровождается изменением соотношений их типов, прежде всего увеличением доли синапсов на тонких дендритовых шипиках. Однако синапс, как правило, представлен как минимум еще двумя компонентами, пресинаптическим аксоном и глиальным окружением. Ранее было убедительно показано наличие синапсов между глиальными клетками и нейронами и долговременная потенциация глиальных клеток (Ge et al., 2006), и их участие в гетеросинаптической депрессии в СА1 области гиппокампа (Zhang et al., 2003). Пресинаптические механизмы потенциации исследованы также главным образом в ранней фазе ДП. Поэтому нельзя исключать, что все три компонента синапса вносят равноценный вклад в модуляцию эффективности синаптической передачи, и это открывает широкие горизонты для дальнейших исследований.
Синаптогенез. Роль AMPA рецепторов в ДП Во время обучения моторных задач индуцируется синаптогенез. Синаптогенез происходит в пирамидных нейронах после обучения навыку, но не в момент его приобретения. В дендритах наблюдается увеличение mRNA МАР2 (мРНК microtubule-associated protein 2), маркера, ответственного за разветвление дендритов, а также увеличение экспрессии синаптофисина (SYN), маркера синаптогенеза и GAP-43 белка, ответственного за аксональный рост. Большая часть нейробиологических исследований посвящена анализу процессов, происходящих при обучении и запоминании в синапсах.
Одной из наиболее охарактеризованных форм синаптической пластичности является гипокампальная долговременная потенциация (ДП).
Начальным событием в фазе ДП является индуцируемый внешним сигналом вход ионов Са2+. Ответ постсинаптического нейрона на высокочастотную стимуляцию представлен в сети как ряд молекулярных событий в дендритном шипике: высокочастотная стимуляция инициирует выброс нейромедиатора из пресинаптической терминали. В мембранном компартменте взаимодействие нейромедиатора с ионотронными АМРА рецепторами приводит к входу ионов натрия, деполяризации синаптической мембраны, что в свою очередь приводит к активации NMDA рецепторов (N-метил-D-аспарагин чувствительные рецепторы) и входу ионов кальция в клетку. Входящий кальций в цитоплазматическом компартменте запускает каскады регуляторных событий, обеспечивающих перемещение AMPA рецепторов (2-амино-3-гидрокси-5 метилизоксазол-4- пропион чувствительные рецепторы) и сопутствующих белков в составе эндосом при помощи актин - зависимых моторных белков из цитоплазматического пула шипика к мембране и встраивание дополнительных AMPA в активную зону синапса. Активация метаботропных рецепторов инициирует ремоделирование отдельных микрофиламентов и сети актинового цитоскелета.
В синапсах пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа возбуждающий нейромедиатор глютамат, взаимодействует с метаботропными и ионотропными рецепторами. Два типа ионотропных рецепторов – AMPA и NMDA имеют разное физиологическое значение. AMPA являются в некотором смысле "рабочими" рецепторами синапса, ответственными за передачу сигнала. Открытие каналов этих рецепторов происходит при любых потенциалах постсинаптической мембраны и они проницаемы преимущественно для ионов Na+. Каналы NMDA являются селективными Ca2+-каналами; их открытие происходит только при деполяризации постсинаптической мембраны; при потенциалах, близких к потенциалу покоя, NMDA-каналы заблокированы ионами Mg2+ внеклеточной среды.
Оценка ориентировочно - исследовательского поведения и двигательной активности животных. Методика открытого поля
Известно, что ишемические поражения мозга сопровождаются развитием воспалительных реакций в поврежденной ткани и изменениями микроглии и активности лейкоцитов. В клинике была установлена увеличенная продукция цитокинов типа IL-1 и IL-6, способствующих инфильтрации лейкоцитов в первые часы после возникновения инсульта, уровень которых коррелировал с тяжестью поражения (Tasci et al., 2003). Эти данные подтверждаются в эксперименте на модели окклюзионной ишемии мозга мышей, где введение антагониста рецепторов IL-1 уменьшило зону инфаркта (Boutin et al., 2001). Кроме перечисленного, в ишемизированных участках мозга экспрессируется нуклеарный фактор транскрипции (NF-kB), как правило, в нейронах «предназначенных» к гибели. Активация NF-kB может быть спровоцирована многими факторами, причастными к патогенезу ишемии — глутаматом, IL-1, TNF-alfa. Считается, что активация этого фактора перманентной ишемией или низкими дозами каината (сублетальная ишемия) вырабатывает толерантность мозга к повреждению, делая мозг более устойчивым к сильной ишемии или судорожной активности (Blondeau et al., 2001). Транслокация NF-kB в ядро сопряжено с отделением его от ингибирующего белка kappaB-alfa, содержание которого заметно снижено в ишемизированной зоне мозга, и, напротив, повышено в пенумбральной зоне.
