Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Основные термины 13
1.2 Современное состояние проблемы сепсиса
1.2.1 Данные статистики 14
1.2.2 Недостаточность современных подходов борьбы с сепсисом 16
1.2.3 Заключение 17
1.3 Молекулярные механизмы развития сепсиса 17
1.3.1 Факторы патогенности бактерий 19
1.3.1.1 Липополисахариды грамотрицательных бактерий 21
1.3.1.2 Липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий 25
1.3.1.3 Сравнение LPS и LTA 27
1.3.2 Рецепторы сепсиса 28
1.3.2.1 Липополисахарид-связывающий белок 28
1.3.2.2 CD14 29
1.3.2.3 TLR 31
1.3.2.4 MD-2 32
1.3.3 Медиаторы сепсиса 32
1.4 Физиологические проявления сепсиса 34
1.4.1 Влияние на сердечно-сосудистую систему 36
1.4.1.1 Оксид азота 39
1.4.2 Влияние на систему гемостаза 40
1.4.2.1 Гиперкоагуляция 42
1.4.2.2 Гипокоагуляция 43
1.4.2.3 Фибринолиз 43
1.4.2.4 Белки острой фазы. Фибриноген 45
1.4.3 Влияние на биохимические параметры крови 45
1.4.3.1 Ишемия тканей. Полиорганная недостаточность 45
1.4.3.2 Диагностика септических состояний 46
1.4.3.3 Альбумин 47
1.4.3.4 Глюкоза 48
1.4.3.5 Общий белок 49
1.4.3.6 Креатинин 50
1.4.3.7 Билирубин 51
1.4.3.8 ТАГ 51
1.5 Белки теплового шока 52
1.5.1 Общие сведения 52
1.5.2 Классификация и эволюция HSP 53
1.5.3 Особенности активации и экспрессии генов HSP 54
1.6 Семейство HSP70 55
1.6.1 Структура HSP70 55
1.6.2 Внутриклеточные функции HSP70 57
1.6.2.1 Участия в фолдинге, мисфолдинге и рефолдинге полипептидов... 58
1.6.3 Внеклеточные функции HSP70 59
1.6.3.1 HSP70 активирует неспецифический иммунитет 61
1.6.3.2 Роль HSP70 в патологических процессах 61
1.6.4 Защитная функция HSP70 62
1. 7 Заключение по обзору литературы 63
Глава 2. Материалы и методы исследований 64
2.1 Предмет исследования 64
2.2 Объект исследования 64
2.3 Методы исследования :
2.3.1 Хирургические процедуры: имплантация катетеров в сосуды 65
2.3.2 Катетерная технология мониторинга гемодинамики у бодрствующих животных
2.3.3 Коагуляционный анализ 68
2.3.4 Биохимический анализ 71
2.3.5 Выживаемость животных в эксперименте и терминальные процедуры
2.3.6 Статистический анализ данных 72
2.4 Протоколы исследования 73
2.4.1 Исследование защитных свойств rhHSP70 при введении после LPS на модели грамотрицательного сепсиса у крыс
2.4.2 Исследование защитных свойств rhHSP70 при введении перед LPS на модели рамотрицательного сепсиса у крыс
2.4.3 Исследование зависимости защитного действия от дозы rhHSP70 при введении перед LPS на модели грамотрицательного сепсиса у крыс...
2.4.4 Исследование защитных свойств rhHSP70 на модели грамположительного сепсиса
2.4.5 Исследование фармакологического действия rhHSP70 на здоровых крысах
2.4.6 Определение острой токсичности rhHSP70 79
Глава 3. Результаты и обсуждение 81
3.1 Результаты исследования защитных свойств rhHSP70 при введении после LPS на 81 модели грамотрицательного сепсиса у крыс
3.2 Результаты исследования защитных свойств rhHSP70 при введении перед LPS на 90 модели грамотрицательного сепсиса у крыс
3.3 Исследование зависимости защитных свойств rhHSP70 от дозы вводимого вещества на модели грамотрицательного сепсиса
3.4 Исследование защитных свойств rhHSP70 на модели грамположительного 102 сепсиса
3.5 Исследование фармакологического действия rhHSP70 на здоровых 109 крыс
3.6 Исследование острой токсичности rhHSP70 112
Заключение 117
Выводы 122
Список литературы 123
- Факторы патогенности бактерий
- Выживаемость животных в эксперименте и терминальные процедуры
- Исследование защитных свойств rhHSP70 на модели грамположительного сепсиса
- Исследование зависимости защитных свойств rhHSP70 от дозы вводимого вещества на модели грамотрицательного сепсиса
Введение к работе
Актуальность проблемы. Септический шок является главной причиной летальных исходов в палатах интенсивной терапии (Parrillo, 1993). Более того, прослеживается тенденция роста смертности пациентов от сепсиса (Friedman et al., 1998). Только в США ежегодно регистрируют сепсис примерно у 750 000 пациентов (Martin G. et al., 2003). При этом почти каждый третий такой случай заканчивается летальным исходом (Riedemann ct al., 2003).
