Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Белок теплового шока с молекулярным весом 70кДа и его связывающий кошаперон СБ1 9
Глава 2. Организация, материалы и методы исследования 46
Глава 3. Получение моноклональных антител 56
Глава 4. Получение поликлональных антител 68
Глава 5. Разработка иммунохимической системы определения СБ1 в сыворотке 74
Глава 6. Определение экспрессии мРНК белка СБ1 и уровня концентраций СБ1 и его белка мишени после нагрузочного тестирования со ступенчато повышающейся мощностью «до отказа» 82
Глава 7. Базальный уровень концентраций СБ1 и его белка мишени в сыворотке спортсменов в течение конечного мезоцикла подготовительного периода 86
Глава 8. Исследование уровня аутоиммунных антител, направленных к белкам СБ1 и БТШ70 в сыворотке спортсменов 92
Заключение 94
Выводы 97
Практические рекомендации 97
Список литературы 99
Приложение.
- Белок теплового шока с молекулярным весом 70кДа и его связывающий кошаперон СБ1
- Организация, материалы и методы исследования
- Получение моноклональных антител
- Разработка иммунохимической системы определения СБ1 в сыворотке
Введение к работе
Важнейшими составляющими спортивной успешности являются физическая подготовленность и адаптация спортсменов к мышечным нагрузкам на всех этапах спортивной деятельности. Современный спорт требует высоких результатов на грани физических возможностей человека, вследствие чего организм подвергается большому количеству стрессовых факторов: гипоксия, гипертермия, оксидативный стресс, воспаление и повреждение, изменение концентрации кальция и аденозинтрифосфата [Benjamin I.J., 1998; Whithman М., 2008], что обуславливает необходимость более детального мониторинга спортсменов в тренировочной и в восстановительной фазе, разработки новых критериев адаптации, позволяющих охарактеризовать эффективность не только систем срочной адаптации к интенсивным физическим нагрузкам, характерным для соревновательного периода, но и долгосрочной адаптации в процессе тренировочного периода.
Физические нагрузки являются сигналом для активации семейства белков теплового шока, так называемых белков-маркеров стресса. Главной функцией, которых является сворачивание синтезированных полипептидов, предотвращение денатурации белков, их агрегации [Soufi F.G., 2008].
Наиболее изученным является белок теплового шока с молекулярным весом 70кДа (БТШ70). Он является внутриклеточным белком, но в ответ на оксидативный стресс, повышение температуры, воспаление или физиологический стресс, его концентрация стремительно возрастает и в крови [Сахаров Д.А., 2009]. БТШ70 - АТФ-связывающий белок, обладающий АТФазной активностью. АТФ-связывающая форма белка имеет низкое сродство к денатурированному белку, в то время как АДФ форма напротив прочно связывается с поврежденным белком, восстанавливая его структуру. Поэтому АТФазная активность определяет функциональные возможности БТШ70.
БТШ70-связывающий белок - СБ1 является кошапероном БТШ70 и регулятором нуклеотидного обмена. Взаимодействие СБ1 с АТФазным доменом белка мишени (БТШ70) в клетке влечет за собой его конформационные изменения, в результате чего происходит инактивация БТШ70-зависимого восстановления структуры поврежденных белков [Raynes D.A., 1998]. Также было показано, что после запуска механизма секреции внеклеточных белков - шаперона БТШ70 и его кошаперона СБ1 происходит активация рецептора ЭФР (эпидермальный фактор роста), который регулирует рост и пролиферацию клеток. Возможно, данная СБ1/БТШ70 зависимая активация рецептора может служить защитным механизмом для клеток в стрессовых условиях [Evdonin А., 2009].
Таким образом, физическая нагрузка приводит к увеличению концентрации БТШ70 [Locke М., 2002], функциональные возможности которого детерминируются изменением концентрации его кошаперона СБ1. Однако, до настоящего времени не определена роль белка СБ1 в сыворотке крови и не исследовано соотношение концентраций СБ1 и его белка мишени в крови спортсменов в условиях адаптации к физическим нагрузкам.
Гипотеза.
