Введение к работе
Актуальность исследования. В настоящее время с увеличением продолжительности жизни населения, ухудшением экологической обстановки отмечается рост больных с патологиями, сопровождающимися нейродегенеративными процессами, такими как болезнь Альцгеймера (БА), различные деменции, инсульты, тяжелые депрессивные расстройства и др. Прогресс в определении механизмов нейродегенеративных заболеваний способствует расширению сфер поиска новых эффективных лекарственных средств. Один из актуальных подходов к созданию препаратов с нейропсихотропной активностью базируется на современных представлениях о механизмах эндогенного регулирования функций нейронов и их регенерации.
Среди известных эндогенных белков, осуществляющих передачу сигналов между различными клетками организма, в неврологии особое внимание уделяется факторам роста нервной ткани (ФРНТ), включающим следующие подсемейства: нейротрофины (фактор роста нервов - NGF, мозговой нейротрофический фактор - BDNF и др.), семейство глиального нейротрофического фактора (GDNF, артемин и др.), нейропоэтические цитокины (в частности, цилиарный нейротрофический фактор - CNTF) и другие факторы роста (например, эритропоэтин - ЭПО) (Reichardt L.F., 2001). Регуляция функций нейротрофинов в мозге рассматривается как один из перспективных путей воздействия на ряд патологических состояний центральной нервной системы.
Нейротрофин BDNF широко представлен в структурах мозга и осуществляет регуляцию различных физиологических процессов ЦНС в как в норме, так и при патологии: обладает антиапоптотическими свойствами (Bonni A. et al., 1999), участвует в нейрогенезе (Scharfman H. et al., 2005) и обеспечении синаптической пластичности (Bekinschtein P. et al., 2008). В экспериментальных и клинических исследованиях показано, что содержание BDNF в мозге значительно увеличивается при ишемическом инсульте (Bejot Y. et al., 2011), что связывают с его активным участием в обеспечении пластичности после повреждения (Ploughman M. et al., 2009). Высказаны «нейротрофиновые теории» развития болезни Альцгеймера и тяжелых депрессивных расстройств основанные на снижении BDNF в мозге и сыворотке крови (Castren E. et al., 2007; Duman R.S. et al., 2006). Показано, что введение BDNF непосредственно в структуры мозга животным на моделях ишемического инсульта (Tsukahara T. et al., 1994), БА (Nagahara A.H. et al., 2009) или депрессии (Chen B. et al., 2001; Shirayama J. et al., 2002), приводит к коррекции состояния и поведения животных. Кроме того, известно, что BDNF контролирует физиологические функции нейромедиаторных систем: глутаматэргической (Caldeira M.V. et al., 2007), ГАМК-эргической (Guo S. et al., 2008), серотонинергической (Vaidya V.A. et al., 1997). Вместе с тем, терапевтическое использование самого BDNF ограничивается его нестабильностью в биологических жидкостях, плохой способностью проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), возможностью иммунной реакции, наличием побочных эффектов за счет его плейотропности.
Актуальным подходом к регуляции системы ФРНТ в ЦНС, в частности BDNF, является создание (конструирование и синтез) низкомолекулярных миметиков рецепторов к цитокинам, например, TrkB рецепторов BDNF (Longo F.M. et al., 2007; Massa S.M. et al., 2010; Гудашева Т.А. и др., 2012, 2013), или использование, известного цитокина, усиливающего экспрессию BDNF. Таким веществом может являться эритропоэтин (ЭПО). Этот гемопоэтический ростовой фактор, обладая способностью угнетать апоптоз клеток-предшественников эритроцитов и стимулировать их пролиферацию и дифференцировку, в виде рекомбинантного эритропоэтин человека (РЭЧ) успешно используется в клинической практике для лечения анемий различного генеза. Помимо влияния на эритропоэз, ЭПО обладает широким спектром защитных функций. Показано, что при различных повреждениях ЦНС наблюдается активный синтез астроцитами эритропоэтина, который оказывает нейропротективное действие (M. Buemi E. et al., 2002), ингибируя апоптоз, стимулируя пролиферацию нейронов и ангиогенез. В последнее десятилетие стало известно, что ЭПО вызывает индукцию экспрессии генов нейротрофинов BDNF и NGF в различных структурах мозга, тем самым также способствуя дифференцировке и поддержанию жизнеспособности периферических и центральных нейронов (Viviani B. et al., 2005; Zhang F. et al., 2006). В экспериментальных и клинических исследованиях показано, что РЭЧ эффективен при ишемическом инсульте (Ehrenreich H. et al., 2002; Ehrenreich H. et al., 2009), геморрагическом инсульте (Tseng M.Y. et al., 2009; J. Turner A. et al., 2010), травмах головного мозга (Talving P. et al., 2010). Вместе с тем эффект нативного РЭЧ, как нейропротектора, выявляется только в очень высоких дозах, вызывающих ряд побочных эффектов (кроветворение и антителообразование). Для РЭЧ выделена изоформа с меньшим содержанием сиаловых кислот (низкосиалированный РЭЧ, нсРЭЧ), являющаяся аналогом т.н. «мозгового» эритропоэтина (NeuroEPO). Известно, что включение веществ в наночастицы может существенно изменять профиль их распределения (Воронина Т.А. и др., 2008; Гельперина С.Э. и др., 2009; Wohlfart S. et al., 2012), и это показано в т.ч. и для РЭЧ (Солев И.Н. и др., 2011). Для доставки белков и пептидов в мозг, особый интерес представляют полимерные наночастицы на основе полилактидной-ко-гликолевой кислоты (poly(lactic-co-glycolic) acid, PLGA) c модифицированной поверхностью.
В ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН в течение нескольких десятилетий проводится работа по созданию и изучению механизмов действия нейропсихотропных лекарственных препаратов, в частности, с нейропротективной активностью (Воронина Т.А., 2006; Середенин С.Б., Воронина Т.А., 2007; Гарибова Т.Л. и др., 2008; Островская Р.У., Гудашева Т.А., 2009; Ковалев Г.И. и др., 2009; Мирзоян Р.С. и др., 2011; Жердев В.П. и др., 2012). В отделе химии института сконструирован и синтезирован новый низкомолекулярный миметик BDNF - гексаметилендиамид бис(N-моносукцинил-L-серил-L-лизина), ГСБ-106. По своей последовательности, его дипептидный фрагмент совпадает с центральными участками бета-изгиба 4-й петли BDNF, а ацильные группы представляют собой биоизостеры предшествующих этим участкам аминокислотных остатков. Показана способность димерного замещенного дипептида ГСБ-106 избирательно приводить к фосфорилированию TrkB рецептора (Гудашева Т.А. и др., 2012, 2013).
Цель исследования. Изучить нейропсихотропные свойства дипептида ГСБ-106, активирующего рецепторную систему BDNF и гликопротеида ЭПО в наносомальной форме, стимулирующего синтез BDNF.
Основные задачи исследования.
-
Исследовать нейропротективную активность димерного замещенного дипептида ГСБ-106: на моделях геморрагического инсульта и болезни Альцгеймера.
-
Изучить антидепрессивный эффект ГСБ-106 на моделях депрессивноподобного состояния.
-
Изучить антиамнестический и противогипоксический эффекты ГСБ-106.
-
Исследовать наночастицы для транспорта эритропоэтина через ГЭБ на различных типах полимеров, определить физико-химические характеристики наносомального эритропоэтина.
-
Исследовать нейропротективную активность нсРЭЧ на PLGA наночастицах на моделях геморрагического инсульта и болезни Альцгеймера в сравнении с нативным нсРЭЧ.
-
Изучить влияние нсРЭЧ на PLGA наночастицах на кроветворение в сравнении с нативным РЭЧ.
Научная новизна. Выявлены нейропсихотропные свойства веществ, воздействующих на систему BDNF. Показано, что гексаметилендиамид бис(N-моносукцинил-L-серил-L-лизина), ГСБ-106 при внутрибрюшинном введении в опытах на крысах обладает нейропротективными свойствами на модели геморрагического инсульта (ГИ), вызванного интрацеребральной посттравматической гематомой (ИПГ) и модели болезни Альцгеймера, вызванной интрацеребровентрикулярным введением амилоида-(25-35). Установлено, что у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой ГСБ-106 уменьшает гибель животных, ослабляет неврологический дефицит, нормализует ориентировочно-исследовательское поведение. На модели болезни Альцгеймера, у крыс с амилоидом-(25-35) ГСБ-106 корректирует нарушения долгосрочной пространственной памяти в водном лабиринте Морриса. У соединения ГСБ-106 впервые выявлен антиамнестический эффект на модели амнезии условной реакции пассивного избегания (УРПИ), вызванной максимальным электрошоком (МЭШ), и противогипоксические свойства на моделях гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме и гемической гипоксии, вызванной нитритом натрия. В опытах на беспородных мышах-самцах на моделях иммобилизационного стресса (тесты вынужденного плавания по Porsolt и подвешивания за хвост по Steru) ГСБ-106 оказывает антидепрессивное действие.
