Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Ростовые факторы и гены раннего ответа (Обзор литературы) - 8 -
Глава II. Материалы и методы исследования - 43 -
Глава III. Антитела против гормона роста, аффинные сорбенты и конъюгаты антител - 52 -
Глава VI. Нагрузочное тестирование и концентрация ростовых факторов - 97 -
Глава VII. Гены раннего ответа - 106 -
Глава VIII. Заключение -116-
Выводы - 123 -
Практические рекомендации - 124 -
Список литературы
- Ростовые факторы и гены раннего ответа (Обзор литературы)
- Антитела против гормона роста, аффинные сорбенты и конъюгаты антител
- Нагрузочное тестирование и концентрация ростовых факторов
- Гены раннего ответа
Введение к работе
Физические нагрузки являются одним из основных стимулов активации системы гормон роста (ГР) - инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР1) (Gibney J., 2007; Nindl B.C., 2007), играющей важную роль в процессах клеточного роста и развития. В крови присутствуют несколько сплайс-изоформ гормона роста и инсулиноподобного фактора роста (Baumann G., 1991а). Сплайсинг их пре-мРНК осуществляется в ядре клетки при участии сплайсосомы - мегадальтонного комплекса между РНК и белками. Известно, что различные стрессорные факторы оказывают влияние на функционирование сплайсосомы и могут приводить к изменению ее активности или нарушениям сплайсинга. Таким образом, исследование влияния физического стресса на процесс сплайсинга гормона роста, соотношение его изоформ в крови, а также на систему ростовых факторов в целом, является современной задачей восстановительной и спортивной медицины.
Известно, что физические нагрузки разной интенсивности приводят к запуску большого количества биохимических, молекулярных и генетических механизмов, лежащих в основе адаптационных реакций организма на физиологический стресс (Coffey V.G., 2007а). Процессы адаптации организма к кратковременным высокоинтенсивным физическим нагрузкам связаны как с появлением изоформ ростовых факторов, так и с активацией системы генов раннего ответа (ГРО), и привлекают все больше внимания исследователей (Buttner Р., 2007; Connolly Р.Н., 2004).
Начальными активаторами ГРО являются стрессорные факторы, связанные с физической нагрузкой (гипотермия, ишемия, метаболический стресс, изменение электролитного баланса и т.п.), которые могут воздействовать на экспрессию ГРО как напрямую, так и опосредованно -через гуморальную систему и ЦНС (Simon Р., 2006).
Результатом работы сигнальных каскадов ГРО является активация транскрипции большого количества генов; она является пусковым звеном в механизмах белкового неосинтеза, а также активации т.н. «поздних генов», формирующих специфический фенотипический ответ организма на стресс.
Процессы активации системы ростовых факторов и генов раннего ответа, протекающие в организме спортсмена в первые минуты интенсивной физической нагрузки, в литературе не описаны, и их изучение весьма актуально и проводится впервые.
Гипотеза:
Предполагается, что работа максимальной аэробной мощности проводит к запуску процессов срочной адаптации организма: происходят изменения концентраций ростовых факторов в крови и увеличивается экспрессия генов раннего ответа. Мониторинг концентраций ростовых факторов и экспрессии мРНК генов раннего ответа в условиях физиологических тестирований различной интенсивности представляет собой новую диагностическую технологию оценки функциональных резервов организма.
Цель исследования:
Оценка влияния работы максимальной аэробной мощности на систему ростовых факторов человека: гормона роста и инсулиноподобного фактора роста 1, а также на экспрессию мРНК генов раннего ответа.
Задачи исследования:
1. Получение моно- и поликлональных антител против рекомбинантного гормона роста человека и разработка иммуноферментной (ИФА) тест-системы определения его концентрации в сыворотке крови человека;
2. Разработка методов и подходов к определению соотношения изоформ гормона роста в сыворотке крови человека;
3. Определение изменений концентраций гормона роста и его изоформ, инсулиноподобного фактора роста 1 и инсулиноподобного фактора роста связывающего белка 3 (ИФРСБЗ) после нагрузок максимальной аэробной мощности;
4. Анализ экспрессии мРНК генов раннего ответа в лейкоцитах крови спортсменов до и после работы максимальной аэробной мощности.