Предполагается, что физические нагрузки активируют механизм секреции семейства белков теплового шока и их кошаперонов. Адаптация к физическим нагрузкам различной длительности сопровождается изменением концентрации БТШ70, что приводит к увеличению концентрации его кошаперона СБ1 в крови. Белок СБ1 является новым маркером отражающим реакции адаптационных процессов. Исследование молекулярного маркера СБ1 и изучение его регуляции иммунохимически и на уровне транскрипции позволит приблизиться к пониманию механизмов адаптации спортсменов к физическим нагрузкам.
Цель исследования.
Изучение роли кошаперона СБ1 в процессе адаптации высококвалифицированных спортсменов к физическим нагрузкам различной длительности. Разработка новых критериев оценки адаптационных процессов на основе концентрации СБ1. Задачи исследования;
Получить моноклональные и аффинные поликлональные антитела против человеческого рекомбинантного белка СБ1;
Разработать тест-систему определения концентрации СБ1 в сыворотке крови человека;
Проанализировать экспрессию мРНК гена СБ1 в лейкоцитах и концентрацию этого белка в сыворотке крови спортсменов под влиянием кратковременной физической нагрузки;
Исследовать влияние тренировочного мезоцикла на концентрации СБ1 и БТШ70 в сыворотке крови спортсменов. Разработать критерий оценки адаптационных процессов на основе концентрации СБ1;
Разработать тест-систему, позволяющую определять уровень аутоантител к СБ1 в сыворотке человека. Определить уровень аутоиммунных антител против СБ1 и БТШ70 в сыворотке спортсменов.
Объект исследования. Процессы молекулярно-биохимической адаптации организма спортсменов к напряженным физическим нагрузкам.
Предмет исследования. Система регуляции кошаперона и белка теплового шока.
Научная новизна.
Новизна работы состоит в исследовании изменения концентраций маркера адаптации СБ1 под влиянием физических нагрузок.
Разработана иммуноаффинная методика определения кошаперона СБ1 в сыворотке человека. С использованием разработанной тест-системы впервые было показано, что работа со ступенчато повышающейся мощностью «до отказа» не вызывает изменения экспрессии и концентрации СБ1 в сыворотке на фоне увеличения экспрессии и концентрации его белка мишени. Впервые были получены данные об изменении концентрации СБ1 у спортсменов в течение тренировочного процесса. Впервые было показано, что соотношения концентраций СБ1 и БТШ70 является показателем адаптации спортсменов к физическим нагрузкам. У более выносливых спортсменов, за период длительного тренировочного процесса, уровень СБ1 повышается, в то время как уровень БТШ70 снижается и выходит на базальный уровень. У менее выносливых спортсменов за тот же период времени концентрация СБ1 не изменяется, на фоне увеличения концентрации БТШ70. Выявлена корреляция между кошапероном СБ1 и его аутоантителами.
Теоретическая значимость.
Данные исследования расширяют знания о фундаментальных основах процессов жизнедеятельности и восстановления организма на молекулярном уровне. Исследование новых белков-маркеров стресса и изучение их регуляции позволит приблизиться к пониманию механизмов адаптации, возникающих в стрессовых условиях и дальнейшего восстановления организма. Материалы исследования могут быть использованы в научно-исследовательских центрах медико-биологического профиля, в высших учебных заведениях.
Практическая значимость.
Разработанная иммуноаффинная методика позволит определять концентрацию кошаперона СБ1 в сыворотке. Установленная связь между концентрацией СБ1, БТШ70 и функциональными параметрами спортсменов, что является новым маркером подготовленности и адаптации к физическим нагрузкам. Расширенные возможности медико-биологического подхода, могут быть использованы для мониторинга реакции организма на стресс, рекомендовано к применению в учреждениях спортивного профиля и в медицинских центрах сборных команд для оценки функциональных резервов спортсменов, активации молекулярных механизмов адаптивной реакции организма, а также определения индивидуального прогресса спортсменов.
Результаты диссертации внедрены в работу Государственного образовательного учреждения Московского среднее специального училища олимпийского резерва (ГОУ МСС УОР) №2 г.Москвы отделения академической гребли и ООО «Союз биатлонистов России», что подтверждено актами внедрения.