Сепсис развивается при проникновении в системный кровоток больших количеств бактерий. Как известно, ведущим звеном патогенеза сепсиса являются структурные компоненты бактериальной клеточной стенки: молекулы тейхоевых и липотейхоевых кислот (lipoteichoic acid, LTA) - в случае грамположителышх бактерий, а также липополисахариды - в случае грамотрицательных бактерий (lipopolysaccharides, LPS).
Механизм действия LPS подробно изучен в экспериментах in vitro и in vivo. Они являются эндотоксинами и при проникновении в системный кровоток связываются с TLR-4 (Toll-like receptor) на поверхности моноцитов, нейтрофилов. Происходит секреция в кровоток больших количеств воспалительных цитокинов (ФНО-альфа, ИЛ-6, ИЛ-1 и др.) (Chow J. et al., 1996). В свою очередь, LTA являются супер-антигенами и способствуют гиперактивации иммунной системы (Drainga С. et al., 2008). В отличие от LPS механизм действия LTA связан с TLR-2 рецепторами, однако, в дальнейшем патологический процесс развивается сходным образом (Foumier В., Philpott D. 2005).
Таким образом, гиперцитокинемия, прямое токсическое воздействие на клетки эндотелия сосудов, а также нарушение агрегации тромбоцитов и определяют клиническую картину сепсиса. Установлено, что септический процесс сопровождается нарушениями гемодинамики, системы гемостаза и патологическими изменениями во внутренних органах (Karima R. et al., 1999). При этом наблюдается тахикардия и системная гипотензия (вплоть до шока).
Наиболее ярким клиническим проявлением сепсиса является синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС). При этом происходит неконтролируемое внутрисосудистое тромбооразование на фоне депрессии фибринолиза (Lin Н. et al., 1999; Грачев С. и др. 2003; Bhagat К. et al. 1996; Сидоркин В., Преснякова М. 2008). Необходимо отметить, что из-за нарушений микрососудистого кровотока развивается
недостаточность кровообращения и ишемия тканей, что приводит к дисфункции внутренних органов - полиорганной недостаточности (ПОН).
Высокая смертность от сепсиса пациентов в палатах интенсивной терапии свидетельствует об отсутствии в настоящее время в клинической медицине средств эффективной борьбы с этой патологией. Исследование принципиально новых подходов к профилактике и терапии септических состояний представляет огромный интерес, как для фундаментальной науки, так и для клинической медицины.
Одним из возможных путей борьбы с сепсисом являются белки теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (heat shock proteins 70, HSP70). Ранее считалось, что HSP70 являются универсальной защитой клетки от стрессовых воздействий и выполняют шаперонную функцию внутри клетки. В настоящее время предполагают, что HSP70 при различных стрессорных воздействиях выходят из тех клеток организма, где они повышенно экспрессируется, взаимодействуют с рецепторами на мембранах других клеток, могут поглощаться клетками, и в целом участвуют в стресс-реакции и оказывают защитное действие на организм. Известно также, что HSP70, подобно эндотоксинам, могут связываются с TLR-рецепторами (Asea A. et al., 2002). Следует отметить, что при этом такие экзогенные HSP70 способны стимулировать неспецифический иммунный ответ, и выполняют роль "сигнала опасности" для окружающих клеток (Johnson J., Fleshner М. 2006).
Экспериментально доказана корреляция между уровнем экспрессии HSP70 и выживаемостью грызунов при моделировании у них эндотоксинового шока (Hotchkiss R. et al., 1993). Известно также, что тепловое прекондиционирование, предшествующее эндотоксемии, увеличивает содержание HSP70 и уменьшает дисфункцию органов и смертность животных (Villar J. et al., 1994).
