Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современное состояние проблемы оценки адаптации к нагрузкам различной интенсивности 13
Биохимические и гормональные показатели адаптации к нагрузкам различной интенсивности 16
Белки теплового шока, как показатель адаптации к физическим нагрузкам 33
Глава II. Методы исследования 55
Организация исследования 55
Определение концентрации БТШ70 методом ИФА 57
Определение биохимических и гормональных показателей 69
Определение концентрации малонового диальдегида 70
Статистическая обработка 71
Глава III. Разработка иммунохимического метода определения БТШ 72
Глава IV. Влияние нагрузок максимальной интенсивности на концентрацию БТШ70 74
Определение изменения экспрессии мРНК БТШ70 и концентрации БТШ70 в сыворотке в ответ на максимальную аэробную нагрузку 74
Определение изменения концентрации БТШ70 в сыворотке в ответ на максимальную анаэробную нагрузку 79
Глава V. Изменение уровня БТШ70 в ответ на нагрузку в различных видах спорта 81
Глава VI. Обсуждение результатов 95
Выводы 102
Практические рекомендации 103
Список литературы
- Белки теплового шока, как показатель адаптации к физическим нагрузкам
- Определение концентрации БТШ70 методом ИФА
- Определение концентрации малонового диальдегида
- Определение изменения концентрации БТШ70 в сыворотке в ответ на максимальную анаэробную нагрузку
Введение к работе
Исследования проведены с целью разработки медико-биологических критериев адаптации к нагрузкам различной интенсивности в ходе учебно-тренировочного процесса высококвалифицированных спортсменов.
Прогрессирующее развитие тренированности спортсмена является результатом того, что следовые реакции, наблюдающиеся в организме после отдельных тренировочных нагрузок, не устраняются полностью, а сохраняются и закрепляются конструктивными изменениями функциональных систем организма спортсменов, возникающими в восстановительном периоде, которые служат основой повышения тренированности. Оптимальное сочетание процессов утомления и восстановления - физиологическая основа постоянной и долговременной адаптации организма к физическим и спортивным нагрузкам.
В настоящее время довольно подробно разработаны биохимические критерии адаптации при нагрузках высокой интенсивности в циклических видах спорта. Остается открытым вопрос поиска биохимического критерия адаптации к нагрузкам не только в циклических, но и в других видах спорта.
Актуальность
Актуальность темы определяется как теоретической, так и практической значимостью проблемы оптимизации учебно—тренировочного процесса высококвалифицированных спортсменов с помощью разработки новых критериев адаптации к нагрузкам различной интенсивности.
Особенность адаптации организма к спортивной деятельности заключается в этапности ее формирования на протяжении многолетнего процесса тренировки и участия в соревнованиях. Развитие адаптационных изменений и ускорение периода восстановления сопряжено с применением продолжительных нагрузок различной интенсивности, что значительно
*"V / r*^
повышает вероятность формирования у спортсмена синдрома переутомления. Синдром переутомления — это совокупность симптомов, которые обуславливают неспособность адекватно переносить тренировочный процесс. Спортсмены не способны поддерживать свой тренировочный график или повторять результаты достигнутые ранее. Зачастую диагноз переутомления ставится на основании ретроспективных данных. К сожалению, на сегодняшний день способ реабилитации только один -полноценный (иногда продолжительный) отдых, что отрицательно сказывается на карьере спортсмена. Общеизвестно, что заболевание легче поддается лечению на начальном этапе. Чтобы определить критическое состояние спортсмена необходимы объективные показатели физического состояния во время тренировочного процесса.
Одним из актуальных направлений поиска биохимических маркеров утомления и адаптации является исследование роли белка теплового шока (БТШ) 70 в организме человека. Белок БТШ70 является индуцибельным представителем семейства белков теплового шока. БТШ необходимы клетке во всех процессах ее жизнедеятельности, включая адаптацию к огромному числу цитотоксических факторов, как ксенобиотического, так и естественного происхождения.
Одна из функций БТШ70 в клетке заключается в том, что он связывается с поврежденными или вновь синтезированными полипептидами и помогает им принять нативную конформацию. То, что БТШ70 спасает клетки от огромного числа факторов, в том числе, вызывающих апоптоз, было подтверждено в многочисленных опытах in vitro и in vivo с использованием широкого спектра модельных организмов, находящихся на разных ступенях эволюции.
