Введение к работе
Актуальность. Увеличение продолжительности жизни в экономически развитых странах сопровождается ростом распространенности нейродегенеративных заболеваний, таких как цереброваскулярные нарушения, болезнь Альцгеймера (БА) и болезнь Паркинсона (БП). Цереброваскулярные нарушения занимают одно из ведущих мест в мире по заболеваемости, инвалидизации и смертности [Суслина З.А., Пирадов М.А., 2008]. Общемировая заболеваемость БА на 2006 год оценивалась в 26,6 миллионов человек, а к 2050 году по прогнозам число больных может вырасти вчетверо [Brookmeyer R. et al., 2007]. БП встречается примерно у 1% людей старше 60 лет и у 4% людей старше 80 лет [Dexter D.T., Jenner P., 2013]. Фармакотерапия нейродегенеративных заболеваний в настоящее время является симптоматической и не способна обеспечивать длительную нейропротекцию [Dunkel P. et al., 2012]. Поэтому актуальным направлением фармакологии является поиск новых эффективных нейропротективных лекарственных средств. В последние годы много внимания уделяется разработке терапевтических стратегий на основе фактора роста нервов (nerve growth factor, NGF) – регуляторного белка, участвующего в росте, дифференцировке и поддержании жизнедеятельности нейронов центральной и периферической нервной системы. Показано, что БП и БА сопровождаются снижением содержания NGF в областях мозга, наиболее уязвимых при данной патологии [Calissano P. et al., 2010; Mogi M., 1999]. На экспериментальных моделях было показано, что при ишемии головного мозга содержание NGF также снижается в поврежденных участках [ T.H. 1998], однако в первые несколько часов после начала ишемии экспрессия мРНК NGF, а также концентрация самого белка многократно возрастает, что, как полагают, свидетельствует о его роли в защите нейронов от гибели [ 2011]. В клиническом исследовании была установлена достоверная обратная зависимость между размерами сформированного к 5-7-м суткам после инсульта очага повреждения и уровнем NGF в спинномозговой жидкости в 1-е сутки [Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001]. Эффективность NGF при внутримозговом введении была продемонстрирована на моделях БА [Allen S. J. et al., 2011; Gu H. et al., 2009; Winkler J., Thail L.J., 1995]; БП [Chaturvedi R.K. et. al., 2006], а также на различных моделях ишемии головного мозга [ 2011; Zhu W., 2011]. В настоящее время известно, что трофические свойства NGF распространяются не только на нейроны центральной и периферической нервной системы, но и на клетки некоторых других систем и органов, в частности эндокринной системы [Aloe L. et al., 2012]. NGF играет важную роль в поддержании функционирования и защите от повреждающих факторов -клеток поджелудочной железы [Polak M. et al., 1993], с дегенерацией которых связано развитие сахарного диабета (СД) 1-го типа. Кроме того, NGF стимулирует секрецию инсулина -клетками [Rosenbaum T. et al., 2001], что определяет его возможный потенциал для лечения СД 2-го типа. Стимуляция синтеза NGF у крыс c экспериментальным СД предотвращает гибель -клеток и оказывает антигипергликемический эффект [Gezginci-Oktayoglu S., Bolkent S., 2012]. Однако, попытки применения NGF в клинике были неуспешными. Это связано с неудовлетворительными фармакокинетическими свойствами данного белка, его слабой способностью проникать через биологические барьеры, а также с серьезными побочными эффектами, основные из которых – гиперальгезия и катастрофическая потеря веса. Возможным путем преодоления недостатков NGF является создание системно-активных низкомолекулярных миметиков данного нейротрофина, которые воспроизводили бы его терапевтические эффекты и не обладали бы побочными эффектами. Описанные на настоящий момент в литературе миметики NGF не отвечают этим критериям. В ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН был сконструирован и синтезирован димерный дипептидный миметик 4-й петли NGF, получивший шифр ГК-2 [Середенин С.Б., Гудашева Т.А., 2010]. ГК-2 продемонстрировал высокую нейропротективную активность в концентрациях 10-5-10-9M на различных клеточных моделях, при этом он не обладал дифференцирующей активностью [Антипова Т.А. и др., 2010]. Было также показано, что ГК-2 вызывает фосфорилирование специфических рецепторов TrkA и активирует PI3K/Akt сигнальный путь, отвечающий за нейропротективные эффекты, не активируя MAPK путь, ответственный в основном за дифференцирующую активность NGF [Gudasheva T. et al., 2013].
Цель работы. Выявление фармакологических эффектов оригинального миметика фактора роста нервов ГК-2 на in vivo моделях ряда заболеваний, в патогенез которых вовлечен нейротрофин NGF.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.
-
Выявление фармакологических эффектов ГК-2 на моделях болезни Паркинсона (галоперидоловой каталепсии; апоморфиновой стереотипии; паркинсонического синдрома, индуцированного резерпином или МФТП или 6-OHDA).