Эндогенный противовоспалительный цитокин fractalkine (FKN), действуя через CX3CR1 рецепторы, уменьшает активацию микроглии, регулируя уровень IL-1. Низкий уровень FKN белка коррелирует с когнитивным дефицитом у пациентов с болезью Альцгеймера. (Adam D.Bachstetter, et al., 2011) Таким образом, цитокины реализуют одну из ключевых функций нейровоспаления – репарацию и функциональное восстановление ткани мозга.
Окклюзионная церебральная ишемия вызывает активацию каспазы-3 и апоптотического фактора Bad. Нейропротективные свойства на модели ишемии ростовых факторов, таких как, IGF-1 (инсулиновый фактор роста), VEGF (эндотелиальный фактор роста сосудов), GDNF (фактор роста глии), NGF (фактор роста нервов) осуществляются во многом за счет снижения экспрессий каспазы-1, 3, проапоптотических белков Bax и Bad и активации антиапоптотических белков bcl-xL и bcl-2. Вводимый внутривенно фактор роста фибробластов (bFGF) снижал фрагментацию ДНК и предупреждал подавления экспрессии bcl-2 при ишемии, при этом, его протективное действие выражено, главным образом, в пенумбре. Одновременно с этим, фактор роста фибробластов 2 (FGF2) ингибирует формирование дендритов в гиппокампальных прогениторных клетках, нарушая консолидацию памяти.
Инсулиноподобный ростовой фактор защищает проолигодендробласты от глутаматной эксайтотоксичности, блокируя апоптотический каскад (каспазу-9 и каспазу-3). На пилокарпиновой модели тонико-клонических судорог в первые 24 часов обнаруживается увеличение BrdU-позитивных клеток. Этим изменениям предшествовала экспрессия NGF, BDNF, HB-EGF, FGF-2, но не экспрессия NT-3. На модели электроконвульсивных судорог выявлена повышенная экспрессия VEGF, bFGF, BDNFв структурах хороидного сплетения.
Антиишемический протективный механизм BDNF осуществляется за счет торможения активности кальцийнейрина и активации сопряженного с нейротрофином белка CREB в гиппокампальных нейронах поля СА1, подверженных апоптозу. BDNF контролирует баланс глутаматергической и ГАМК-ергической систем. В эксперименте на животных установлено, что содержание BDNF в гиппокампе и фронтальной коре ишемизированной стороны мозга было выше в сравнение с контралатеральной областью. Уже через 6 часов после окклюзии уровень мРНK BDNF повышался на 80% в гранулярной зоне гиппокампа. (Schmidt-Kastner et al., 2001). Внутривенное введение BDNF конъюгированного с моноклональными антителами к трансферриновому белку гематоэнцефалического барьера защищало мозг от ишемического повреждения на модели окклюзии сонной артерии (Pardridge et al., 2002). Установлено, что возбуждающие стимулы, действующие через Са- и глутаматные NMDA – рецепторы стимулируют преобразование прогениторных клеток в сторону нейрональной дифференцировки и тормозит глиальную. Некоторые авторы связывают этот механизм с организацией физиологической памяти (Deisseroth Singla S. et al., 2004). В культуре прогениторных клеток гиппокампа блокада мю- и дельта-опиоидных рецепторов снижала пролиферацию, но увеличивала нейрогенез прогенеиторных клеток гиппокампа. Так, налоксон при длительной инкубации в культуре в три раза стимулировал нейрогенез и значительно уменьшал глиогенез. Глиальный нейротрофический фактор (GDNF) приводит к увеличению BrdU-позитивных клеток в зонах гиппокампа и черной субстанции, которые обнаруживали также тирозингидроксилазную метку (Chen, Ai et all., 2005). Инфузия в желудочки мозга мышей реснитчатого нейротрофичского фактора (CNTF) выявила стимуляцию нейрогенеза преимущественно в зубчатой извилине гиппокампа, но ограничило дифференцировку астроцитов и олигодендроцитов. В субвентрикулярной зоне эффект был выражен минимально.