Научная новизна:
Впервые проведено комплексное исследование влияния работы максимальной аэробной мощности на систему ростовых факторов и генов раннего ответа человека.
Разработана иммуноаффинная методика определения изоформ гормона роста в сыворотке крови, а также ИФА тест-система определения его суммарной концентрации с использованием полученных в работе моно- и поликлональных антител против рекомбинантного гормона роста (рГР).
Проанализированы образцы сывороток спортсменов после работы максимальной аэробной мощности и впервые показано, что концентрация ГР значительно увеличивается после нагрузки, а соотношение изоформ ГР остается неизменным. Концентрация ИФР1 в сыворотке выше у более подготовленных спортсменов; также наблюдается тенденция к увеличению общего содержания ИФР1 и ИФРСБЗ после нагрузки.
Впервые проведено исследование экспрессии на мРНК-чипах всех генов человека до и после нагрузки максимальной аэробной мощности и определены группы генов, вовлеченных в ранний ответ организма на физический стресс.
Теоретическая значимость:
Работа направлена на решение фундаментальных проблем адаптации организма спортсмена к нагрузкам максимальной аэробной мощности.
Изучены процессы ответа организма на стресс, а также запуск механизмов активации генов ранней экспрессии. Разработанные методики определения концентраций и соотношений изоформ гормонов открывают возможности для детального изучения влияния физиологического стресса на систему ростовых факторов, что важно для мониторинга утомления и восстановления в современной восстановительной медицине.
Практическая значимость:
Разработанные методики определения ростовых факторов могут быть использованы для оценки подготовленности спортсменов к нагрузкам различной интенсивности и применяться в диагностике нарушений и патологий.
Используемые подходы к детектированию изоформ гормона роста могут быть применены в анализе биологических образцов на присутствие экзогенных субстанций, при допинг-контроле сложных полипептидных субстанций.
Методики оценки экспрессии мРНК генов раннего ответа необходимы при разработке новых подходов к мониторингу физического состояния спортсменов, процессов тренировки и восстановления; при проведении анализа воздействия нагрузок на организм и оценке его функциональных резервов. Результаты исследования внедрены в работу кафедры спортивной медицины ФГУ РГУФКСиТ и кафедры физического воспитания и спорта МГУ имени М.В. Ломоносова, что подтверждено актами о внедрении. Перспективным является также внедрение результатов настоящей работы в диагностических и лечебно-профилактических медицинских учреждениях.
Результаты работы опубликованы в 4 статьях.
Ростовые факторы и гены раннего ответа (Обзор литературы)
Физиологические системные эффекты реакции организма человека на интенсивную физическую нагрузку изучены достаточно хорошо (Меерсон Ф.З., 1988; Adlercreutz Н., 1986; Tremblay M.S., 2004). Физические нагрузки и сопряженные с ними эффекты психологического стресса, кислородного голодания и изменения гомеостаза затрагивают практически все системы организма. Компенсаторные реакции, направленные на восстановление и регуляцию гомеостаза и, как следствие, срочной или долговременной адаптации к физическим нагрузкам, запускаются и регулируются взаимодействием центральной нервной и гипоталамо-гипофизо-адреналовой систем. Гормон роста является одним из основных белков, секретируемых гипофизом и участвующих в процессах клеточного роста и анаболизма. Секреция гормона роста вызывает увеличение в крови концентрации других ростовых факторов, в том числе инсулиноподобного фактора роста.
Физические нагрузки высокой интенсивности приводят к запуску каскадных процессов адаптации организма, в том числе активируют систему гормон роста - инсулиноподобный фактор роста, и оказывают влияние на экспрессию мРНК генов, вовлеченных в клеточный ответ на стресс.
Гормон роста
Человеческий гормон роста (ГР, СТГ, соматотропин) - белок, обладающий метаболическими эффектами и влияющий на развитие и рост различных тканей (Рис. 1). Ген гормона роста человека hGH-N (GH1), состоящий из 66.5 т.п.н., локализуется на длинном плече 17 хромосомы. В геноме человека имеется кластер из пяти родственных генов: GH-1, GH-2, CSHL1, CSH1 и CSH2 с высоко консервативными последовательностями. У всех генов направление транскрипции одинаково: с 5 - до 3 - конца. Все пять генов в кластере содержат по пять экзонов и по четыре интрона.