-
Выявление фармакологических эффектов ГК-2 на моделях болезни Альцгеймера (септо-гиппокампальной перерезки; стрептозотоциновой модели; холинергического дефицита, вызванного длительным введением скополамина).
-
Выявление фармакологических эффектов ГК-2 на модели неполной глобальной ишемии, вызванной необратимой двусторонней окклюзией сонных артерий.
-
Выявление фармакологических эффектов ГК-2 на модели сахарного диабета, индуцированного стрептозотоцином.
Научная новизна. Впервые для низкомолекулярных миметиков фактора роста нервов выявлены антипаркинсоническая и антидиабетическая активности. Впервые показано, что низкомолекулярный миметик NGF, сконструированный на основе бета-изгиба 4-й петли NGF, активирующий TrkA-рецепторы и сигнальный Akt-киназный, но не МАР-киназный путь, обладает фармакотерапевтическими эффектами полноразмерного белка на in vivo моделях болезни Паркинсона, Альцгеймера, сахарного диабета, ишемии мозга. Установлено, что дипептид ГК-2 на моделях паркинсонического синдрома (ПС) при однократном внутрибрюшинном введении за 24 ч до повреждающего воздействия снижает интенсивность галоперидоловой каталепсии, потенцирует апоморфиновую стереотипию, корректирует экстрапирамидные нарушения на моделях ПС, индуцированного резерпином или МФТП. При хроническом введении после нейротоксинов ГК-2 практически полностью предотвращает моторные нарушения на моделях ПС, вызванного 6-OHDA или МФТП. Выявлены положительные когнитотропные эффекты ГК-2 при его хроническом в/б введении на моделях болезни Альцгеймера (перерезка септо-гиппокампального пути, введение стрептозотоцина в желудочки мозга, холинергический дефицит, вызванный скополамином). Показано, что дипептид ГК-2 снижает выраженность когнитивных нарушений и оказывает нейропротективное действие при хроническом введении на модели неполной глобальной ишемии, индуцированной двусторонней необратимой окклюзией сонных артерий. Установлено, что ГК-2 при курсовом хроническом введении на модели стептозотоцинового диабета оказывает выраженное антигипергликемическое действие и препятствует снижению массы тела.
Практическая значимость работы. Выявленные in vivo на батарее валидированных поведенческих тестов нейропротективная, антипаркинсоническая, положительная когнитотропная и антидиабетическая активности дипептидного миметика NGF ГК-2 определяют его фармакотерапевтический потенциал и перспективы дальнейшего углубленного доклинического изучения. Показано, что дипептидный миметик NGF ГК-2 активен в широком диапазоне доз (0,01-5мг/кг) при внутрибрюшинном введении и сохраняет активность при пероральном введении, что важно для потенциального средства терапии хронических заболеваний. Дипептид ГК-2 обладает активностью как при превентивном, так и при лечебном его использовании. Показано, что, в отличие от NGF, дипептид ГК-2 при хроническом введении не вызывает снижения массы тела, то есть он лишен одного из основных побочных эффектов полноразмерного белка.
Положения, выносимые на защиту.
-
Пептидный миметик NGF ГК-2 проявляет антипаркинсонические свойства на ряде моделей паркинсонического синдрома в широком диапазоне доз при внутрибрюшинном введении; активность ГК-2 сохраняется и при пероральном введении.
-
ГК-2 проявляет положительные когнитотропные свойства на моделях болезни Альцгеймера.
-
ГК-2 корректирует когнитивные нарушения и проявляет нейропротективную активность на модели неполной глобальной ишемии.
-
ГК-2 оказывает выраженное антигипергликемическое действие и препятствует снижению массы тела крыс на модели стрептозотоцинового диабета.
-
Полученные данные свидетельствуют о целесообразности дальнейшей разработки дипептидного миметика NGF ГК-2 в качестве системно активного препарата, потенциально эффективного для терапии заболеваний, в патогенез которых вовлечен NGF, и, вероятно, не обладающего побочными эффектами целого белка.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 4-м Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Московская область, 2010), 16-м Всемирном конгрессе по вопросам общей и клинической фармакологии (Копенгаген, 2010), 11-м Региональном Конгрессе Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Санкт-Петербург, 2011), 19-м Всемирном конгрессе по болезни Паркинсона и сопутствующим расстройствам (Шанхай, 2011), 4-м съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012); 23-м Американском пептидном симпозиуме (Гаваи, 2013), Всероссийской научной конференции с международным участием «Фармакологическая нейропротекция» (Санкт-Петербург, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 4 статьи - в центральных рецензируемых научных журналах и 12 тезисов — в материалах российских и международных конференций.
Личный вклад. Автор работы является основным исполнителем проведенного исследования на всех этапах: анализе данных литературы по теме диссертационной работы, проведении экспериментальной части исследования и анализе полученных результатов, проведении статистической обработки, формулировании выводов. При активном участии автора подготовлены публикации по результатам работы.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 353 источника. Работа изложена на 156 страницах компьютерного текста, содержит 37 рисунков и 16 таблиц.