БТШ70 и считается индуцибельным, что означает, что его экспрессия резко возрастает в ответ на стресс, в клетках человека его синтез, хотя и на
~8~
невысоком уровне, происходит и в нормальных условиях. В частности, было показано, что увеличение экспрессии митохондриального БТШ70 приводит к повышению образования АТФ, то есть улучшает энергообеспечение. Надо отметить, что в разных тканях и клетках организма степень экспрессии БТШ70 различается. Например, она очень высока в тканях сердца, и крайне низка (и не запускается в ответ на стресс) в некоторых типах нейронов головного мозга. Несколько лет тому назад появились данные о том, что БТШ70, ранее считавшийся исключительно цитоплазматическим белком, может находиться во внеклеточном пространстве, в биологических жидкостях человека.
Не смотря на то, что в целом ряде работ показано, что физическая нагрузка является сильным стимулом к внутриклеточной экспрессии БТШ70 клетками иммунной системы, миоцитами скелетной и сердечной мускулатуры, а также такими органами, как печень, селезенка и мозг, исследований, посвященных взаимосвязи уровня БТШ70 в сыворотке крови и специфике физической нагрузки (специальная работоспособность) не проводилось.
Не смотря на то, что в целом ряде работ показана зависимость стимуляции внутриклеточной экспрессии БТШ70 при возрастании физической нагрузки клетками иммунной системы миоцитами скелетной и сердечной мускулатуры, печенью, селезенкой и мозгом, исследований, посвященных взаимосвязи уровня БТШ70 в сыворотке крови и спецификой физической нагрузки (специальная работоспособность) не проводилось.
Определение БТШ70 сыворотке крови может существенно повысить точность методов лабораторного контроля спортивной деятельности, углубить представления о молекулярно-биологических процессах, протекающих в организме высококвалифицированных спортсменов в ходе тренировочной и соревновательной деятельности.
~ g ~
Предмет исследования
Биохимические показатели, показатели гормонального статуса, экспрессия БТШ70 в лейкоцитах, концентрация БТШ70 в сыворотке крови при нагрузках различной интенсивности у спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта.
Объект исследования
Биологические закономерности адаптации организма спортсмена к нагрузкам различной интенсивности.
Цель исследования
Изучение влияния нагрузок различной интенсивности на концентрацию БТШ70 в сыворотке крови спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта, экспрессии мРНК БТШ70 в лейкоцитах; разработка критериев оценки адаптационных резервов организма высококвалифицированных спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта в процессе тренировочной и соревновательной деятельности основанных на динамике изменения концентрации БТШ70 в сыворотке крови.
Гипотеза
Предполагается, что БТШ70 не только защищает миоциты от воздействия факторов острого и хронического физиологического стресса, но и отвечает за повышение эффективности работы митохондрий и их гиперплазию в миоцитах скелетной мускулатуры. Контроль уровня БТШ70 в сыворотке крови может помочь оптимизировать тренировочный процесс высококвалифированных спортсменов различной специализации.
Задачи исследования
~10~
Разработать модификацию иммунохимического метода определения БТІН70 в сыворотке.
Исследовать экспрессию БТШ70 в лейкоцитах в ответ на кратковременную нагрузку высокой интенсивности.
Исследовать динамику гормональных и биохимических показателей, БТШ70 у высококвалифицированных спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта на различных этапах учебно-тренировочной и соревновательной деятельности.
Определить базальный уровень БТШ70 для разработки рекомендаций по медицинскому контролю над функциональным состоянием высококвалифицированных спортсменов с учетом полученных данных.
Методы исследования
Для решения задач исследования применялись следующие методы:
анализ и обобщение литературных данных, биохимические методы
исследования, электрофизиологические методы исследования,
гематологические методы исследования, иммунохимические методы исследования, методы педагогического тестирования, методы математической статистики.
Научная новизна
Впервые при использовании протокола кратковременных высокоинтенсивных упражнений удалось достичь физиологического стресса, приводящего к достоверному увеличению экспрессии мРНК БТШ70 в лейкоцитах. Показана индивидуальность ответа организма на стресс у подготовленных спортсменов. Выявлены статистически значимые различия в базальном уровне БТШ70 у спортсменов циклических и
~11~
сложнокоординационных видов спорта. Установлено отсутствие взаимосвязи уровня перекисного окисления липидов и уровня БТШ70 в сыворотке.