Синтез ГР происходит, в основном, в соматотропных клетках гипофиза, где его экспрессия регулируется гормонами гипоталамуса (соматостатин и ГР-высвобождающий гормон) и фактором транскрипции Pit-1 (Kooijman R., 2000). В меньшей степени экспрессия ГР происходит также в периферической крови, в лейкоцитах (Hattori N., 2001; Weigent D.A., 1989; Wu Н., 1996) и в других тканях организма.
Экспериссия гена GH-2 происходит в плаценте, в результате чего образуется белок, который доминирует в организме в период второго триместра беременности (Lewis U.J., 1992). В данном обзоре расмотрен только ГР кодируемый геном GH-1.
Гипофизарный и лейкоцитарный ГР обладают различными функциями в организме: первый стимулирует метаболизм и мышечный рост (Barkan A.L., 2007; Giustina А., 1998), в то время как второй участвует в развитии лимфоидных и миелоидных клеток (Hattori N., 2001; Wu Н., 1996).
Уровень секреции ГР зависит от времени суток и физической активности человека (Veldhuis J.D., 2008). При нахождении в состоянии покоя в течение дня происходят несколько разных по интенсивности выбросов ГР в кровь. Наибольшие импульсы наблюдаются во время сна приблизительно через час после засыпания (Felsing N.E., 1992; Giustina А., 1998; Scacchi М., 1999; Surya S., 2006), а также через 30 мин после начала интенсивных физических упражнений (Tuckow А.Р., 2006). Более высокий базальный уровень экспрессии ГР, а также большая интенсивность и продолжительность пиковых выбросов, наблюдается у детей; с возрастом оба этих показателя постепенно снижаются (Рис. 2)(Holt R.I., 2001; Sherlock М., 2007).
В состоянии покоя концентрация ГР в крови взрослого человека составляет порядка 3 нг/мл, во время пиковых выбросов может подниматься до 5-35 нг/мл и даже выше. При указанных выбросах концентрация ГР остается высокой на протяжении 10-30 мин, затем постепенно возвращается к базальным значениям. (Surya S., 2006; Veldhuis J.D., 1995). Возрастная закономерность наблюдается и в ответе на физические нагрузки: интенсивность пиковых выбросов гормона значительно ниже у людей среднего возраста (40-45 лет), чем у более молодых субъектов (20-25 лет) (Veldhuis J.D., 1995;ZaccariaM., 1999).
Для того, чтобы отделить эффекты снижения активности гипофиза при старении от эффектов, связанных с увеличением жировой массы, было проведено сравнение четырех групп добровольцев: молодых с недостаточным и избыточным весом и среднего возраста с недостаточным и избыточным весом (по индексу массы тела [вес/рост ]) (Holt R.I., 2001).
Антитела против гормона роста, аффинные сорбенты и конъюгаты антител
При введении в организм животных чужеродных белков в крови появляются защитные белки - антитела, для которых характерна высокая специфичность. Антитело обладает способностью избирательно связываться с антигеном. Каждое антитело узнает только свой антиген, точнее, одну его детерминантную группу (эпитоп). Эпитоп состоит из нескольких аминокислот (обычно из 6-8), образующих пространственную структуру, характерную для данного белка. В одном белке, состоящем из нескольких сотен аминокислот, имеются несколько (5-15) разных детерминант, поэтому к одному белку образуется целое семейство различных по своей специфичности антител. Даже к одному эпитопу образуется целый спектр антител, отличающихся по структуре, степени специфичности и прочности связывания. В крови иммунизированных животных появляется богатый и уникальный по составу спектр антител, который и обеспечивает их абсолютную специфичность в распознавании данного антигена.
Задачей первого этапа исследования являлось получение, наработка и очистка антител против рекомбинантного гормона роста человека, а также получение биотинилированных антител, конъюгатов и аффинных сорбентов. Высокоактивные очищенные антитела необходимы для использования в ИФА тест-системах и в экспериментах иммуноблоттинга для определения изоформ гормона роста.
