Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современные представления о стрессовых белках и их роли в патогенезе различных заболеваний (обзор литературы)
1.1. Система белков теплового шока и ее роль в биологических процессах 11
1.1.1. Общая характеристика и классификация белков теплового шока 11
1.1.2. Функции белков теплового шока в норме и в стрессированных клетках 18
1.1.3. Роль белков теплового шока в патогенезе различных заболеваний 24
1.2. Перспективность биологической медицины 25
1.2.1. Клеточная терапия 25
1.2.2. Целесообразность использования клеточной трансплантации при атеросклерозе 27
1.2.3. Участие белков теплового шока в генезе атеросклеротического процесса 30
Глава II. Материалы и методы
2.1. Экспериментальная часть 34
2.2. Методы исследования 37
2.3. Адекватность модели атеросклероза 42
Глава III. Исследование уровня БТШ 70 в клеточных трансплантатах 45
Глава IV. Содержание белков теплового шока (БТШ 70) и морфологические изменения в печени, миокарде и головном мозге при экспериментальной гиперхолестеринемии 50
4.1. Морфологические исследования и изменение уровня БТШ 70 в печени экспериментальных животных 50
4.2. Морфологические исследования и изменение уровня БТШ 70
в миокарде экспериментальных животных 55
4.3. Морфологические исследования и изменение уровня БТШ 70
в головном мозге экспериментальных животных 59
Глава V. Влияние клеточной трансплантации на морфологические изменения и уровень белков теплового шока (БТШ 70) в органах-мишенях при экспериментальной гиперхолестеринемии 66
5.1. Морфологические исследования и уровень БТШ 70 в печени животных при трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на фоне экспериментальной гиперхолестеринемии 66
5.2. Морфологические исследования и уровень БТШ 70 в миокарде животных при трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на фоне экспериментальной гиперхолестеринемии 71
5.3. Морфологические исследования и уровень БТШ 70 в головном мозге животны при трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на фоне экспериментальной гиперхолестеринемии 75
Заключение. Патогенетическое обоснование механизмов воздействия трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на содержание белков теплового шока (БТШ 70) при
экспериментальной гиперхолестеринемии 82
Выводы 94
Практические рекомендации 95
Библиография 96
- Система белков теплового шока и ее роль в биологических процессах
- Перспективность биологической медицины
- Морфологические исследования и изменение уровня БТШ 70 в печени экспериментальных животных
- Морфологические исследования и уровень БТШ 70 в печени животных при трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на фоне экспериментальной гиперхолестеринемии
Введение к работе
Выявлена активная роль этих белков в физиологии клетки, цитопротекции, формировании стресс-индуцируемых регуляторных цепей. Активное участие в важнейших процессах клетки является свидетельством того, что белки теплового шока играют ведущую роль в обеспечении репарации и деградации, а нарушение функционирования этих белков может явиться одной из причин дисфункции и повреждения органов и тканей. Обнаружено участие стрессовых белков в различных патологических процессах, в том числе атеросклерозе (Xu Q.,2001).
Известно, что Россия по смертности от заболеваний, в основе которых лежат атеросклеротические повреждения сосудистой стенки, занимает одно из первых мест в Европе (Оганов Р. Г., 2002).
Существующие методы коррекции гиперхолестеринемии, как одного из детерминирующих факторов атерогенного процесса, включающие хирургические вмешательства, эфферентную терапию, фармакологическое воздействие на различные звенья синтеза холестерина в организме, способствуют лишь временной стабилизации патологического процесса (Чазов Е.И., 1998). В этой связи представляется актуальной проблема поиска более эффективных методов лечения атеросклероза. Сегодня новые биомедицинские технологии в решении этой проблемы связаны с
использованием клеточной трансплантации. Оригинальные лечебные
биотехнологии заключаются в трансплантации стволовых,
низкодифференцированных эмбриональных или зрелых соматических клеток, способных восстанавливать функции пораженных патологическим процессом органов и тканей (Сухих Г.Т., 2002).