Основные положения выносимые на защиту:
Разработана высокочувствительная тест-система, на основе поликлональных антител, которая позволяет определять концентрацию белка СБ1 в сыворотке крови;
Изменение концентрации белка СБ1, под воздействием длительных физических нагрузок, является маркером долгосрочной адаптации;
Выявлена обратная зависимость между концентрациями СБ1 и БТШ70 в сыворотке высококвалифицированных спортсменов в конце мезоцикла подготовительного периода. Предложен новый критерий оценки адаптационных возможностей организма.
Белок теплового шока с молекулярным весом 70кДа и его связывающий кошаперон СБ1
Одной из важнейших задач является изучение циркулирующих в крови человека белков и регуляции их концентраций. До сих пор не известна полная протеомика сыворотки человека. В крови присутствует большое количество белков, с помощью которых осуществляются различные виды регуляций, передача полезных веществ, энергии, предохранение от повреждений в стрессовых условиях, выживание. Одними из жизненно важных является семейство белков теплового шока (БТШ), также их называют белками стресса. Дальнейшее изучение БТШ показало, что эти белки не только активируются при стрессе, но и функционируют как молекулярные шапероны, в нормальных условиях стабилизируют, сворачивают и перемещают белки. БТШ находятся в цитозоле, митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме и ядре. В семейство БТШ входят белки с молекулярными массами от 15 до ПО кДа. Наиболее изученными у эукариот являются белки БТШ с молекулярными массами 60, 70, 90 и 110 кДа, играющие важную роль во внутриклеточных процессах - от предотвращения апоптоза до фолдинга и внутриклеточного перемещения белков.
Они высоко консервативны и присутствуют во всех прокариотических и эукариотических клетках (миоцитах скелетной, сердечной мускулатуры, клетках печени, мозга, иммунной системы) [Morton J.P., 2009]. Такая высокая степень консервативности обусловлена необходимостью взаимодействия БТШ70 с большим количеством других белков, а также многообразием его функций. Они ответственны за регуляцию фолдинга синтезированных полипептидов, предотвращение рефолдинга белков и их агрегацию, участвуют в иммунной реакции, в защите от окислительного стресса, теплового, холодового шока, гипоксии и цитотоксичных факторо [Bukau В.,2000; Frydman J., 2001; Hartl F.U. and Hayer-Hartl M.,2002].
Наиболее интересным является белок с молекулярным весом 70кДа (БТШ70). Он присутствует в клетках, составляя 1-1,5% общего клеточного белка, что указывает на постоянную потребность клетки в этом белке и выполняемых им функций.
Уровень концентрации БТШ70 возрастает в ответ на следующие факторы: гипертермия, гипоксия, гипероксия, воспаление, повреждение, ишемия, повышенный метаболизм и внутриклеточный кальций, свободные радикалы и реакционноспособные частицы кислорода, уменьшение гликогена и аденозинтрифосфата, ацидоз. Повышение уровня концентрации БТШ70 в сыворотке приводит к активации иммунной системы (макрофагов, цитокинов, нейтрофилов, тучных клеток). Было показано, что увеличение БТШ70 обеспечивает защиту во время теплового удара благодаря увеличению уровня БТШ70 в периферической сосудистой системе и сердечных миоцитах. БТШ70 увеличивает толерантность клеток к воспалению, и повышают устойчивость фибропластов при температурном воздействии.
Главной функцией БТШ 70 является связывание с денатурированными белками, и участие в дальнейшем их сворачивание в более устойчивую нативную форму. Также они ответственны за предотвращение денатурации белков, их агрегацию [Williams J.H.H., 2007] и необходимы клетке для обеспечения механизмов адаптации и предотвращения апоптоза в стрессовых условиях [Soufi F.G., 2008].
БТШ70-АТФ связывающий белок, обладающий АТФазной активностью. Молекула БТШ70 состоит из N-терминального АТФазного домена, с молекулярным весом 45 кДа, и С-терминального пептид связывающего домена - 15 кДа, который узнает гидрофобный сигнальный пептид неправильно свернутого или денатурированного белка (субстрат). Между этими доменами находится область альфа спиральной «крышки». Когда БТШ70 связан с АТФ, «крышка» открыты для связывания с поврежденным или вновь синтезированным белком, при взаимодействии БТШ70 с АДФ «крышка» закрывается.