Выравнивание аминокислотных последовательностей
Для выбора лабораторных животных, которые будут иммунизированы для получения антисывороток, было проведено выравнивание аминокислотных последовательностей гормона роста различных организмов.
Выравнивание аминокислотных последовательностей проводили при помощи программного пакета Jalview 2.2. (Clamp М., 2004). Гормон роста мыши и кролика обладают высокой консервативностью. После отщепления сигнального пептида 1-26 а.к., наблюдаются 12 похожих аминокислотных замен.
Выравнивание аминокислотных последовательностей гормона роста человека, мыши и кролика показало наличие некоторых консервативных участков, а также большое количество несинонимичных аминокислотных замен (Рис. 14). Таким образом, иммуногенность рекомбинантного ГР человека при иммунизации кроликов и мышей, высока.
На Рис. 15 показана зависимость иммуногенности препрогормона роста (24 кДа) от его аминокислотной последовательности, рассчитанная с использованием метода предсказания линейных В-клеточных эпитопов на основе частоты аминокислотных пар и метода опорных векторов. Три наиболее иммуногенные области белка выделены красным.
20 кДа изоформа ГР, образующаяся в результате альтернативного сплайсинга, отличается от 22 кДа изоформы отсутствием аминокислот в положениях 58-72 (Рис. 15, область выделена прямоугольником). Таким образом, 20 кДа изоформа не содержит вероятный эпитоп и обладает сниженной иммуногенностью. Известны три сайта фосфорилирования в 22 кДа изоформе (Ser77, 132, 176) (Hepner F., 2005). Два сайта фосфорилирования Ser77 и Serl76 находятся в наиболее иммуногенных областях белка (Рис. 15, указаны стрелками). 1,0 ї. 0 200 Рис. 15. Иммуногенность препрогормона роста. Таким образом, 22 кДа рекомбинантный гормон роста является наиболее иммуногенным. Все дальнейшие иммунизации лабораторных животных проводили именно этим белком.
Моноклинальные антитела
Для получения мАТ против гормона роста человека проводили иммунизацию самок мышей линии Balb/c (опытно-племенной питомник лабораторных животных при НИИ биомоделей РАМН, Россия) рекомбинантным гормоном роста человека Genotropin (Pfizer).
Первую и вторую иммунизации для усиления иммунного ответа проводили в присутствии полного и неполного адъюванта Фрейнда, соответственно. Затем проводили многократную стимуляцию антигенами в ФСБ (Таблица 7).
Вторую иммунизации проводили с интервалом в 6 недель, третью — через 4 недели, следующие - с интервалом в 1 месяц. Антигены с адъювантами вводили по 0.5 мл/мышь подкожно и внутримышечно, растворенные в ФСБ антигены вводили по 1 мл/мышь подкожно, внутримышечно и внутрибрюшинно.
Качество иммунизации оценивали по титру антител в сыворотках, который определяли в ИФА. После четвертой иммунизации титр антител против соответствующих антигенов в сыворотках составлял не менее 1-50000 (Рис. 16).
Нагрузочное тестирование и концентрация ростовых факторов
Физические упражнения различной интенсивности являются классическим примером стресса для организма, запускающего процессы адаптации, в которых участвуют эндокринная, нервная и иммунная системы. В кровь выбрасываются различные гормоны и нейромедиаторы, вызывающие запуск каскадных механизмов в организме. Упражнения на выносливость обладают наибольшими пролиферативными и анаболическими эффектами на мышцы и соединительные ткани (Kraemer W.J., 1996; Nindl B.C., 2001).
Маркерами, которые проявляются в процессе или после физических упражнений, являются различные соединения: Низкомолекулярные соединения: глюкоза, лактат, пируват, глицерин, свободные жирные и аминокислоты и т.д.; Стероиды: адренокортикотропный гормон, тестостерон, кортизол, эстроген и т.д.; Пептидные гормоны: инсулин, гормон роста и его рилизинг факторы, инсулиноподобные факторы роста и связывающие их белки.