Известно, что ключевыми патогенетическими звеньями атерогенного процесса являются нарушения обмена липопротеинов, интенсификация перекисного окисления липидов (Климов А.Н., 1999). Вышеперечисленные факторы оказывают кроме прочего и стрессовое воздействие на органы-мишени атерогенеза, вызывая повреждения внутриклеточных структур, в частности белковых молекул. Участие белков теплового шока в этом процессе описано многими авторами (Kanwar R.K., 2001; Snoeckx L.H.E.H., 2001; XuQ., 2002).
Накоплены весьма убедительные экспериментальные и клинические данные, указывающие на снижение активности атеросклеротических изменений при клеточной трансплантации (Голдобина А.В., 1998; Курильская Т.Е., 1999; Никифоров СБ., 2000; Grompe М.С., 2001; Ohashi К.Е., 2001). Вместе с тем, механизмы саногенетического эффекта клеточной трансплантации весьма далеки от окончательного понимания.
На уровне сегодняшних представлений белки теплового шока многими авторами расцениваются как часть или целое внутриклеточной стресс-лимитирующей системы, способствующей защите клетки от повреждения (Меерсон Ф.З., 1993; Малышев И.Ю., 1998; Шевченко ЮЛ., 1999; Xu Q., 2001). В связи с этим представляет научный и практический интерес выяснение степени участия белков теплового шока в процессе клеточного повреждения при хроническом стрессовом воздействии в виде гиперхолестеринемии, а также влияние на этот процесс клеточной трансплантации.
Цель исследования: изучить влияние трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на динамику содержания белков теплового шока с молекулярной массой 70 кДа в печени, миокарде и головном мозге в процессе развития экспериментальной гиперхолестеринемии.
Задачи исследования:
1. Оценить влияние различных условий культивирования клеток и способа
консервации трансплантата на содержание в нем белков теплового шока
(БТШ 70). Определить стационарный уровень БТШ 70 в печени, миокарде
и головном мозге кроликов.
Изучить динамику морфологических изменений и концентрации БТШ 70 в печени, миокарде и головном мозге экспериментальных животных в различные сроки развития гиперхолестеринемии.
Выявить особенности изменения содержания БТШ 70 в исследуемых органах при превентивной и отсроченной трансплантации неонатальных гепатоцитов.
Определить взаимосвязь количества БТШ 70 с уровнем морфологических нарушений в органах-мишенях и степенью выраженности экспериментальной гиперхолестеринемии у животных при внутривенной трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов.
Научная новизна: В результате проведенного исследования в неонатальных клетках печени впервые обнаружено наличие белков теплового шока, количество которых можно увеличивать с помощью культивирования при повышенных температурах. Установлено, что способ консервации трансплантата не влияет на содержание БТШ 70 в нем.
Продемонстрировано наличие разных уровней стрессовых белков в печени, миокарде и головном мозге здоровых животных. Получены оригинальные данные, свидетельствующие об изменении стационарного
уровня БТШ 70 и морфологических нарушениях в исследуемых органах при экспериментальной гиперхолестеринемии. Показано, что в условиях атерогенного процесса в печени, миокарде и головном мозге экспериментальных животных трансплантация неонатальных гепатоцитов способствует приближению уровня БТШ 70 к стационарным значениям и уменьшению морфологических нарушений в данных органах.
Получены данные, свидетельствующие о том, что превентивная трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов в большей степени способствует нормализации измененного в результате атерогенеза уровня БТШ 70, чем трансплантация на фоне развивающейся гиперхолестеринемии.
Теоретическая и практическая значимость работы: Результаты эксперимента позволяют рассматривать белки теплового шока в качестве компанента системы адаптации различных органов к хроническому повреждающему воздействию.
Установлено, что внутривенное введение неонатальных гепатоцитов оказывает влияние на внутриклеточные защитные механизмы, приближая уровень БТШ 70 в исследуемых органах к стационарным показателям и обеспечивая этим органам большую сохранность в процессе развития гиперхолестеринемии. Полученные данные являются свидетельством того, что клеточная трансплантация оказывает протекторный эффект и на внутриклеточном уровне.