Теоретическая значимость
Результаты исследования расширяют знания о медико-биологических способах оптимизации учебно-тренировочного процесса спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта, как методах защиты организма и поддержания здоровья спортсменов и повышения спортивного результата.
Практическая значимость
Практическая значимость работы определяется разработкой информативного метода оценки срочной адаптации к мышечной нагрузке различной интенсивности на основе концентрации БТШ70 в сыворотке крови, а также созданием тест-системы для определения БТШ70 в биологических жидкостях.
Результаты работы могут использоваться для коррекции учебно-тренировочной работы в процессе подготовки спортсменов. Материалы исследования могут быть использованы в преподавании медико-биологических дисциплин в высших учебных заведениях, на семинарах и курсах повышения квалификации врачей спортивной медицины, тренеров, инструкторов ЛФК, врачей команд по видам спорта. Результаты исследований внедрены в работу кафедры спортивной медицины ФГУ РГУФКСиТ и кафедры физического воспитания и спорта МГУ им. М.В. Ломоносова, что подтверждено актами о внедрении.
~12~ Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Работа максимальной аэробной мощности повышает концентрацию БТШ70 в сыворотке и увеличивает экспрессию его мРНК в лейкоцитах.
Работа максимальной анаэробной мощности не вызывает повышения концентрации БТШ70 в сыворотке крови.
Диапазон значений уровня БТШ70 в сыворотке крови высококвалифицированных спортсменов сложнокоординационных и циклических видов спорта статистически значимо различается в подготовительный период, и не различается в предсоревновательный.
~13~
Белки теплового шока, как показатель адаптации к физическим нагрузкам
Тепловым шоком называется реакция клеток и систем на температуру, превышающую нормальные для организма значения. Большая часть ферментативных систем обладает оптимальной активностью в достаточно узком диапазоне температур, и при отклонении температуры тела даже на небольшую величину активность может существенно изменяться. При физической нагрузке происходит интенсификация теплообмена организма спортсмена с окружающей средой, однако при достаточно сильной или длительной нагрузке ресурс краткосрочных механизмов адаптации оказывается недостаточен для поддержания оптимальной температуры тела; что приводит к перегреву и соответствующим последствиям. Таким образом, тепловой шок является одним из основных маркеров, позволяющих судить об интенсивности и эффективности тренировок, а также характеризовать выносливость и стрессоустойчивость конкретного спортсмена.
Основными молекулярными маркерами как непосредственно теплового шока, так и практически любого экзогенного стресса вообще, являются белки теплового шока (heat shock proteins, БТШ). Впервые экспрессия белков группы теплового шока была обнаружена в 1974 г. у Drosophila melanogaster (Tissieres А., 1974), и вскоре после этого — практически у всех организмов, от простейших до человека.
Высокие уровни продукции белков теплового шока могут быть вызваны, помимо температурного воздействия, также и большим числом других стрессовых факторов, таких как инфекция, лихорадка, токсическое воздействие (этанол, мышьяк, тяжелые металлы, ультрафиолетовое облучение и др.), голод, гипоксия, обезвоживание (Gonzalez В., 2000). Таким образом, благодаря разнообразию функций, белки теплового шока являются универсальным неспецифическим ответом клетки на стрессовое воздействие.
В настоящее время функции и механизмы регуляции экспрессии белков теплового шока являются предметом интенсивного изучения. Пусковым механизмом экспрессии таких белков, скорее всего, является появление в клетке поврежденных или неправильно свернутых молекул белка (Sharp F.R., 1999).
Интересной особенностью этой группы белков является их необычайная консервативность (сохранение структуры и аминокислотного состава молекулы у различных видов организмов). Например, консервативность аминокислотной последовательности белка БТШ70 у таких далеко отстоящих друг от друга в эволюционном отношении организмов как бактерия Escherichia coli и человек, достигает 50%, а некоторые домены схожи на 96% (Bardwell J.C., 1984; Caplan A.J., 1993; Craig Е.А., 1985;
Lindquist S., 1986). Такой высокий уровень консервативности этой группы белков указывает на взаимодействие белков с большим количеством других разнообразных молекул, и, косвенно, на их важность для обеспечения жизнедеятельности клетки. Кроме того большинство белков теплового шока экспрессируются также и на базальном уровне, вне зависимости от воздействия стрессовых факторов. В норме такие белки участвуют в процессах фолдинга (сворачивания) других белков, а также их утилизации и внутриклеточном транспорте (Wegele Н., 2004; Wegele Н., 2006).