В процессе адаптации организма к нагрузкам наиболее важны гормоны гипотоламо-гипофизарной системы: нейропептиды, нейротрансмиттеры, рилизинг-гормоны, ингибирующие гормоны, негландотропные и гландотропные гормоны. Понимание процессов адаптации организма к физическим нагрузкам остается весьма актуальной задачей (Coffey V.G., 2007а; Coffey V.G., 2007b; Kraemer W.J., 1996; Pedersen B.K., 2000). Особое внимание уделяется гормональной системе, влияющей на рост и пролиферацию и наиболее важному представителю гипотоламо гипофизарной системы, участвующему во многих процессах организма — гормону роста.
Участники исследований, спортсмены квалификации не ниже КМС, дали письменное информированное согласие на проведение экспериментов и использование полученных результатов. Перед каждым нагрузочным тестированием проводили осмотр кардиологом и регистрацию ЭКГ.
Все участники исследований (мужчины, п=52, 21.2±3.6лет, 73.2±15.6кг, 175.7±18.7 см) подвергались нагрузочному тестированию. Работу со ступенчато повышающейся мощностью проводили на беговой дорожке или велоэргометре. В процессе упражнения измеряли показатели газообмена, давление, частоту сердечных сокращений, концентрацию лактата и рассчитывали значение максимального потребления кислорода (МІЖ). Тест продолжали до невозможности поддерживать спортсменом заданную скорость ленты. Венозную кровь отбирали до и после тестирования.
По данным потребления кислорода и концентрации лактата (4 мМ) рассчитывали индивидуальный порог анаэробного обмена ДПАНО) для спортсменов, а также время работы после анаэробного порога. Среднее значение МПК составляло 64.0±7.2 мл/мин/кг.
Сыворотки всех спортсменов до и после физической нагрузки анализировали на содержание кортизола, КФК, ACT, АЛТ и других биохимических маркеров для стандартизации полученных результатов и оценки общего физического состояния спортсменов.
Известно, что КФК, ACT и АЛТ обнаруживаются в сыворотке при повреждении мышечных волокон. По данным КФК, АЛТ и ACT признаков повреждения кардиомиоцитов и скелетных мышц у спортсменов до начала и после окончания тестирования не выявлено. Наблюдали лишь незначительное увеличение активности ферментов, что может свидетельствовать о минимальных повреждениях мышечных клеток. Существенных отличий между спортсменами по данным показателям во всех исследованиях не наблюдали.
Кортизол играет ключевую роль в защитных реакциях организма на стресс. Он обладает катаболическим действием, и его количество в крови и слюне может служить маркером стресса организма. Концентрация кортизола в крови и слюне у спортсменов после тестирования достоверно увеличивалась. Значения других биохимических показателей спортсменов были в пределах среднепопуляционных значений. Таким образом, в исследованиях принимала участие гомогенная группа спортсменов.
Во всех образцах определяли концентрацию гормона роста с использованием разработанной ИФА тест-системы. Значения ГР до и после нагрузочного тестирования представлены на Рис. 46. Причины большого разброса концентраций ГР после нагрузочного тестирования обсуждены позже. До нагрузки уровень ГР, за исключением нескольких спортсменов, находился в пределах нормы в состоянии покоя (до 2 нг/мл). У шести спортсменов в состоянии покоя до нагрузочного тестирования концентрация ГР превышала 2 нг/мл, что можно объяснить периодичностью секреции ГР в течение дня.
Значения концентраций ГР до и после нагрузки были усреднены. Было найдено, что уровень ГР после нагрузки максимальной аэробной мощности значительно увеличивается (Рис. 47). С использованием U критерия Манна-Уитни для нормальных распределений была рассчитана достоверность различий значений до и после нагрузки. Поскольку рассчитанный критерий р 0.001, различия в концентрации ГР до и после нагрузки достоверны.
Гены раннего ответа
Физические нагрузки высокой интенсивности приводят к запуску процессов экстренной адаптации организма. Ключевую роль в их регуляции играет активация системы генов раннего ответа (ГРО). Основной особенностью ГРО является быстрое изменение их экспрессии в ответ на широкий ряд стрессорных факторов.