Положения, выносимые на защиту:
1. Культура гепатоцитов неонатального кролика содержит белки теплового шока с молекулярной массой 70 кДа, количество которых может быть увеличено путем культивирования при повышенных температурах. Способ консервации клеточного трансплантата (криопрезервация, лиофилизация) существенно не изменяет в нем уровень БТШ 70.
В условиях экспериментальной гиперхолестеринемии стационарное содержание БТШ 70 изменяется: в печени исходный уровень данных белков понижается, в миокарде и головном мозге - увеличивается. При этом регистрируется нарастание морфологических нарушений в исследуемых органах.
Трансплантация аллогенных неонатальных гепатоцитов в условиях экспериментальной гиперхолестеринемии способствует нормализации уровня БТШ 70 и снижению степени морфологических изменений в исследуемых органах.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: восьмом Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов, (г. Москва, 19-22 ноября 2002 г.); Международном конгрессе «Реабилитация в медицине и иммунореабилитация», (Анталия, 27 апреля - 3 мая 2003 г.); Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование», (Турция, 19-25 мая 2003 г.); пятом конгрессе с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении», (Египет 19-25 апреля 2003 г.); седьмой ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, (Москва, 25-27 мая 2003 г.); пятом съезде иммунологов и аллергологов СНГ, (Санкт-Петербург, 5-11 июля 2003г.); Международном междисциплинарном конгрессе "Прогрессивные научные технологии для здоровья человека", (Кара-Даг, Украина, 8-19 июня 2003г.); Северо-западной Международной конференции по проблемам внезапной смерти, (Санкт-Петербург, 14-16 октября 2003 г.); четвертой научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины», (Иркутск, ноябрь 2003г.); научной конференции молодых ученых, посвященной Дню основания РНЦХ РАМН «Новое в реконструктивной хирургии», (Москва, 19 марта 2004г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 статьи - в отечественных журналах, 8 тезисов и статей - в материалах российских и международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, включая введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных наблюдений, заключение, практические рекомендации и выводы. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 22 рисунками. Библиография содержит 156 источников, из них 59 - отечественных и 97 — зарубежных авторов.
Система белков теплового шока и ее роль в биологических процессах
В 1962 г. F. A. Ritossa в ответ на тепловой шок обнаружил активацию хромосом в клетках слюнной железы Drosophila [136]. Аналогичная активация генома наблюдалась и при использовании некоторых других стрессовых воздействий [57]. Среди протеинов, синтез которых увеличивался, был обнаружен белок с молекулярной массой 70 кДа (БТШ 70). Позднее были выделены другие, сходные по молекулярной массе и строению протеины, которые сформировали семейство белков БТШ 70 [57]. Предварительно подвергнутые мягкому тепловому воздействию, клетки в последующем могли переносить более тяжелое термическое повреждение, при этом термотолерантность к повреждению коррелировала с повышенным синтезом БТШ [24]. Было установлено, что после воздействия теплового шока клетки приобретали устойчивость не только к последующему более сильному тепловому воздействию, но и к другим видам стресса (ишемия, этанол, соли тяжелых металлов). Этот феномен получил название «кросс-толерантность» [57].
Метаболический ответ на тепловое воздействие, подобный тому, который был обнаружен у Drosophila, выявлен у широкого круга организмов - от бактерии до человека [28]. Фактически все изученные организмы синтезируют белки, подобные БТШ, при повышении температуры, что свидетельствует об универсальности феномена БТШ, которая основывается на их высокой консервативности (60 - 78% гомологии между белками эукариоти 40-60 % гомологии между белками прокариот) [57].