Механизм регуляции экспрессии белков теплового шока реализуется через регуляцию транскрипции соответствующих генов посредством факторов транскрипции, также белковой природы.
Основной функцией белков теплового шока является их активность в качестве молекулярных шаперонов. Шапероны обеспечивают правильное сворачивание других белков после их трансляции с РІЖ на рибосоме. Распознавая гидрофобные участки, характерные для несвернутого белка, шапероны связываются с ними, обеспечивая корректный фолдинг, защиту от протеазной активности клетки, а также транспорт этих белков к месту назначения. Под воздействием стрессовых факторов процессы нормального фолдинга белков нарушаются, повышается количество неправильно свернутых молекул, что приводит к компенсаторному увеличению экспрессии белков теплового шока.
Помимо обеспечения правильной конформации клеточных протеинов, белки теплового шока вовлечены в большое количество физиологических процессов и метаболических путей, и выполняют множество других побочных функций — участие в системах передачи внутриклеточного сигнала, презентация пептидных антигенов иммунокомпетентным клеткам CD8, регуляция иммунной системы, противоопухолевая активность и др (Guidon Р.Т., Jr., 1986). Таким образом, белки группы теплового шока являются центральным звеном клеточной реакции на разнообразные стрессовые воздействия, в связи с чем эту группу белков также называют «стрессовыми». В недавних исследованиях, посвященным влиянию физической нагрузки на протеом, было установлено, что интенсивная физическая нагрузка приводит к увеличению содержания и соотношения белков теплового шока. Так, немецкая группа исследователей под руководством Е. Fehrenbach исследовала изменения в уровне экспрессии генов, кодирующих белки БТШ70 и БТШ27, в ходе выполнения испытуемыми полумарафонской дистанции (21 км) (Fehrenbach Е., 2000). Исследование было проведено методом ПЦР в реальном времени, и показало существенное увеличение содержания соответствующих мРНК. Несмотря на небольшую выборку (11 человек) и достаточно сильный разброс в антропометрических данных, возрасте и уровне спортивной подготовки исследованных людей (что привело к различиям в относительной физической нагрузке для каждого), полученные данные позволяют сделать вывод о роли белков теплового шока в ответе организма на стресс, которым является тренировка.
Определение концентрации БТШ70 методом ИФА
На четвертом этапе были проанализированы полученные материалы, разработаны практические рекомендации и осуществлено внедрение результатов в практику.
Полученные в работе данные обрабатывали с использованием статистических пакетов STATISTICA 7 (StatSoft) и Sigma Plot 8.0 (SPSS). Для определения достоверности различий между уровнями исследуемых параметров использовали U критерий Манна—Уитни. Различия считали достоверными при р 0.05. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БТШ70 МЕТОДОМ ИФА Получение поликлональных сывороток Протокол иммунизации кроликов:
Использовали самок свободных от патогенов кроликов весом 3,5-4 кг. До иммунизации проводили акклиматизацию кроликов на протяжении дней. Предварительно собирали 2—10 мл интактной сыворотки из ушной вены.
Первичная иммунизация в полном адъюванте Фрейнда.
1. Разбавить 1 мг антигена в 0.5 мл ФСБ и смешать с 0.5 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ).
2. Ввести раствор подкожно в несколько участков, не допуская введение более 0.2 мл в одно место.
3. Места инъекций должны располагаться на незначительном удалении для предотвращения коалесценции при локальном иммунном ответе. В течении 14 дней ждали развития первичного иммунного ответа. Вторичная иммунизация в неполном адъюванте Фрейнда.
1. Разбавить 1 мг антигена в 0.5 мл ФСБ и смешать с 0.5 мл неполного адъюванта Фрейнда (НАФ).
2. Ввести раствор подкожно в несколько участков, не допуская введение более 0.2 мл в одно место.
3. Места инъекций должны располагаться на незначительном удалении для предотвращения коалесценции при локальном иммунном ответе. В течении 14 дней ждали развития иммунного ответа.
Третья иммунизация в неполном адъюванте Фрейнда. 1. Разбавить 1 мг антигена в 0.5 мл ФСБ и смешать с 0.5 мл неполного адъюванта Фрейнда (НАФ). 2. Ввести раствор подкожно в несколько участков, не допуская введение более 0.2 мл в одно место. 3. Места инъекций должны располагаться на незначительном удалении для предотвращения коалесценции при локальном иммунном ответе.