Для анализа экспрессии мРНК генов раннего ответа был выбран современный метод, состоящий в гибридизации меченных олигонуклеотидов на чипе и детекции флюоресценции комплиментарных проб. Данный метод позволяет оценивать экспрессию мРНК всех генов инактивация человека и проводить широкий скрининг адаптационных процессов в организме. Основные признаки генов раннего ответа: 1. Активация напрямую через стрессорные факторы либо через внутриклеточные сигнальные каскады; 2. Быстрое изменение экспрессии (самое раннее - через 10 мин после начала интенсивной физической нагрузки). Верхней границей временного интервала условно считают 30 мин; 3. Регуляция экспрессии большого количества других, более «медленных» генов, определяющих специфический ответ организма на стресс; 4. Быстрая после окончания воздействия стрессового фактора.
Исследование экспрессии мРНК генов раннего ответа проводили у 9 спортсменов (мужчины, п=9, 29.3±13.4 лет, 70.6±5.6 кг, 175.6±4.8 см, МПК/кг 57.7±3.3). Для этого дополнительно до и после нагрузочного тестирования на беговой дорожке у добровольцев отбирали кровь для выделения мРНК.
Тотальную мРНК выделяли согласно протоколу производителя с использованием набора PAXgene Blood RNA Kit. Для исключения отжига праймеров на геномной ДНК образцы обрабатывали ДНКазой. Качество выделенной мРНК - RIN (RNA Integrity Number) оценивали на биоанализаторе Agilent 2100 Bioanalyzer. Для всех образцов РНК RIN превышает 8.
Меченая кРНК была синтезирована согласно протоколу, рекомендованному Affymetrix. 100 нг тотальной РНК, выделенной из лейкоцитов крови, были использованы в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной кДНК. Часть полученной кДНК была использована для синтеза биотин-меченной кРНК методом обратной транскрипции.
Полученная биотинилированная кРНК была фрагментирована на участки длиной 70-100 нуклеотидов и гибридизована на чипе HuGene 1.0 ST Array (Affymetrix) при температуре 45С и перемешивании в течение 16 часов в гибридизационной печи. После гибридизации чипы отмывали от несвязавшейся кРНК и окрашевали стрептавидин-фикоэритрином на станции Fluidics Station 450 (Affymetrix). Окрашенные чипы сканировали на сканере GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).
Оценку качества гибридизации, отмывки и окрашивания чипов производили с помощью программного пакета Gene Expression Console (Affymetrix). Все внутренние контроли на чипах соответствовали нормам, указанным производителем.
Девять спортсменов были разбиты на две группы для выявления генов, которые участвуют в передаче клеточных сигналов, и экспрессия которых увеличивалась в результате физической нагрузки (Таблица 14). Группы не отличались по МПКУкг.
Образцы мРНК четырех лыжников, полученные до и после нагрузки (Группа 1, Таблица 14) были проанализированы дважды. Полученные с помощью Affymetrix Command Console интенсивности проб были импортированы в среду R и обработаны с помощью библиотеки XPS. Экспрессию рассчитывали с помощью реализованного в XPS алгоритма RMA (Irizarry R.A., 2003а; Irizarry R.A., 2003b). Для каждой пары точек до -после были рассчитаны значения логарифма по основанию 2 отношений экспрессии гена после нагрузки к экспрессии гена до нагрузки. С помощью библиотеки limma была рассчитана моделируемая t-статистика этих величин с учетом «технических» копий (Smyth G.K., 2004; Wettenhall J.M., 2004). Для расчета FDR (False Discovery Rate) значения вероятности р были скорректированы поправкой Бенжамини-Хохберга. В результате эксперимента, при FDR равном 0.05, были отобраны 780 генов, экспрессия мРНК которых достоверно увеличивается в результате физической нагрузки. Эксперимент был проведен дважды для снижения случайной технической погрешности (пипетирование, сканирование и т.п.), а также для проверки воспроизводимости результатов.
Функциональное кластерирование с помощью системы DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) показало, что большинство отобранных генов можно отнести к следующим группам: системы внутриклеточной передачи сигнала, регуляция пролиферации и апоптоза, клеточный ответ на стресс.