Ингибирование пролиферации клеток антимитотическим агентом, метилзоксиметанол ацетатом (МАМ), ведет к повреждению обучения в гиппокамп-опосредованных задачах. (Shors et al., 2001). Гепарин связанный эпидермальный фактор роста HB-EGF улучшает клеточную пролиферацию в культуре нейрональных клеток мозга мышей через фосфорилирование Akt и ERK пути (Jin et al., 2005). В экспериментах на обезьянах с транзиторной ишемией мозга увеличивается число BrdU-позитивных клеток, экспрессирующих маркеры нейронов в первые 2-96 часов вблизи вновь образующихся кровеносных сосудов зубчатой извилины гиппокампа (кроме слоя СА1). Ультростуктурный анализ показал, что большинство прогениторных клеток и микроглия возникали из перицитов капилляров и/или адвентицилиальных клеток артериол. Такая структурная близость подразумевает общие регуляторные факторы, среди которых эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF). VEGF, инъецированный в латеральный желудочек мозга в дозе, не вызывающий пролиферацию эндотелия и изменения проницаемости сосудов, усиливал нейрогенез в стенке желудочков мозга, гиппокампе и ольфакторной зоне (Schanzer et all., 2004). С помощью метода направленной доставки ген VEGF вводили в гиппокамп взрослых крыс. Были получено двукратное увеличение нейрогенеза, а также улучшение когнитивных функций животных. В противоположность этому стимулированная экспрессия плацентарного ростового фактора (PIGF) обнаруживала обратные эффекты: нейрогенез и физиологические показатели обучения резко снижались. Интрацеребральная инъекция VEGF на фоне окклюзии церебральной артерии на 90 минут увеличивала выживаемость «молодых» нейронов в зубчатой фасции и субвентрикулярной зоне, а также стимулировала ангиогенез в ишемизированной пенумбре стриатума.
Изучение эффектов ампассе на модели массивной кортикальной ишемии
Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что ампассе обладает отчетливым позитивным эффектом на экспериментальной модели БА, при дефиците холинергической системы, вызванном субхроническим введением М холиноблокатора скополамина. Cкополамин, вызывает в эксперименте нарушения памяти, сходные с тем, которые наблюдаются при БА (Camps, Munosorrero, 2002; Voronina, 1994). Дефект холинергической нейропередачи является одним из ключевых звеньев патогенеза как старения, так и БА, в связи с чем активность препаратов в условиях данной модели рассматривается как прогностический признак их эффективности при БА и старении. Позитивный эффект ампассе (40 мг/кг/день/10 дней в/б) на экспериментальной модели БА характеризуется, прежде всего, существенным улучшением процессов обучения и памяти. При обучении УРАИ под влиянием ампассе наблюдали увеличение числа животных, достигших критерия обученности. Так, если после введения скополамина этот показатель снижался до 20%, то после введения ампассе доля обученных животных увеличивалась до 77%. Под влиянием ампассе увеличивалось общее количество правильно выполняемых условных реакций в течение всего периода обучения. В условиях моделирования холинергического дефицита ампассе позитивно влиял на обучение и память на модели выработки УРПИ, увеличивая количество животных помнящих об «опасной» камере.
Статистически значимый позитивный эффект ампассе оказывал на повышенную эмоциональность животных, снижая уровень тревожности. Так, при регистрации поведения животных в условиях приподнятого крестообразного лабиринта ампассе улучшал основной показатель поведения крыс – время, проведенное в «открытых» рукавах, а в условиях «открытого поля» - улучшал ориентировочно - исследовательское поведение по показателю обследования отверстий.
Положительный эффект ампассе отмечали и в отношении нарушенного после применения скополамина неврологического статуса. И хотя регистрируемые значения носили характер статистической тенденции, ампассе сокращал количество крыс с легким неврологическим дефицитом.
Таким образом, ампассе обладает способностью восстанавливать нарушенные когнитивные функции, улучшать эмоциональное состояние, ослаблять тревожность на модели БА при дефиците холинергической системы. Пирацетам в этих условиях обладал слабым, практически не регистрируемым эффектом.
Изучение эффектов ампассе на тремор, вызванный холиномиметиком ареколином Так как в поведенческих экспериментах на модели ускоренного старения, вызванного длительным (20-дневным) введением м-холиноблокатора скополамина, ампассе устраняет когнитивный дефицит, то представлялось целесообразным изучить возможный холинопозитивный механизм антиамнестического действия препарата. Для изучения возможных холиномиметических свойств ампассе использовали м-холиномиметик ареколин.
В результате исследований показано, что ареколин в дозе 25 мг/кг вызывает тремор уже через 20 секунд, длительность которого составляет 14-21 минут. Ампассе во всех изученных дозах (0,1; 10; 30 мг/кг) не обладал способностью ослаблять или потенцировать продолжительность и время наступления тремора, вызванного ареколином (Таблица 12).