После третьей иммунизации на седьмой день отобрали кровь из ушной вены (2мл сыворотки) для определения титра сыворотки. Все последующие иммунизации проводили в неполном адъюванте Фрейда с интервалом в 4 недели. 20 мл крови отбирали на шестой и девятый или седьмой и десятый день после иммунизации.
Кровь инкубировали при 37С. Сыворотку отделяли после центрифугирования при 2500 об./мин в течении 15 минут. Получение аффинного сорбента и аффинная очистка поликлональных антител
Присоединение белков к карбоксильным группам кроссшитой агарозы, через аминогруппы позволяет создавать сорбенты с ковалентно иммобилизированными антителами, антигенами или биомолекуолами. Ковалентно иммобилизированные на сефарозе белки используются для создания аффинных колонок.
Активированная сефароза содержит альдегидные группы на поверхности, которые реагируют с первичными аминами по реакции конденсации с образованием основания Шиффа. Затем полученный аддукт обрабатывается мягким восстанавливающим реагентом — цианоборгидридом натрия с образованием стабильной вторичной аминной связи между белком и сефарозой (Рисунок 9)
Присоединение белков по аминной группе к активированной сефарозе. Эффективность связывания по этому механизму превышает 80% и зависит от рН и ионной силы раствора (Таблица 3)
После иммобилизации белка, сорбент может быть использован многократно без значительного снижения активности.
Второй не менее эффективный способ присоединения белков и пептидов к носителю - реакция иодоацетильных групп носителя с тиольными группами белков, пептидов или макромолекул.
Носитель - кросс-сшитая сефароза содержит иодацетильные группы, закрепленные на длинном алкильном спейсере. Иодацетильная группа при рН 7.5-9.0 легко реагирует со свободной тиольной группой по реакции изображенной на рисунке (Рисунок 10). Иммобилизация белков
1. Установить вертикально колонку, содержащую требуемый объем аминомеченного связывающего сорбента при комнатной температуре и дать сорбенту осесть. Открыть колонку и слить раствор в пробирку. В ходе всей процедуры не допускать высыхания сорбента. Закрыть колонку снизу, когда буфер вытечет к верхушке сорбента.
2. Уравновесить колонку, добавив 6 мл буфера для иммобилизации белка 1 (3-х кратной избыток по сравнению с объемом сорбента) и позволить ему стечь.
3. Закрыть колонку снизу и добавить 4 мл раствора белка с концентрацией 0,78 мг/мл (растворенного в буфере для иммобилизации белков 1) на колонку. Оставить 0,1 мл приготовленного образца для дальнейшего определения связывающей эффективности.
4. В вытяжном шкафу, добавить 40 мкл раствора цианоборгидрида к реакционной смеси (-50 мМ NaCNBH3).
5. Закрыть колонку сверху и перемешать реакционную смесь, встряхивая в течение 6 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 С. Для белков, которые являются чувствительными к взбалтыванию, смешивать в течение 2 часов и оставить колонку стационарно в течение 4 часов.
6. В вытяжном шкафу осторожно снять крышку колонки. В течение реакции может образоваться газовое давление.
7. Открыть колонку и собрать вытекающий из колонки раствор в чистую пробирку. Количество не связавшегося белка составило 1,6 мг.
Определение концентрации малонового диальдегида
Концентрация МДА определялась методом Дрейпера и Хадле, основанном на реакции МДА с тиобарбитуровой кислотой (ТБА) при 95оС. В этой реакции МДА взаимодействует с ТБА с образованием розового пигмента с пиком абсорбции на длине волны 532 нм. Необхидимые реактивы 0.67% водный раствор тиобарбитуровой кислоты (ТБА) 20% водный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) 98%) бутанол Водный раствор 1,1,3,3 тетраметоксипропана в концентрации 50 нмоль/мл
Постановка реакции 1. Приготовление рабочего раствора для стандартов (РРС) -сливная сыворотка крови разводится в 20 раз (примерная концентрация МДА в РРС примерно 0,05 нмоль/мл). 2. Приготовление стандартов - серии разведений 1,1,3,3 тетраметоксипропана в РРС с концентрацией от 50 до 0,4 нмоль/мл. 3. Подготовка необходимого количества реакционных пробирок — в каждую пробирку необходимо добавить 300 мкл ТБА и 150 мкл ТХУ 4. Внесение образцов - стандарты и исследуемые образцы вносятся в подготовленные пробирки в объеме 50 мкл и ресуспензируются до образования гомогенной белой окраски. 5. Инкубация — закрытые пробирки инкубируются в термошейкере при 95 оС 25 минут. 6. Экстракция -после инкубации содержимое каждой пробирки необходимо тщательно ресуспензировать и внести 250 мкл бутанола и снова ресуспензировать на шейкере (5 сек.). 7. Осаждение белков — пробирки центрифугируются 5 минут при BOOOg. 8. Регистрация результата - 125 мкл образца вносится в индивидуальные ячейки микропланшета и спектрометрируются при длине волный 532 нм. Хранение образцов
Образцы сыворотки или плазмы должны храниться при 2-8С. Для более длительного хранения образцы необходимо заморозить при -20С СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА
В тексте представлены средние значения показателей, и стандартное отклонение. Для оценки достоверности различий средних использовали критерий Вилкоксона и Мани-Уитни для парных и непарных выборок соответственно, при уровне значимости р=0,05.