Ранее нами были получены данные о защитных свойствах смеси конститутивной и индуцибельной форм HSP70, выделенных из мышцы быка (Guzhova et al., 1998), которая вводилась внутривенно животным с экспериментальным сепсисом. Такое экзогенное введение HSP70 снижает токсическое действие LPS (Kustanova G. et al., 2006). Следующим этапом исследований в данном направлении явилось получение с помощью генно-инженерных методов рекомбинантного человеческого HSP70 (Евгеньев М.Б., 2007) для изучения его защитного действия при сепсисе с перспективой дальнейшего использования в клинической медицине.
Цель исследования. Изучить защитные свойства рекомбинантного человеческого белка теплового шока 70 кДа (rhHSP70) на модели экспериментального сепсиса у крыс.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить защитные свойства rhHSP70 на модели экспериментального грамотрицательного сепсиса при различных схемах введения. 2.Изучить зависимость защитного действия от дозы вводимого вещества. З.Изучить защитные свойства rhHSP70 на модели грамположительного сепсиса у крыс.
4.Исследовать фармакологическое действие rhHSP70 на здоровых крысах. 5.Определить острую токсичность rhHSP70.
Научная новизна работы. В исследовании показаны дозозависимые защитные эффекты rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг при профилактическом внутривенном введении крысам с моделируемым грамотрицательным сепсисом. Обнаружено, что предварительное внутривенное введение rhHSP70 снижает токсические эффекты LTA из S.aurens при экспериментальном сепсисе у крыс. Установлено, что rhHSP70 при внутривенном введении крысам в дозе 266 мкг/кг не оказывает заметного влияния на гемодинамику, систему гемостаза и биохимические показатели крови. Проведено токсикологическое исследование. Показано отсутствие токсических эффектов rhHSP70 при однократном внутривенном введении мышам в дозе (26,6 мг/кг), в 100 раз превышающей эффективную дозу (266 мкг/кг) при сепсисе. Расчитаны терапевтический индекс и LD50, характеризующие rhHSP70 как малоопасное и умеренно токсичное вещество, соответственно.
Научно-практическое значение. На основании полученных данных можно предположить, что rhHSP70 предотвращает развитие сепсиса, вызванного как грамлоложительных, так и грамотрицательных бактерий. Также стоит отметить, что rhHSP70 является малоопасным и умеренно токсичным веществом. Таким образом, высокоочищенный рекомбинантный человеческий белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа может быть рекомендован для дальнейших доклинических испытаний, как перспективное средство профилактики сепсиса.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждалсь на следующих конференциях: Молодежная
научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009 и 2010); IV-я конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии (Москва, 2009); Международная научная конференция Ломоносов (Москва, 2009 и 2010); «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пушино, 2009); IV-й симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, 2009); Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва-Пущино, 2009); Международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008, 2009 и 2010); Международная русско-финская школа по биотехнологии (Пущино, 2009); 11-й Ежегодный Всероссийский конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2010); VI-я Научно-практическая конференция «Биомедицина и биомоделирование» (Москва, 2010); Ш-й Всероссийский, с международным участием, конгресс «Симбиоз-Россия» (Нижний Новгород, 2010). Работа отмечена призами на конкурсах молодых ученых в рамках 2-й научно-практической конференции «Достижения клинической фармакологии в России» (Москва, 2009), VI-й международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009), XVII-ro национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано (9_ печатных работ, из них Ч в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, методы исследования, результаты и обсуждения, выводы. Материал иллюстрирован А таблицами и Vj_ рисунками. Список литературы включает [94_ источника, в том числе j(?h работ зарубежных авторов.
Факторы патогенности бактерий
Такое состояние данной проблемы происходит из-за отсутствия в клинической медицине эффективных средств профилактики и терапии септических патологий. Работы в этом направлении ведутся давно, однако создание препаратов антицитокинов и антиэндотоксинов пока не отразилось существенно на снижении летальности. На сегодняшний день основным фактором, решающим исход заболевания, остается адекватная детоксикация и антибиотикотерапия. Современные антибиотики во многом определяют частоту развития инфекционных осложнений и существенно влияют на результаты лечения и исход болезни.