АТФазный домен состоит из двух субдоменов одного размера I и И. Нуклеотид связывается с белков в углублении между двумя субдоменами (Рис.1).
Каждый субдомен поделен на еще два поддомена а и b. [Flaherty К. М., 1990; Mayer М. Р., 2001]. АТФ-связывающая форма белка имеет низкое сродство к денатурированному белку, в то время как АДФ форма напротив прочно связывается с поврежденным белком, восстанавливая его структуру. Поэтому АТФазная активность определяет функциональные возможности БТШ70. В регуляции его активности принимает участие комплекс белков так называемые кошапероны. Один из них БТШ40, стимулирует АТФазную активность БТШ70, увеличивает скорость АТФ гидролиза, белок переходит в АДФ форму и тем самым возрастает сродство к субстрату. Белок Hip предотвращает диссоциацию АДФ формы и стабилизирует связь с субстратом [Hohfeld J., 1995]. Другой белок Нор является инициатором связи между БТШ70 и БТШ90 [Johnson B.D., 1998]. БТШ90 и Нор в свою очередь могут участвовать в активации БТШ70 (рефолдинге денатурированных белков). Есть другие регуляторные белки, которые являются ингибиторами, например RAP/HAP46 ингибирует связывание денатурированного белка с БТШ70, а белок BAG1 участвует в диссоциации АДФ формы БТШ70, снижая сродство к субстрату [Zeiner М., 1997; Bimston D., 1998; Hohfeld J., 1997]. BAG1 взаимодействуя с субдоменом lb блокирует АТФазный домен БТШ70 в открытой форме, которая сопровождается отклонение на 14 вдоль субдомена ПЬ, в подвижной области, с переориентацией субдомена Іа в N-терминальном домене [Harrison C.J., 1997; Sondermann Н., 2001]. Два этих домена важны для правильной ориентации нуклеотида и взаимодействуют друг с другом как зажим для него [McLellan С.А., 2003].
Организация, материалы и методы исследования
В работе для получения моноклональных антител использовали: самок мышей линии Balb/c; полный и неполный адъюванты Фрейнда (ПАФ и НАФ) (Difco laboratories, США); антитела козы против иммуноглобулинов мыши (GAMI), конъюгаты стрептавидина и GAMI с пероксидазой хрена (Sigma, США); о-фенилендиамин (Sigma, США). Для получения гибридом использовали: миеломные линии клеток Sp2/0, среду культивирования RPMI1640, пируват, аминокислоты, витамины, гипоксантин, тимидин, аминоптерин все выше перечисленные культуральные растворы фирмы Invitrogen-GIBCO (США), фетальную сыворотку (Bioclot, США), флаконьі(Огеіпег,США), 24- и 96-луночные планшеты для клеточных культур (Corning, USA). МоноАТ выделяли из асцитных жидкостей с помощью колонки «Sephadex G-25» (GE Healthcare, Германия), ионообменной хроматографии на колонке «Mono Q» (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция), оптическое поглощение измеряли на спектрофотометре Single Path Monitor UV-1 (Pharmacia Fine Chemicals, Швейцария).
Для получения поликлональных антител использовали: кроликов породы шиншилла (3-4 кг), активированную сефарозу (Thermo, США), цианборгидрид (Sigma,CIIIA), конъюгат стрептавидин-пероксидазы и конъюгат антител козы против иммуноглобулинов кролика (Sigma,CIIIA), тетраметилбензидин (Thermo,CIIIA). Детекцию оптической плотности осуществляли на ИФА спектрофотометре xMark (Bio-Rad, США) при 450 нм.
Электрофоретическое разделение белков проводилось на приборе Mini-Protein Tetra Cell (Bio-Rad, США). Для иммуноблоттинга использовали: мембрану из поливиниледенфторида (ПВДФ) Immobilon-P (Millipore, США), прибор Semi Dry Trans-Blot Cell (Bio-Rad, США) для переноса белков из геля на мембрану, хемилюминисцентный коммерческий набор SuperSignal WestPico (Pierce, США), детектор хемилюминисцентного сигнала ChemiDoc XRS (Bio-Rad, США), программное обеспечение Quantity One (Bio-Rad, США). Все применявшиеся химические реактивы были качества ч.д.а.