Для оценки концентрации маркера стресса - БТШ70 в сыворотке, был получен высокоочищенный рекомбинантный БТШ70. Рекомбинантный белок теплового шока 70 кДа получили путем интеграции в E.coli, трансформированных плазмидой pQE30 с интегрированной генетической последовательностью, кодирующей БТШ70 с гексагистидиновым тэгом на N-конце.
Чистота белка по данным ПААГ электрофореза составляла не менее 90% (Рисунок 11 А.). Рекомбинантный БТШ70 использовали для иммунизации кроликов и получения поликлональных антител и их аффинной очистки. Поликлональные антитела были аффинно выделены на сорбенте, содержащем БТШ70 (0,25 мг/мл), который получали с использованием набора AminoLink (Pierce). Активность и чистота аффинно очищенных антител были проверены в ИФА и на ПААГ электрофорезе.
Для определения БТШ70 в сыворотке крови была разработана тест-система ИФА. На планшет для ИФА сорбировали аффинно очищенные поликлональные антитела кролика против БТШ70. После стадий отмывки и блокирования мест неспецифического связывания, на плату наносили исследуемые сыворотки в разведении 1:2 или 1:4, а также стандарты (0 — 100 нг/мл БТШ70) в растворе ФСБ/Твин-20/БСА и инкубировали в течение часа при +37С. Затем проводили часовые инкубации с биотинилированными поликлональными антителами кролика против БТШ70 и конъюгатом стрептавидина с пероксидазой хрена. Детекцию проводили раствором ортофенилендиамина/Н202 в цитратно-фосфатном буфере. Развитие окраски останавливали через 10 мин. 50% раствором H2SO4. Данные стандартной кривой аппроксимировали с использованием 4 параметрической функции. Пример калибровочной кривой в диапазоне 0.5 — 35 нг/мл БТШ70 представлен на рисунке (Рисунок 11 Б). С использованием разработанного метода были проанализированы сыворотки спортсменов на последующих этапах работы.
Достоверность результатов, получаемых с помощью разработанной тест-системы, была проверена коммерческой тест системой Hsp70 EIA (Stressgen, Victoria, British Columbia, Canada).
Определение изменения концентрации БТШ70 в сыворотке в ответ на максимальную анаэробную нагрузку
Физические нагрузки различной продолжительности и интенсивности значимо повышали концентрацию БТШ70 в сыворотке спортсменов участвовавших в исследование. Наши результаты подтверждают работу Walsh et al. (Walsh R.C., 2001). В этой работе сообщается о повышении концентрации БТШ70 в ответ на физическую нагрузку в сыворотке и предлагается гипотеза о системной роли данного белка. Ряд исследовательских групп предполагают, что БТШ70 участвует в активации клеточного звена иммунной системы, в процессинге и презентации антигена (Binder R.J., 2001; Guzhova I.V., 1998; Sondermann Н., 2000; Srivastava Р.К., 1998).
Анализ проведенных исследований показал, что продолжительность физической работы оказывает наиболее сильное влияние на уровень БТШ70 в сыворотке. Также можно отметить, что наибольший рост концентрации БТШ70 в ответ на физическую работу был обусловлен ультрамарафоном. Однако продолжительность работы не является единственным определяющим фактором. Так нами было показано, что одинаковая по продолжительности работа различной интенсивности вызывала повышение БТШ70 коррелирующее с интенсивностью.