Лечебные мероприятия являются эффективными, только если они способны прервать поток чужеродных молекул и структур микробного происхождения, поступающих в кровь (Исаков Ю., Белобородова И., 2000). Например, использование пенициллин связывающих белков, беталактамов или цефалоспоринов может приводить к выбросу в кровоток компонентов бактерий, что в еще большей степени усиливает септический процесс. (Burnett R. etal, 1995).
Многочисленные попытки разработать терапевтические препараты на основе антител также не привели к успеху (Fink М., 1993; Calandra Т. et al., 1991). Проведено множество мультицентрических исследований, анализирующих результаты применения антимедиаторного лечения сепсиса. Опыты, проведенные на животных, обнадеживали хорошими результатами, однако данные, полученные при применении на человеке, были разочаровывающими. Применение с лечебной целью моноклональных антител к LPS, IL-1, TNF и других медиаторов при сепсисе оказалось неэффективным. Ни уровень летальности, ни даже количество осложнений не снижалось (Foster DM., Doig GS., 1997).
Использование препаратов альбумина в терапии тяжелого сепсиса до сих пор остается спорным вопросом (Hwang Т., 2009). Сепсис часто сопровождается развитием относительной гиповолемии, при этом применение альбумина может быть оправдано. Вместе с тем обсуждаются возможные причины негативного влияния альбумина на выживаемость. Это основано на том, что инфузия этого препарата у больных с повышенной проницаемостью капилляров может сопровождаться осложнениями вследствие его проникновения в интерстиций, приводя к отеку тканей и органов, нарушению оксигенации и развитию ПОН.
Принимая во внимание сложную сеть взаимосвязанных процессов, лежащих в основе патогенеза сепсиса и септического шока, противоречивые клинические результаты не столь удивительны. Они доказывают, что воздействие на единственное звено или медиатор неспособно контролировать, и тем более, блокировать критические этапы септического процесса, предполагая необходимость выявления широкого спектра мишеней для лечебного воздействия.
Нормальный ответ на инфекцию либо другой стрессовый фактор является самолимитирующимся процессом, который благодаря преходящей экспрессии регуляторов и эффекторных молекул, способствует ликвидации инициирующего сигнала. Неспособность разрешить причинное событие, или восстановить баланс провоспалитительных и противовоспалительных агентов, приводит к поражению и деструкции тканей, что характеризует хроническое воспаление.
Многие компоненты микроорганизмов и продукты их жизнедеятельности в той или иной степени оказываются токсичными для хозяина и нарушают нормальный метаболизм в его органах и тканях. Ответная реакция организма на воспаление, независимо от локализации воспалительного процесса, развивается в соответствии с общими закономерностями, свойственными всякому острому воспалению. Воспалительный процесс и ответная реакция на него развиваются при участии многочисленных медиаторов воспаления, в том числе цитокинов, по одним и тем же закономерностям, как при внедрении инфекции, так и при воздействии травмы, очагов некроза тканей, ожогов и некоторых других факторов. Воспаление представляет собой приспособительную реакцию организма, направленную на уничтожение агента, вызвавшего воспалительный процесс, и восстановление поврежденной ткани.
Воспалительный процесс, развиваясь при обязательном участии медиаторов воспаления, может сопровождаться преимущественно местной реакцией с типичными местными проявлениями болезни и умеренной, малозаметной общей реакцией органов и систем организма. Проникновение инфекции и воздействие других повреждающих факторов вызывают активацию комплемента, который, в свою очередь, способствует синтезу С-реактивных белков, стимулирует продукцию фактора активации тромбоцитов, образование опсонинов, участвующих в процессе фагоцитоза и хемотаксиса. Местная реакция защищает организм, освобождает его от патогенных факторов, отграничивает «чужеродное» от «своего», чем способствует выздоровлению.