В сущности, термин «белки теплового шока» принято считать неточным, так как еще М. S. Ellwood и Е. A. Craig (1984 г.) показали, что синтез этих белков стимулируется и Холодовыми воздействиями [83]. Вследствие этого, данный класс пептидов в равной мере можно было назвать «белками холодового шока». В дальнейших исследованиях было показано, что синтез белков теплового шока повышается при самых разных стрессорных воздействиях: при обработке клеток арсенатом натрия и аналогом пролина [147], острой ишемии миокарда [121], остром гипоксическом воздействии [77], аноксии [141]. Усилению синтеза БТШ способствуют следующие факторы: инфекция, воспаление, лихорадка, ультрафиолетовое облучение, алкоголь, гипер- и гипоосмолярность, алкалоз, ацидоз, перекись водорода, хемотерапевтические агенты, мутагены, канцерогены, тератогены, анестетики, никотин, металлы (Cd2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+), фенол и его производные, процессы дифференцировки [24]. Поэтому более компромиссным обозначением для этого класса белков является название «стресс-белки». Сейчас очевидно, что и этот термин не отражает всей сути клеточной роли этой группы пептидов, так как в целом спектре различных исследований было показано, что белки из этого класса, с молекулярным весом 70 кДа, выполняют важную роль в формировании таких адаптивных реакций, как термотолерантность и ранняя стадия компенсаторной гипертрофии миокарда [28]. В соответствии с этим их можно было назвать «белками адаптации». Тем не менее, термин «белки теплового шока» уже получил широкое распространение в литературе и научных кругах. Сегодня, используя этот термин, имеют в виду белки с аббревиатурой hsp (heat shock proteins) или БТШ (белки теплового шока).
С середины 80-х годов XX столетия возрос интерес к изучению функций стрессорных белков. На сегодняшний день признается биологическая роль БТШ 70 в патогенезе ревматоидного артрита, инфекционных заболеваний, токсических отравлений, лучевой болезни [57]. Установлено, что эти белки накапливаются в эндотелии сосудов, пораженных атеросклеротическим процессом [62]. Достаточное число публикаций посвящено изучению кардиопротективных свойств БТШ 70 при ишемических и реперфузионных повреждениях миокарда [23, 24, 28, 57, 97, 135]. Представляют интерес исследования, которые демонстрируют прямую корреляцию между уровнем БТШ 70 и степенью миокардиальной защиты после гипертермического воздействия у экспериментальных животных [57]. Более детальное изучение физиологической роли этой группы БТШ и их вовлечение в процесс кардиопротекции при инфаркте миокарда крайне важны для понимания адаптационных возможностей кардиомиоцита при его ишемии.
В эволюционном отношении БТШ являются высококонсервативными белками, что свидетельствует об их фундаментальных клеточных функциях [28]. Самая большая гомология в аминокислотной последовательности БТШ разных видов обнаружена в ЫНг-терминалях, Показано, что этот регион содержит АТФ-азную активность. СООН-конец, напротив, вариабелен и контролирует субстратную специфичность, то есть узнавание определенных белков, с которыми связывается БТШ [70]. Наличие АТФ-азной активности в Мі -терминалях и субстратной специфичности в вариабельной СООН-терминали позволяет белкам теплового шока функционировать как АТФ-аза на множестве субстратов. Наличие неконсервативной СООН-области определяет некоторое различие в функциях белков теплового шока в разных клетках у разных видов [28].
В соответствии с молекулярной массой все БТШ разделены на 6 основных семейств:
1. Высокомолекулярные БТШ (100-110 кД);
2. БТШ 90 (83-90 кД);
3. БТШ 70 (66-78 кД);
4. БТШ 60; 5. БТШ40;
6. Низкомолекулярные БТШ (15-30 кД) [24].
Установлено, что все БТШ делятся на конститутивные (с высоким базальным уровнем и слабой индукцией при стрессе) и индуцибельные (в нормальных условиях практически не обнаруживаются, а при стрессе их синтез резко повышается).
Конститутивные БТШ играют важную роль во многих клеточных процессах: росте и дифференцировке [75], свертывании белков и образовании олигомерных структур [128], АТФ-зависимом раскрывании клатрин-клеточных везикул [138], функционировании стероидных рецепторов и тирозиновых киназ [66], процессах ДНК-репликации [82], переносе секреторных и органельных белков через мембраны митохондрий, микросом и эндоплазматического ретикулума [81].