На сегодняшний день не совсем понятно какая ткань является источником БТШ70 в сывокотке крови. Febbraio с коллегами продемонстрировал, что повышение концентрации БТШ70 после 120 минут работы на мощности 62% V02max обусловлено выбросом этого белка из печени, сходного по природе с процессом повышения уровня белков острой фазы (Гужова И.В., 2000). Повышение концентрации БТШ70 вследствие разрушения мышечной ткани можно исключить, так как скорость роста концентрации БТШ70 в сыворотке намного превосходит рост экспрессии и концентрации БТШ70 в работающей мышце (Прутков К., 1955), также неповрежденные мышцы не секретируют БТШ70 в кровоток (Гужова И.В., 2005). С другой стороны есть сообщения, что продолжительная работа субмаксимальной мощности (Андреева Л.И., 2002) вызывает повышение уровня БТШ70 и признаки микроповреждения скелетной мускулатуры, с последующими вторичными иммунологическими изменениями.
Хорошо известно, что продолжительность и интенсивность физической работы влияют на мышечные, воспалительные и клеточные процессы (NK— клеточный ответ, лейкоцитоз, фагоцитоз, оксидативный взрыв). Несколько факторов должны сложиться воедино, чтобы вызвать активацию иммунной системы обусловленное физической работой.
Наши данные о повышение концентрации БТШ70 после теста со ступенчатовозрастающей нагрузкой и отсутствии достоверного повышения концентрации после теста Вингейта согласуются с полученными ранее результатами (Febbraio М.А., 2004). Febbraio с соавторами (2004) сообщали о том, что прием углеводов во время физической нагрузки снижает системный выброс БТШ70 из печени и селезенки, и предположили что причиной этого могло послужить снижение скорости истощения запасов гликогена печени. В данном случае повышение концентрации БТШ70 при выполнение теста со степенчатовозрастающей нагрузкой можно сравнить с цитокиновым ответом и связать с ростом энергетических затрат, но не повреждением тканей. Предполагается что внеклеточный БТШ70 играет важную роль «шаперокина» участвующего в передаче сигнала и работе клеток иммунной системы (Asea А., 2005).
Некротизирующие клетки выбрасывают БТШ70, запускающий деление дендритных клеток и активацию NF-kappaB-пути (Basu S., 2000). Существует гипотеза, что продолжительные физические нагрузки, такие как марафон, вызывают микроповреждение мышечной ткани и последующий выброс БТШ70 в кровоток, вызывая запуск провоспалительного механизма (Smith L.L., 1991). Ультрамарафон вызвал ярко выраженное повышение уровня БТШ70, активности КФК и лейкоцитоз у всех участников. При этом у части спортсменов наблюдалось повышение концентрации МДА - продукта перекисного окисления липидов — которое не коррелировало с ростом БТШ70. Данные обстоятельства не подтверждают гипотезу о миогенной природе роста концентрации БТШ70 в сыворотке. Источником повышенного БТШ70 в сыворотке могли послужить лейкоциты, кардиомиоциты и мозг, где достоверно продемонстрировано повышение уровня БТШ70 в ответ на нагрузку (Fehrenbach Е., 2000; Ryan A.J., 1991; Salo D.C., 1991; Skidmore R., 1995; Venetianer A., 1994; Walters T.J., 1998). В трофических медленных волокнах скелетных мышц в сравнении с быстрыми волокнами и миокардом обнаружен значительно более высокий уровень БТШ70, что свидетельствует о преобладающем значении БТШ70 медленных волокон в обменных процессах в скелетных мышцах, протекающих в не-стрессовых условиях. Также как концентрация БТШ70, лейкоцитоз связан с продолжительностью и интенсивностью нагрузки.
Известно, что при нагрузках высокой интенсивности наблюдается снижение уровня свободного тестостерона (Maestu J., 2005a,b). Нами показано повышение уровня свободного тестостерона при работе в смешанной и анаэробной зоне, что связано с особенностями метаболизма энергетических субстратов: истощения запасов глюкозы и гликогена и вовлечение в метаболизм свободных жирных кислот (СЖК)(Уагпіег М., 1994). СЖК являются конкурентными ингибиторами связывания тестостерона и триптофана белками-переносчиками (Struder Н.К., 2001a,b). Поэтому повышение концентрации СЖК в крови при длительной анаэробной работе приводит к увеличению его концентрации.