Одновременно с активацией комплемента происходит активация нейтрофилов и макрофагов, которые уничтожают проникшие в кровь чужеродные микроорганизмы. Нейтрофилы — первые фагоцитирующие клетки, появляющиеся в очаге воспаления, выделяют активные кислородные радикалы, которые приводят к повреждению и одновременно к активации ) эндотелиальных клеток. Важная роль в удалении микроорганизмов и других чужеродных веществ, а также в продукции цитокинов и различных медиаторов воспаления принадлежит активированным макрофагам, как свободно циркулирующим в крови, так и резидентным, фиксированным в печени, селезенке, легких и других органах. Макрофаги появляются в очаге повреждения в течение 24 ч с начала воспалительной реакции. Активированные макрофаги осуществляют транскрипцию антигенов (бактерий, эндотоксинов и др.). С помощью этого механизма они представляют антигены лимфоцитам, способствуют их активации и пролиферации. В связи с активацией лимфоцитов резко увеличивается продукция цитокинов и других медиаторов воспаления, возникает гиперцитокинемия. Включение активированных макрофагов в развивающееся воспаление является гранью между локальной и системной реакцией на воспаление.
Выживаемость животных в эксперименте и терминальные процедуры
Летальность при формировании ПОН колеблется от 35 до 75 % и более (Гринев М. В., 2001). В определении уровня летальности в качестве важнейшего прогностического признака выступает количество органно-функциональных систем, задействованных в формировании ПОН. Вовлечение в ПОН новой органной системы повышает для пациента риск смертельного исхода в 2 раза (Руднов В. А., 2004). Своевременное выявление признаков органной дисфункции по всем жизненно важным системам является кардинальным вопросом диагностики ПОН.
Альбумин является очень важным компонентом гомеостаза и неизменно входит в число самых необходимых диагностических показателей. В целом белки являются важной составляющей частью плазмы крови, их содержание составляет 7-8% от ее массы (65-85 г/л). Наибольшая часть из них представлена альбумином и составляет 4-5% плазмы крови (35-40 г/л). Одна из наиболее важных функций альбумина - это обеспечение коллоидно-осмотического (онкотическое) давления (КОД) в плазме крови. Альбумин обеспечивает 80% онкотического давления, что связано с его относительно малой молекулярной массой и большим количеством молекул в плазме крови (Weil М. et al., 1979). Такой эффект достигается высокой способностью молекул альбумина связывать. Онкотический эффект человеческого альбумина в 2,5 раза выше, чем у глобулинов (Gosling Р., 1995; Traylor R., Pearl R., 1996). При уменьшении содержания альбумина на 50% КОД снижается на 60-66%. В венозных капиллярах альбумин абсорбирует фактически 90% жидкости из интерстиция.
Альбумин также участвует в регуляции кислотно-основного состояния плазмы крови благодаря наличию буферных свойств; влияет на вязкость крови и плазмы; участвует в процессах репарации и роста. Обеспечивает транспорт ряда гормонов, липидов, минеральных веществ, в частности Са + и Mg +, а также лекарственных средств (Sudlow G., 1975; Peters Т., 1996; Doweiko J., NompleggiD., 1991).
Предполагается, что альбумин обладает про- и антикоагулянтной активностью (снижает агрегацию тромбоцитов и способствует воздействию антитромбина III на фактор Ха) (Johnson S. et al., 1979). Вместе с тем проведенные исследования показывают отсутствие влияния на свертывание крови и геморрагических осложнений, связанных с введением альбумина (De Jonge Е., Levi М., 2001). Изучение функций тромбоцитов при терапии различными инфузионными средами установило, что альбумин «защищает» морфологическую и функциональную целостность тромбоцитов.
Альбумин является источником сульфгидрильных групп. Эти триолы являются «уборщиками» свободных радикалов, особенно при септических состояниях, этим и объясняется его антиоксидантная функция (Holt М., 1984).
Существует мнение, что альбумин играет роль в регуляции сосудистой проницаемости. Это связывают с наличием у молекулы альбумина отрицательного заряда, которая при повреждении эндотелия стремится к месту дефекта. Это привело к гипотезе, что коллоидные растворы поддерживают сосудистую архитектонику.
Альбумин основной транспортный белок. До 80% свободного LPS обнаруживается в альбуминовой фракции (Tobias P. et al., 1986).
Гипоальбуминемия сопровождает заболевания печени и почек. Ее диагностируют на начальной стадии нефротического синдрома. При этом наблюдается отек мягких тканей т.к. снижается внутрисосудистое коллоидно-осмотическое давление (Ткачук В., 2004). Основной причиной гипоальбуминемии у пациентов при остро развивающемся критическом состоянии, кроме нарушения синтеза на фоне острофазовой реакции в печени, является перераспределение альбумина. На фоне выраженного воспалительного каскада, повреждения эндотелия и увеличения сосудистой проницаемости происходит утечка жидкости и белка в интерстиций, что приводит к отеку органов и тканей. Таким образом, альбумин может считаться неспецифическим маркером болезни и снижение его концентрации в плазме является результатом патологических процессов, а не наоборот.