Таким образом, ампассе в дозах от 0,1 до 30 мг/кг не изменяет время наступления и продолжительность тремора, вызванного холиномиметиком ареколином. Полученные результаты позволяют заключить, что в механизме антиамнестического эффекта ампассе, выявляемого на модели холинергического дефицита, нет прямых холиномиметических свойств.
Целью настоящего исследования явилось изучение действия ампассе на процесс нейродегенерации, вызванный алкоголизацией животных, вызванной введением этанола.
Изучение влияния ампассе на вызванный этанолом неврологический дефицит Установлено, что этанол в дозе 2 г/кг достоверно уменьшал (в 5,6 раза) время удерживания крыс на вращающемся стержне, что характеризуется как нарушение координации движений и свидетельствует о выраженном неврологическом дефиците (Таблица 13).
Ампассе в дозе 10 и 20 мг/кг и мексидол в дозе 100 мг/кг при однократном в/б введении не вызывают нарушения координации движения у крыс в тесте вращающегося стержня (Таблица 13).
Ампассе в дозах 10 и 20 мг/кг существенно ослаблял проявления неврологического дефицита, вызванного этанолом, уменьшая количество падений животных с вращающегося стержня. Под влиянием ампассе в дозе 10 мг/кг время удерживания на вращающемся стержне достоверно увеличивалось в 4,2 раза, а с увеличением дозы до 20 мг/кг увеличилось в 3,0 раза по сравнению с контрольными животными, получившие этанол (Таблица 13).
Мексидол в дозе 100 мг/кг у крыс, получивших этанол, достоверно увеличивал (в 3,8 раза) время удерживания животных на вращающемся стержне по сравнению с контролем при введении одного этанола (Таблица 13).
По способности устранять неврологические нарушения, вызванные этанолом в тесте вращающегося стержня, ампассе в дозе 10 мг/кг имеет сходную эффективность с мексидолом в дозе 100 мг/кг.
Изучение влияния длительного введения ампассе на поведение крыс в тесте открытого поля
На модели естественного старения, в опытах на старых 24-х месячных крысах, ампассе проявил выраженные геропротекторные эффекты, улучшая процессы обучения и памяти при выработке УРПИ и ослабляя моторные нарушения, вызванные неврологическими проявлениями старых животных. В данном исследовании на старых 24-х месячных крысах условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ) воспроизводили только 30% животных, остальные заходили в темную «опасную» камеру с коротким латентным периодом. В тоже время, молодые половозрелые крысы (3-х месячного возраста) при воспроизведении рефлекса через 24 часа после обучения в 80% случаев помнили об «опасной» камере и не заходили в темную камеру. Это свидетельствует о развившемся когнитивном дефиците у крыс в процессе естественного старения. При введении ампассе в дозе 20 мг/кг в течение 2-х месяцев старым животным, наблюдалось увеличение количества крыс помнящих о полученном во время обучения опыте, что составило 64%. Отчетливым эффектом обладал и препарат сравнения мексидол, увеличивая число крыс воспроизводивших рефлекс до 50 %. Вместе с когнитивным дефицитом у старых животных наблюдался неврологический дефицит, регистрируемый в условиях обучения моторному навыку. Только 25% старых крыс приобретали этот навык начиная с 11-й по 15-ю попытки, тогда как молодые животные обучались моторному навыку в 100 % случаев уже с 5-ой попытке. Это свидетельствует о наличии когнитивного и неврологического дефицитов у старых крыс и ослаблении их способности приобретать моторные навыки. Ампассе в дозе 20 мг/кг статистически достоверно ускорил приобретение моторного навыка у старых животных и увеличил число крыс воспроизводивших его до 66 %. Тогда как, мексидол в дозе 150 мг/кг был менее эффективен, что выражалось в увеличении количества обучившихся моторному навыку животных с естественным старением лишь до 50 %.
Наличие положительного влияние ампассе на когнитивные функции у модельных животных с холинергическим дефицитом обусловило поиск холинпозитивных свойств препарата. Исследование влияния ампассе на холинергическую систему (в тесте с ареколином) не обнаружило прямых холиномиметических свойств. В эксперименте, м-холиномиметик ареколин в дозе 25 мг/кг вызывает тремор у животных, обусловленный увеличением высвобождения ацетилхолина, который снижается через 10-20 минут после его введения. В тесте ареколин-индуцированного тремора у контрольных животных через 20 секунд после введения ареколина наблюдался продолжительный тремор, длительностью 14,21 минут. Ампассе в диапазоне доз от 0,1 до 30 мг/кг не изменял время наступления и продолжительность тремора, вызванного ареколином, что подтверждает отсутствие холинпозитивного компанента в механизме действия препарата.