Из-за чрезвычайно высокой насыщенности стрессированных тканей белками теплового шока с молекулярным весом 70 кДа и их явным эволюционным консерватизмом, эти белки являются предметом многих исследований. Семейство БТШ 70 млекопитающих включает 4 белка: БТШ 72, БТШ 73, ГРБ 75 и ГРБ 78 [57]. Структурно эти белки похожи, но в тоже время они являются продуктами разных генов, имеют различную внутриклеточную локализацию и реакцию на тепловой шок [28].
БТШ 72 — основной белок, индуцируемый различными стрессорными факторами (тепловым шоком, солями тяжелых металлов и аналогами аминокислот, ишемией). Локализуется в основном в цитоплазме, при определенных условиях обнаруживается в ядре. При стрессе участвует в предотвращении денатурации/агрегации цитоплазматических, ядерных и мембранных белков, а также в разборке агрегатов денатурированных белков в период восстановления после стресса. БТШ 73 - конститутивный белок цитоплазмы и ядра, участвует в лизосомальной деградации белков, биосинтезе, сборке и транслокации полипептидов, транспорте нуклеофильных белков.
Перспективность биологической медицины
Клеточная терапия
Благодаря развитию в последние 25-30 лет методов культивирования соматических и стволовых клеток, генной инженерии и молекулярной биологии значительно расширились возможности целенаправленного воздействия на физиологические функции организма. Внутри- и межвидовой перенос клеток открывает новые подходы к изучению эмбрио- и органогенеза. Пересадка специализированных соматических клеток является способом заместительной клеточной терапии иммунодефицитов, наследственных дефектов клеточного метаболизма, острой недостаточности функций органов и все шире применяется для внутриутробной коррекции наследственных дефектов [40].
Определение "клеточная трансплантация" или "клеточная терапия" в современном контексте означает использование аллогенных и ксеногенных стволовых, эмбриональных, фетальных клеток в лечебных целях. Необходимо дифференцировать использование живых клеток с заместительной функцией, стимулирующей отдельные клоны клеток в организме человека, и комплекса БАВ с системным биологическим воздействием на организм. В последнем случае клеточная терапия, выполняет, вероятно, роль индуктора генерации каскадных биохимических реакций организма, за счет имплантации спектра биологически активных соединений в наиболее сбалансированной для организма естественной природной композиции. Последнее практически невозможно создать с использованием комплекса синтезированных фармакологических препаратов [59].
В настоящее время получены убедительные доказательства того, что эффективность применения алло- и ксеногенных клеток обусловлена не только восстановлением этими субстратами утраченной функции гомологичного органа, но и регулирующим воздействием на функцию поврежденного органа комплексом БАВ, продуцируемым донорским материалом [40].
Научные основы клеточной и тканевой терапии, а также терапии БАВ были заложены фундаментальными исследованиями по биологии развития и иммунологии процессов адаптивного роста, пролиферации и их нарушений (Токин Б.П. [53], Воронцова М. А. [9], Полежаев Л. В. [36, 37, 38], Бабаева А.Г.[6]). Благодаря этим исследованиям была доказана органоспецифичность "дистантного" влияния клеточных и тканевых трансплантантов на гомологичные органы и ткани. Открыт способ индукционного восстановления утраченной способности органов и тканей к регенерации.
Сегодня новые биотехнологические разработки с региональными и эмбриональными стволовыми клетками позволяют производить специализированные клетки человека как для создания искусственных органов, так и для целей клеточной терапии в количествах, необходимых для современной медицины. Эти лабораторные биотехнологии дают возможность полностью разрешить проблему первичного материала, который, наиболее уязвим в плане биоэтики. Основным средством лечения ряда болезней человека станет информация, которая находится в геноме человека и может быть реализована через технологии с эмбриональными стволовыми клетками [26,27, 55, 142].