Глюкоза является "топливом" для клеточного метаболизма и основным показателем углеводного обмена (Цыганенко А.Я. и др., 2002).
Проведение мониторинга метаболических нарушений, в том числе и уровня глюкозы в крови, является неотъемлемой частью интенсивной терапии (Hirasawa Н., 2009). Мониторинг глюкозы (хранение и синтез гликогена, гликолиз и глюконеогенез), альбумина и протромбинового времени (ПВ) отражает серьезность гепатоцеллюлярного поражения. При этом отмечается корреляция между гипогликемией у пациентов и их смертностью (Wiener R. et al., 2008).
Исследование защитных свойств rhHSP70 на модели грамположительного сепсиса
Система фибринолиза также довольно быстро реагирует на введение LPS (рис. ИГ). Уже к 20-й минуте обнаружено снижение активности фибринолитической системы. К 5-му часу такие нарушения функционирования данной системы резко возросли. Если к 20-й минуте после введения LPS время фибринолиза увеличивается на 25%, то к 5-му часу - уже на 70%.
Увеличение времени лизиса тромбов наблюдается при нарушении внутреннего ХП-а зависимого фибринолиза. Это происходит за счет снижения уровня участвующих в реакции компонентов плазменных протеолитических систем. Возникает дефицит плазминогена реже фактора XII, плазменного прекалликреина или высокомолекулярного кининогена.
В группе, где животным после LPS вводили rhHSP70 значения параметров гемостаза достоверно не отличаются от значений в контрольной группе с сепсисом. Хотя отличия между группами не являются статистически значимыми, прослеживается тенденция к снижению токсических эффектов LPS на параметры гемостаза крыс. Наибольшие отличия наблюдаются по времени фибринолиза (рис. ИГ).
Известно, что LPS оказывают прямое повреждающее действие на клетки эндотелия сосудов (Bannerman D., Goldblum S., 1997). Важно отметить способность LPS опсонизировать клетки эндотелия сосудов. Необходимым условием для такого процесса - высокая концентрация LPS в крови. Эндотелий при септическом шоке изменяет морфологию: становится кубовидным и отечным, в микрососудах и межклеточных пространствах определяются депозиты фибрина. В венулах, артериолах и капиллярах образуются состоящие из нейтрофилов, тромбоцитов и эритроцитов скопления клеток. Подобные расстройства периферического кровообращения и микроциркуляции носят системный характер, не компенсируются и приводят к ПОН и глубоким нарушениям основных путей обмена веществ (Козлов В.К., 2006).
БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ КРОВИ Взаимоотношения между генерализованным воспалением и коагуляцией обычно рассматривают в рамках так называемой «петли усиления» — воспаление усиливает коагуляцию, в свою очередь избыточная коагуляция усиливает воспаление. В конечном итоге развивается сосудистый коллапс, нарастают явления тромбоза микрососудистого русла, а в тканях, пострадавших от ишемии, активизируются процессы гипоксического и свободнорадикального некробиоза. Ускоряются также процессы апоптоза, которые определяют преждевременную инволюцию клеток разных органов. В совокупности это неизбежно выливается в дисфункцию многих органов и полиорганную недостаточность (Козлов В.К., 2006).
Данные таблицы 1 отражают изменение биохимических показателей относительно исходного уровня (до введения веществ). На 20-й минуте в группе с LPS достоверные отличия от исходного уровня значений наблюдаются только по показателям триглицеридов и билирубина. К 5-му часу после введение LPS по показателям биохимии крови наблюдались значительные изменения. При этом статистически значимо отличаются от исходных значений почти все параметры. Только по показателю "триацилглицериды" (ТАГ) не наблюдается отличий, что видимо, связано с большой ошибкой. Подобная картина изменения биохимических параметров крови характерна для сепсиса и отражает различные нарушения функционирования отдельных органов и метаболизма в целом. В условиях сепсиса неадекватная перфузия тканей и развивающаяся тканевая гипоксия начинают тормозить процессы липолиза, а выброс цитокинов способствует снижению утилизации жирных кислот и ТАГ тканями организма за счет подавления активности соответствующих ферментов (Козлов В.К., 2006).