Таким образом, ампассе проявляет отчетливые нейропротективные эффекты у животных с дефицитом холинергической системы, устраняя когнитивные и неврологические нарушения крыс с естественным и ускоренным старением по типу болезни Альцгеймера. Механизм мнемотропных и нейропротективных эффектов ампассе на данных моделях осуществляется по средством модуляции AMPA-рецепторов, увеличением количества и активации NMDA-рецепторов, но не прямым холиномиметическим действием.
Следующим этапом изучения нейропротективных свойств ампассе было изучение его антиалкогольных свойств. Этанол при однократном введении приводит к интенсивному выбросу из депо нейромедиаторов группы катехоламинов – дофамина и норадреналина. Это сопровождается ростом их концентраций в крови и соответственно последующим снижением в структурах головного мозга (Лелевич С. В., 2010). Резкий выброс дофамина обуславливает увеличение двигательной активности животных в эксперименте после однократного введения этанола. Таким образом, однократное введение токсических доз этанола 2 г/кг у контрольных крыс вызвало нарушения ориентировочно-исследовательского поведения, регистрируемое по снижению числа обследованных отверстий и вертикальных перемещений. Также, этанол усиливал двигательную активность крыс, увеличивая число горизонтальных перемещений относительно показателей интактного контроля. В тесте вращающего стержня этанол в дозе 2 г/кг достоверно уменьшал (в 5,6 раза) время удерживания крыс на вращающемся стержне, что характеризуется, как нарушение координации движений и свидетельствует о 102 выраженном неврологическом дефиците. Изменение ориентировочно-исследовательского поведения и выраженный моторный дефицит коррелируют с когнитивным дефицитом, проявляющимся в нарушении воспроизведения УРПИ через 24 часа после обучения. Результаты исследования антиалкогольных эффектов ампассе позволяют заключить, что препарат в дозах 10 и 20 мг/кг ослабляет проявления неврологического дефицита, вызванного токсическими дозами этанола в тесте вращающегося стержня, достоверно увеличивая время удерживания крыс на вращающемся стержне и когнитивного дефицита, устраняя амнезию условного рефлекса пассивного избегания. В тесте вращающегося стержня более выраженный эффект ампассе оказывает в дозе 10 мг/кг, тогда как антиамнестический эффект усиливается с повышением дозы до 20 мг/кг. В тесте открытого поля ампассе только в дозе 10 мг/кг обладает выраженным антиалкогольным эффектом, достоверно ослабляя нарушения ориентировочно-исследовательского поведения, вызываемые этанолом. Но, препарат в этой дозе усиливал этанол индуцированную двигательную активность, регистрируемую по статистически достоверному увеличению горизонтальных перемещений. Предполагаемый механизм данной активации обусловлен дофаминпозитивным действием препарата, о чем могут свидетельствовать ранее проведенные исследования нооглютила на изменения дофаминергической системы (Трофимов С.С., 1992; Ковалев Г. И., 1993; Воронина Т.А., 2002). Однако, при повышении дозы ампассе до 20 мг/кг его антиалкогольный эффект, регистрируемый в открытом поле, исчезает. По выраженности антиалкогольного эффекта, оцениваемого по восстановлению нарушенного этанолом моторного и ориентировочно-исследовательского поведения животных, ампассе в дозе 10 мг/кг имеет сходную активность с мексидолом в дозе 50 мг/кг, а по антиамнестической активности ампассе в дозе 20 мг/кг не уступает мексидолу в дозе 100 мг/кг.
Таким образом, на всех экспериментальных моделях нейродегенерации данного исследования ампассе проявлял нейропротективные свойства, способствуя выживанию животных, устраняя развитие неврологических и когнитивных дефицитов.
Ранние исследования нооглютила, кальциевой ампассею которого является ампассе, выявили умеренное антигипоксическое действие, проявляющиеся в способности предупреждать нарушение процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях мозга в острый период черепно-мозговой травмы и уменьшать потребность нейронов в кислороде (Одинак М.М., 2001). Наличие антигипокчических свойств у препаратов является прогностическим признаком ноотропных и нейропротективных эффектов.
![Исследование антиаритмической активности производного 4-нитро-n-[1-фенил-5-(диэтиламино) пентил] бензамида (экспериментальное исследование)](/i/i/5047/650993.png "Исследование антиаритмической активности производного 4-нитро-n-[1-фенил-5-(диэтиламино) пентил] бензамида (экспериментальное исследование) Сингх Лариса Николаевна")