В исследовании принимали участие 10 юношей, систематически занимающихся академической греблей и 10 юношей, систематически занимающихся лыжными гонками, более шести лет, квалификации не ниже КМС, относящихся к одной возрастной группе и имеющих свойственные специализации размеры тела (Табл. 1)
Исследование проводили на протяжении 28 дней конечного мезоцикла подготовительного периода. Все спортсмены проходили осмотр кардиологом и давали письменное согласие на участие в экспериментах и использование полученных данных. Исследования были одобрены этическим комитетом ФГУВНИИФК.
За три дня до начала воздействия тренировочного фактора и через два дня после спортсмены проходили нагрузочное тестирование со ступенчато повышающейся мощностью на беговой дорожке Venus (начальная скорость ленты 7 м/с, угол наклона - 1 градус, длительность ступени - 10 сек., прибавка скорости - 0,1 км/ч.) и на гребном эргометре Concept II (стартовая мощность 100 Вт, шаг50 Вт, длительность каждой ступени составляла 3 минуты). Работу выполняли до невозможности поддерживать заданную мощность. В процессе теста измеряли показатели газообмена с помощью прибора Oxycon Pro (Viasis). Венозную кровь отбирали до и после тестирования. ЧСС регистрировали с помощью монитора сердечного ритма Polar S610 (Polar). Концентрацию лактата определяли с использованием автоматического анализатора глюкозы и лактата C_Line (Biosen). Концентрацию биомаркеров в сыворотке определяли на автоматическом биохимическом анализаторе HumaStar 300 (Human). Уровень БТШ70 в сыворотке крови спортсменов измеряли с помощью системы на основе иммуноферментного анализа (ИФА), разработанной ранее в лаборатории молекулярной физиологии ФГУ ВНИИФК [Сахаров Д.А., 2009].
Для выделения мРНК венозную кровь собирали в пробирки PAXgene Blood RNATube (PreAnalytiX). мРНК выделяли согласно протоколу производителя с использованием набора PAXgene Blood RNA Kit (PreAnalytiX). Для исключения отжига праймеров на геномной ДНК образцы обрабатывали ДНКазой. Качество выделенной мРНК - RIN (RNA Integrity Number) оценивали на биоанализаторе 2100 Bioanalyzer (Agilent). Обратную транскрипцию проводили с использованием набора для обратной транскрипции (ЗАО «НПФ ДНК-Технология»).
Данные, полученные в работе, обрабатывались с применением статистической программы STATISTICA7 (StatSoft). Для определения достоверности использовали U критерий Манна-Уитни (р 0,05).
Получение моноклональных антител
Рекомбинантный человеческий белок СБ1, были любезно предоставлен проф. Л.П. Сащенко (Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена, Москва, Россия). Рекомбинантный человеческий белок БТШ70 был предоставлен проф. А.Г. Габибовым (Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Москва, Россия).
Молекулярный вес рекомбинантных белков больше на 0,9 кДа, так как на конце они содержат сопроводительную гексагистидиновую аминокислотную последовательность.
Для получения антител проводили анализ иммуногенности белка СБ1. С помощью программы AAPPred, разработанной ранее в лаборатории молекулярной физиологии ФГУ ВНИИФК, позволяющей предсказывать В-клеточные эпитопы на основе частоты аминокислотных пар и метода опорных векторов, было произведено биоинформатическое предсказание иммуногенности белка СБ1. На Рис.12 представлена зависимость иммуногенности белка СБ1 от его аминокислотной последовательности.
Этот анализ показал, что белок имеет три иммуногенные области, к которым преимущественно вырабатываются антитела (Табл.2).
Эти данные позволяют предположить, что полученные далее моноклональные антитела против белка СБ1 могут иметь разные эпитопы.
Высокоактивные очищенные антитела необходимы для создания ИФА тест-системы. Задачей данного этапа исследования являлось получение, наработка, очистка и характеристика моноАТ против рекомбинантного белка СБ1 человека, а также получение модифицированных белков.