Введение rhHSP70 на фоне LPS достоверно отличается от группы с LPS по показателям креатинина и билирубина. Билирубин хотя и не является особенно чувствительным индексом дисфункции печени или прогноза болезни, но это — признанный тест, характеризующий общее состояние функций печени. Остальные параметры, кроме триглицеридов, даже к 5-му часу остаются на уровне исходных значений.
Как известно, при сепсисе повышенная скорость синтеза белков в печени не компенсирует резко возросший катаболизм белков в мышцах и висцеральных органах. Известно, что при сепсисе потери белка у пациентов составляют порядка 20 г в сутки. (Козлов В.К., 2006). В то же время концентрация некоторых транспортных белков, в частности альбумина, снижается в течение реакции острой фазы. Такие белки известны как отрицательные белки острой фазы (Дати Ф., Метуманн Э., 2007).
В клинике диагноз ПОН ставится при поражении двух и более органов. Основным органом, обеспечивающим ответ организма на эндотоксин, является печень. Напрямую гепатоциты с ним не взаимодействуют из-за отсутствия соответствующих рецепторов. Передача сигнала осуществляется посредством действия цитокинов. Воздействуя на экспрессию генов, они способствуют существенному изменению метаболизма не только в печени, но и организме в целом. Резкое увеличение синтеза белка в печени (так называемый ответ острой фазы для детоксикации организма) сопровождается мобилизацией аминокислот из скелетной мускулатуры и соединительной ткани, приводя к формированию устойчивого катаболического состояния, результатом которого является кахексия.
Основной чертой всей совокупности изложенных изменений обмена веществ является сочетание высокой потребности организма в различных субстратах для обеспечения возможности адаптации к повышенным затратам энергии с толерантностью тканей к этим же субстратам (Козлов В.К., 2006).
ВЫЖИВАЕМОСТЬ ЖИВОТНЫХ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Одним их самых важных критериев является уровень выживаемости в экспериментальных группах. Как видно из рис. 12, выживаемость в группе с rhHSP70 (п=10) не отличается от группы с LPS (п=18). В то же время достоверно отличается от контроля с физиологическим раствором (п=6). Выживаемость в этих группах составила 50, 17 и 100% соответственно. %
Его присоединение — всегда катастрофа, так как потеря кровью жидкостных свойств, а также нарушения ее циркуляции в капиллярах несовместимы с жизнью. Обнаружение ДВС-синдрома знаменует вступление пациента в декомпенсированную фазу шока. Кардинально нарушенная гемодинамика и гемореологические расстройства приводят к резкому дефициту кислорода в тканях, субстратов тканевого дыхания и питательных веществ. Прогрессирует тканевая гипоксия, нарушаются основные метаболические процессы, изменяется кислотно-основное равновесие, нарастает ацидоз. Септический шок с исходом в ДВС-синдром — наиболее частая причина летальных исходов при сепсисе (Козлов В.К., 2006).
Исследование зависимости защитных свойств rhHSP70 от дозы вводимого вещества на модели грамотрицательного сепсиса
ВЫЖИВАЕМОСТЬ ЖИВОТНЫХ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Выживаемость животных в группах наблюдали в течение двух недель от момента введения физиологического раствора (контрольная группа) и rhHSP70 (экспериментальная группа). Ни одной смерти животного не было зафиксировано в обеих группах. Таким образом, выживаемость животных и в контрольной и в экспериментальной группах составила 100%.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данном эксперименте показано, что однократное внутривенное введение rhHSP70 в дозе 266 мкг/кг не вызывает заметного отклонения исследуемых параметров гемодинамики, гемостаза и биохимии крови. Анализируя полученные данные, можно предположить, что, как и ожидалось, rhHSP70 не обладает собственной фармакологической активностью в отношении здоровых животных. Его однократное внутривенное введение здоровым крысам без сепсиса не оказывает влияния на физиологическое состояние животных. Это согласуется с утверждением, что белки теплового шока с молекулярной массой 70 кДа являются постоянным компонентом плазмы крови. При этом стоит отметить, что их количество может резко возрастать при патологии (Satoh М. Et al., 2006; Walsh R. et al., 2001; Wright B. et al., 2000). Учитывая полученные нами результаты, можно полагать, что HSP70 являются следствием, а не причиной подобных патологий.