В научных работах, представленных в материалах двух национальных симпозиумов, посвященных вопросам трансплантации фетапьных (эмбриональных) тканей и клеток человека, прошедших в России (г.Москва) в 1996 и 1998 гг., а также ряде других конференций и конгрессов, показано, что клеточная терапия сегодня имеет действительно определенные клинические достижения в ряде трудноизлечимых заболеваний у человека. В то же время, молекулярные механизмы лечебных эффектов клеточной терапии в современных аспектах научных знаний изучены недостаточно. Целесообразность использования клеточной трансплантации при атеросклерозе
Исходя из существующих представлений о патогенезе атеросклероза и коронарной болезни сердца в настоящее время наибольшее внимание уделяется воздействию на процессы гиперхолестеринемии и дислипидемии: от диетических программ национального масштаба, использования гапохолестеринемических препаратов до хирургических вмешательств, направленных на изменение метаболизма холестерина в организме [20, 22,42].
Сегодня одной из главных причин неудовлетворенности клиницистов в предупреждении прогрессирования атеросклероза и лечении ИБС является несовершенство представлений о нарушениях метаболизма, лежащих в основе этого патологического процесса, которые не ограничиваются только нарушениями липидного обмена [136]. Используемые в настоящее время лекарственные препараты и энтеросорбенты, имеющие своей целью стабилизацию липидов крови, нельзя признать идеальными, что побуждает вести поиск новых оригинальных подходов к воздействию на данный патогенетический блок коронарного атеросклероза и ИБС. В литературе обсуждается вопрос воздействия экстракорпоральных методов лечения на различные звенья патогенеза атеросклероза [35]. Однако и они далеки от совершенства в виду кратковременности ожидаемого результата, необходимости частых повторных процедур, ряда осложнений [42].
Принципиально новый подход к лечению больных с атеросклерозом обеспечивают методы биологической медицины и, в частности, трансплантация клеточного биоматериала. Одной из важных характеристик клеточной терапии является возможность использования биосубстрата в форме инъекционной имплантации [42]. Терапевтической целью имплантации является снабжение биохимическими субстанциями и энзимами, а также содержащимися в них неорганическими элементами в их естественном состоянии и концентрации, для того, чтобы дать возможность больному организму скорректировать структурные дефекты и дисфункции. Для этого предлагаются соответствующие клеточные структуры.
Многочисленные исследования показали, что ключевые патогенетические звенья атерогенного процесса интегрируются в печени [18, 32, 34]. Весомым аргументом является объективно регистрируемая метаболическая дисфункция этого органа при атеросклерозе в эксперименте и клинике. В настоящее время считается, что при атерогенезе сосудистая стенка является органом-мишенью, в котором реализуются процессы, обусловленные поражением печени [17, 29, 30]. В этой связи представляется перспективной активация компенсаторных антиатерогенных механизмов в печени методом клеточной трансплантации.
Морфологические исследования и изменение уровня БТШ 70 в печени экспериментальных животных
Согласно результатам морфологического анализа, у животных группы контроля (стандартная диета вивария) структурных изменений в печени не наблюдалось.
В экспериментальной группе №2 (атерогенная диета) на 45 сутки видимых нарушений в печени обнаружено не было. К 90 дню на некоторых участках ткани печени появлялась мелкокапельная центролобулярная жировая дистрофия гепатоцитов. На 180 сутки эксперимента у животных с моделью гиперхолестеринемии наблюдали выраженный липоидоз гепатоцитов, который оценивали по бальной системе, что допускается при использовании полуколичественного метода оценки изменений [1, 52]. Так при максимальной оценке в 5 баллов, уровень липоидоза гепатоцитов в группе с атерогенной диетой составил 4,24+0,59 балла. Кроме того, для данной группы было отмечено незначительное сужение просвета крупных печеночных сосудов, образовавшееся за счет разбухания гепатоцитов. На исследованных гистологических препаратах печени животных этой группы выявлялись гепатоциты с тотальной крупнокапельной жировой дистрофией Полученные результаты согласуются с данными В.А. Нагорнева [29, 30] и отражают индуцированные холестериновой диетой нарушения компенсаторных антиатерогенных механизмов в печени. Существенным аргументом в пользу этого являются данные анализа параметров липидного обмена в крови (высокий уровень общего холестерина, дисбаланс липоротеинов ЛПНП и ЛПВП) у животных с моделью гиперхолестеринемии.