Для получения мАт против белка СБ1, иммунизировали мышей линии Balb/c рекомбинантным человеческим белком СБ1. Первую и вторую иммунизацию для усиления иммунного ответа проводили в присутствии адъювантов Фрейнда. Затем проводили многократную стимуляцию антигеном в ФСБ (Табл. 3).
Качество иммунизации оценивали по титру антител в сыворотках, который определяли в ИФА. После четвертой иммунизации титр антител в сыворотках против соответствующего антигена составлял не менее 1:100000.
Гибридомы получали слиянием спленоцитов иммунных мышей (Balb/C) с миеломой Sp2/0 в ПЭГ. Миелому выращивали на среде RPMI1640 с 10% бычьей фетальной сывороткой. Для отбора правильно слившихся гибридом, первичные популяции культивировали две недели на среде ГАТ. В среде ГАТ используется антагонист фолиевой кислоты - аминоптерин. Тетрагидрофолеваая кислота является коферментом, и участвует в биосинтезе пуринов и пиримидинов. Аминоптерин, антагонист фолиевой кислоты, предотвращает образование тетрагидрофолята, и таким образом блокирует процессы биосинтеза путинов и пиримидинов. В клетках существуют обходные пути биосинтеза нуклеотидов, в которых участвуют тимидин, его фермент тимидинкиназа (ТК), гипоксантин и его фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ). При добавлении в среду гипоксантина и тимидина клетки могут нормально синтезировать ДІЖ в условиях, когда основной путь биосинтеза нуклеотидов блокирован аминоптерином. Если клетка имеет дефект по ферментам ТК и ГГФРТ (в случае с миеломой Sp2/0), то в присутствии аминоптерина она погибает, но способна выжить, если её слить с другой клеткой (в данном случае с лимфоцитом), у которой эти ферменты имеются. Таким образом, в слившихся гибридомах идет взаимная комплементация этих ферментов, и они выживают в среде ГАТ, а остальные клетки погибают.
После первых 5 дней супернатанты скринировали при помощи ИФА. Скрининг проводили в системе антиген с антителами сорбированными на плате или антиген с антителами в растворе.
Разработка иммунохимической системы определения СБ1 в сыворотке
Для изучения роли СБ 1 в процессах адаптации к физическим нагрузкам необходимо разработать методические подходы к определению концентрации СБ1. Методики определения СБ1 в сыворотке крови находятся на стадии разработок, поэтому для количественной оценки этого белка на первом этапе использовали сэндвич-ИФА.
Наиболее распространенной методикой определения концентраций белков в гетерогенных образцах является сэндвич-ИФА. Для разработки тест-системы с помощью выбранной методики ИФА использовали рекомбинантный СБ1 и в разных комбинациях моноклональные антитела, а также поликлональные аффинно-очищенные.
Первой комбинацией была система, когда на иммунологическую плату сорбировали первые антитела поликлональные, против рекомбинантного белка СБ1 в концентрации 3 мкг/мл. Далее на плато наносили белок СБ1 в концентрациях от 50 нг/мл до 12,5 нг/мл. После вносили вторые моноклональные антитела меченные биотином, либо без биотина, в концентрации 1мкг/мл. Затем в зависимости от специфики вторичных антител следовала инкубация с конъюгатом стрептавидин-пероксидазы или конъюгатом антител козы против иммуноглобулинов мыши 0,1 мкг/мл (Рис.24-25).
В данной комбинации антител специфического сигнала не наблюдается, вероятно это связано с тем, что поликлональные антитела взаимодействуя с белком СБ1 связываются со всеми доступными эпитопами, и тем самым закрывают доступ к эпитопу на белке для моноклональных антител.
Вторым вариантом комбинации антител была система, когда на иммунологическую плату сорбировали первые антитела моноклональные или поликлональные, против рекомбинантного белка СБ1 в концентрации 3 мкг/мл. Далее на плато наносили белок СБ1 в концентрациях от 50 нг/мл до 12,5 нг/мл. После вносили вторые поликлональные антитела, либо меченные биотином, либо без биотина, в концентрации 1 мкг/мл. Затем в зависимости от специфики вторичных антител следовала инкубация с конъюгатом стрептавидин-пероксидазы или конъюгатом антител козы против иммуноглобулинов кролика 0,1 мкг/мл. Данные представлены на Рис.26-27.