Принадлежность большинства препаратов, полученных с помощью биотехнологии, к классу эндогенных веществ, содержащихся в организме в определенных количествах и участвующих в процессах естественного метаболизма, требует особого внимания в выборе доз при проведении доклинических испытаний. С одной стороны, должен быть соблюден принцип использования высоких доз, обеспечивающий необходимый запас надежности оценки безопасности. С другой стороны, при проведении экспериментов по оценке безопасности аналогов эндогенных веществ наиболее информативными могут оказаться результаты, полученные при введении экспериментальным животным терапевтических доз, обеспечивающих проявление специфической биологической активности препарата (Хабриев Р.У., 2005).
При однократном внутривенном введении rhHSP70 мышам CD-I в течение 2 недель не зафиксировано отклонений в поведении и внешнем виде этих животных. Также не отмечено каких-либо аномальных изменений в походке. Не замечено агрессивности или подавленности в состоянии животных. ВЫЖИВАЕМОСТЬ ЖИВОТНЫХ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ В течение двух недель после введения мышам rhHSP70 ни одного случая смерти животного не было зафиксировано. Таким образом, выживаемость и в экспериментальной группе с rhHSP70 (п=5), и в контрольной группе с физиологическим раствором (п=10) составила 100%.
Согласно руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ определение средней смертельной дозы (LD5o) для препаратов, полученных с помощью биотехнологии, как правило, невозможно в связи с их низкой токсичностью при однократном введении животным. Стоит отметить, что если из-за низкой токсичности фармакологического вещества нельзя определить LD50, то следует указывать максимальную дозу, которая была введена животным (Хабриев Р.У., 2005).
Учитывая полученные ранее результаты об эффективности rhHSP70 на модели экспериментального сепсиса, был построен график зависимости выживаемости животных в эксперименте от дозы вводимого rhHSP70 (рис. 24).
При решении уравнения получено значение ED5o =199,5. Таким образом, средняя эффективная доза rhHSP70 при экспериментальном сепсисе у крыс составила примерно 200 мкг/кг.
Наибольшее распространение при оценке безопасности лекарственных препаратов имеет "терапевтический индекс" (ТИ) - показатель, представляющий собой соотношение средней смертельной дозы, вызывающей гибель 50% животных (LD50), и средней эффективной дозы, вызывающей фармакологический эффект у 50% животных (ED5o) (Гуськова Т.А., 2003). ТИ= LD5o/ED5o= 26,6/0,2= 133
При решении вопроса о возможности применения лекарственного средства в медицинской практике основным является определение соотношения терапевтической ценности препарата и тех токсикологических эффектов, которые могут развиваться при его использовании. Только при положительном соотношении польза/риск препарат может найти применение в качестве лекарственного средства. Решение этого вопроса является чрезвычайно сложным (Гуськова Т.А., 2003).
Высокая величина ТИ свидетельствует о широких границах безопасности вещества (даже при использовании неадекватных его доз). Поскольку ТИ представляет собой отношение LD50 и ED50, то чем он выше, тем вещество безопаснее, тем труднее его передозировать (Энтони П.К., 2004).
Значение ТИ позволяет определить принадлежность rhHSP70 к тому или иному классу опасных веществ. Необходимо отметить, что классификация степени опасности токсического действия лекарственных средств определяет вещества с ТИ 45 как малоопасные (Березовская И.В., 1985). В то же время, по классификации токсичности химических веществ rhHSP70 характеризуются как умеренно токсичное вещество (Березовская И.В., 2003).
НЕКРОПСИЯ Спустя две недели после однократного внутривенного введения rhHSP70 в дозе 26,6 мг/кг животных подвергали эвтаназии с помощью С02-камеры. При вскрытии макроскопический анализ внутренних органов не выявил патологических изменений в строении органов и тканей. Не отмечено раздражения в месте введения rhHSP70 (хвостовая вена) или накопления жидкости в полостях тела животного.
![Адреналинзависимая регуляция экспрессии белков теплового шока 70 кДа в лимфоидных клетках [Электронный ресурс]](/i/i/4357/199767.png "Адреналинзависимая регуляция экспрессии белков теплового шока 70 кДа в лимфоидных клетках [Электронный ресурс] Мурашко Дмитрий Александрович")