Анализ исследования уровня БТШ 70 в печени животных, находящихся на стандартной диете вивария (группа контроля), обнаружил базовый уровень данных белков (3,50+0.007 УЕ), который практически не изменялся на протяжении всего эксперимента (Рис.5).
В группе животных с моделью гиперхолестеринемии на 45 сутки эксперимента было обнаружено снижение уровня БТШ 70 до отметки 0.70+0.008 УЕ, что в 5 раз ниже относительно исходного значения. Далее в ходе эксперимента в этой группе животных наблюдалось увеличение уровня БТШ 70: на 90 сутки 1.50+0.008 УЕ, на 180 сутки 2.10+0.02 УЕ. Однако, и на 180 сутки эксперимента уровень БТШ 70 в печени животных группы №2 (экспериментальная гиперхолестеринемия) оставался ниже стационарного в 1,7 раза (Рис. 5).
Многочисленные исследования показали, что основным метаболическим регулятором показателей, вовлеченных в патогенез атеросклероза (липопротеины, гемостаз, ПОЛ), является печень [18, 34]. Весомым аргументом является объективно регистрируемая метаболическая дисфункция клеток паренхимы печени при атеросклерозе в эксперименте и клинике.
Известно, что, несмотря на высокую консервативность белков теплового шока, механизмы стрессорной активации синтеза белков теплового шока характеризуются высокой тканевой специфичностью [28]. Так Blake М. J. и соавт. в исследованиях in vivo установили, что максимальный синтез БТШ 70 в мозге, коже и легких крыс наблюдается примерно через один час после теплового шока, а в печени через 6 часов. При этом количественно наиболее интенсивное накопление БТШ 70 наблюдается в мозге и легких, а в печени и коже оно снижено в несколько раз [64]. Возможно, уменьшение уровня БТШ 70 в печени кроликов, находящихся на атерогенной диете по отношению к исходу как-то связано с тканеспецифичностью экспрессии этих белков.
Следует также учитывать тот факт, что печень и кожа в нормальных условиях являются активно пролифилирующими органами. Следовательно, их регенераторный потенциал существенно выше по отношению к другим органам. Кроме того, печень по отношению к другим органам обладает высокой белково-синтетической функцией. Об этом свидетельствует и высокий стационарный уровень БТШ 70 в этом органе. Нарушение этой функции при запуске атерогенного процесса, вероятно, сказывается и на синтезе БТШ 70, который заметно снижается в группе с экспериментальной гиперхолестеринемией. Незначительное увеличение уровня данных белков в этой группе животных в динамике эксперимента (45, 90, 180 сутки), возможно, связано с постоянно нарастающей нагрузкой на печень, клетки которой сопротивляются процессу атерогенеза, в том числе и через повышение синтеза БТШ 70. Однако, как было показано выше, даже к 180 суткам эксперимента уровень БТШ 70 остается значительно ниже в сравнении с таковым в печени здоровых животных, что, свидетельствует о наличии нарушений в функционировании этого органа.
Морфологические исследования и уровень БТШ 70 в печени животных при трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов на фоне экспериментальной гиперхолестеринемии
Известно, что печень выполняет ключевую роль в процессе развития гиперхолестеринемии [18, 32]. Как было показано выше (глава 4), у животных, находящихся на атерогенной диете, наблюдали выраженный липоидоз гепатоцитов и снижение уровня белков теплового шока (БТШ 70). В группах животных с внутривенной трансплантацией аллогенных неонатальных гепатоцитов (группа №3 - до начала атерогенного процесса; группа №4 - на фоне развивающейся гиперхолестеринемии) на 45 и 90 сутки эксперимента были обнаружены единицы набухших гепатоцитов, сужения крупных печеночных сосудов не наблюдали. На 180 день в этих группах липоид оз гепатоцитов был менее выражен в сравнении с животными группы № 2 (атерогенная диета) и составил 2,9+0,5 балла (в группе с моделью гиперхолестеринемии - 4,2+0,6 балла) (Рис. 13).