Для доставки ЭПО в мозг получена новая наносомальная форма нсРЭЧ на полилактид-ко-гликолидных наночастицах с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА), способная в отличие от нативного нсРЭЧ преодолевать ГЭБ и оказывать нейропротективное действие. На модели геморрагического инсульта нсРЭЧ на PLGA НЧ корректирует состояние, поведение и память у крыс с ИПГ, а на модели болезни Альцгеймера нсРЭЧ на PLGA НЧ ослабляет нарушения долгосрочной пространственной памяти в водном лабиринте Морриса. Методами морфометрии и магнитно-резонансной томографии (МРТ) показана способность нсРЭЧ на PLGA НЧ уменьшать зону повреждения мозга у крыс с ИПГ. В отличие от препарата РЭЧ (Эральфон 5000 МЕ/кг), у нсРЭЧ включенного в PLGA НЧ в эквивалентной дозе не выявлено влияния на эритропоэз.
Научно-практическая значимость. Полученные результаты о способности замещенного димерного дипептида ГСБ-106 проявлять нейропротективное действие, оказывать антидепрессивный, антиамнестический и противогипоксический эффекты, открывают перспективу дальнейшего исследования нейропсихотропных свойств данного соединения и возможность создания на его основе нового лекарственного средства. Разработанный состав наносомальной формы нсРЭЧ на основе PLGA, методология сорбции эритропоэтина и оценки физико-химических параметров полученного комплекса могут быть полезными при создании наносомальных лекарственных форм, позволяющих улучшать проницаемость через гематоэнцефалический барьер, сохраняя структуру биологически активных веществ. Выявленный нейропротективный эффект нсРЭЧ на PLGA наночастицах открывает перспективу фармакологической разработки наносомальных форм нсРЭЧ, как нейропротекторов.
Личный вклад автора. Автором самостоятельно выполнены все эксперименты, проведен анализ литературы по теме исследования, проанализированы результаты, проведена статистическая обработка результатов и описание полученных данных, сформулированы выводы. При непосредственном участии автора подготовлены публикации по результатам работы.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на III Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011), XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012), VII международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012), IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них: 6 статей опубликованы в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией, 5 тезисов опубликованы в материалах Всероссийских и международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела с описанием материалов и методов исследования, двух глав посвященных результатам исследования, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 181 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 таблицами и 43 рисунками. Библиографический указатель включает 24 отечественных и 531 иностранных источников.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Замещенный димерный дипептид [гексаметилендиамид бис(N-моносукцинил-L-серил-L-лизина), ГСБ-106] при внутрибрюшинном введении в опытах на крысах обладает нейропротективным действием на моделях геморрагического инсульта и болезни Альцгеймера.
-
ГСБ-106 при системном введении мышам проявляет отчетливый антидепрессивный эффект в тестах поведенческого отчаяния по Porsolt и подвешивания мышей за хвост по Steru.
-
ГСБ-106 обладает антиамнестическим эффектом на модели амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной максимальным электрошоком и проявляет противогипоксическое действие, продлевая жизнь мышей в условиях гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме и гемической гипоксии.
-
Среди пяти различных видов наночастиц на основе полилактидов с сорбированным на них низкосиалированным рекомбинантным эритропоэтином человека отобрана экспериментальная форма наночастиц на основе PLGA (Resomer 502Н) с 1% человеческим сывороточным альбумином, преодолевающая неповрежденный и поврежденный инсультом ГЭБ, и на модели интрацеребральной посттравматической гематомы показана её способность проникать в мозг.
-
Низкосиалированный рекомбинантный эритропоэтин человека на PLGA наночастицах обладает нейропротективным действием на модели геморрагического инсульта, вызванного интрацеребральной посттравматической гематомой, корректируя поведение и память крыс с ИПГ и уменьшая объем зоны мозга, поврежденной гематомой, а на модели болезни Альцгеймера улучшает пространственную память.
-
Низкосиалированный рекомбинантный эритропоэтин человека сорбированный на PLGA наночастицах, не влияет на процесс кроветворения у крыс при повторном 3-х дневном внутривенном или внутрибрюшинном введения в дозе 0,05 мг/кг, эквивалентной терапевтической (5000МЕ/кг) для рекомбинантного эритропоэтина человека.