Кроме того, у животных с трансплантацией неонатальных гепатоцитов, как превентивной, так и на фоне гиперхолестеринемии, на 180 сутки эксперимента атерогенные изменения сосудов печени (сужение просвета крупных сосудов за счет набухания гепатоцитов) практически отсутствовали, тогда как в группе с моделью гиперхолестеринемии сужение просвета данных сосудов было отмечено.
Таким образом, при внутривенной трансплантации аллогенных неонатальных гепатоцитов происходит уменьшение липоидоза гепатоцитов, индуцированного экспериментальной гиперхолестеринемией, и на этом фоне исчезает сужение просвета крупных печеночных сосудов. Это свидетельствует об активации в данном органе под влиянием клеточной трансплантации компенсаторных антиатерогенных механизмов, к которым, вероятно, относится и активация системы белков теплового шока.
Получены результаты, свидетельствующие о влиянии трансплантации неонатальных гепатоцитов на содержание белков теплового шока (БТШ 70) в печени животных, находящихся на атерогенной диете. Как показано ранее, в группе животных с моделью гиперхолестеринемии уровень БТШ 70 был значительно ниже в сравнении с группой контроля, что, по-видимому, связано с повышенной нагрузкой на печень во время атерогенеза. В группах с трансплантацией неонатальных гепатоцитов уровень данных белков повышался и его показатели приближались к стационарным. Причем, в группе с превентивной трансплантацией неонатальных гепатоцитов уровень БТШ 70 был наиболее приближен к контрольным значениям в сравнении с группой, где трансплантацию проводили на 6 сутки от начала атерогенной диеты (Табл. 6),
Так на 45 сутки уровень БТШ 70 в группе №3 (трансплантация до начала атерогенной диеты) составлял 4.0+0.008 УЕ, что даже превышало стационарный уровень (Табл.6). На 90 день эксперимента уровень данных белков в этой группе составлял 3.48+0.005 УЕ (практическое соответствие группе здоровых животных), а к 180 суткам снизился до 3.1+0.006 УЕ, что, вероятно, говорит об уменьшении внутриклеточных изменений, вызванных атерогенной диетой. В группе №4 (трансплантация на фоне развивающейся гиперхолестеринемии) значения БТШ 70 были выше в сравнении с группой №2 (атерогенная диета), но все же оставались пониженными по отношению к показателям у здоровых животных.
Таким образом, на фоне уменьшения жировой дистрофии гепатоцитов в группе животных с внутривенной трансплантацией неонатальных гепатоцитов было отмечено увеличение уровня БТШ 70 и приближение его к показателям здоровых животных. Возможно, что положительный эффект трансплантации для печени, как органа с основной нагрузкой при гиперхолестеринемии, обусловлен среди прочих механизмов и активацией системы белков теплового шока, которые в данном случае выступают как звено адаптации исследуемого органа к повреждениям, вызванным атерогенной диетой.
Анализ морфологических изменений в печени не выявил достоверных различий между группами с превентивной и отсроченной трансплантацией неонатальных гепатоцитов. Но изменения уровня БТШ 70 в этих группах различались, причем было отмечено наибольшее соответствие стационарным значениям в группе с превентивной трансплантацией гепатоцитов (группа №3). Исходя из полученных результатов по содержанию БТШ 70 в печени, можно предположить, что предпочтительнее по биоэффективности оказывается превентивная трансплантация в сравнении с отсроченной. Вероятно, это связано с тем, что орган с дополнительными биологически-активными компанентами, которые были привнесены в него трансплантируемыми клетками до воздействия стрессирующего фактора, способен легче переносить нагрузки, вызванные атерогенным процессом.
