Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. фармакологические свойства препаратов метаболического типа действия 11
1.1. Общая характеристика 11
1.2. Фармакологические свойства янтарной кислоты и препаратов ее содержащих 14
1.3. Антиоксиданты 35
1.4. Супероксиддисмутаза и препараты на ее основе 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Токсикологические методы 49
2.2. Фармакологические методы 50
2.3. Цитологические методы 58
2.4. Биохимические методы 61
2.5. Статистические методы 63
ГЛАВА 3. Острая токсичность и дерматопротек-торные свойства реамберина, рексода и их сочетания 64
3.1. Острая токсичность 64
3.2 Исследование гистопротекторного действия в опытах на хвостах крыс 67
3.3 Изучение дерматопротекторного действия в условиях ишемии, моделированной кожной складкой в области спины крыс 72
3.4 Исследование дерматопротекторного действия при частичной артериовенозной недостаточности кожно го лоскута в области передней брюшной стенки крыс 76
3.5 Изучение дерматопротекторного действия в условиях аллоксанового сахарного диабета, осложненного экзогенной гиперхолестеринемией в опытах на крысах 82
ГЛАВА 4. Анализ дерматопротекторного действия реамберина, рексода и их сочетаний 89
4.1. Влияние на пролиферативную активность остеобластов и фибробластов крыс 89
4.2. Влияние на перекисное окисление липидов остеобластов и фибробластов крыс 95
4.3. Влияние реамберина на функциональную активность митохондрий в условиях ишемии кожи крыс 101
4.4. Исследование дерматопротекторного и антиокси дантного эффектов рексода в условиях ишемизиро-ванной кожи крыс 110
4.5. Влияние сочетания реамберина и рексода на показа тели цитолитических, энергетических и антиокси-дантных процессов в ишемизированной коже крыс 118
Заключение 127
Выводы 132
Научно-практические рекомендации 134
Список принятых сокращений 135
Список литературы
- Фармакологические свойства янтарной кислоты и препаратов ее содержащих
- Биохимические методы
- Исследование дерматопротекторного действия при частичной артериовенозной недостаточности кожно го лоскута в области передней брюшной стенки крыс
- Влияние на перекисное окисление липидов остеобластов и фибробластов крыс
Введение к работе
Актуальность исследования. Одним из наиболее распространенных в мире заболеваний эндокринной системы является сахарный диабет (СД), составляющий более 50% от всей эндокринной патологии. Количество больных СД с каждым годом неуклонно растет. К настоящему времени зарегистрировано более 230 млн. человек, страдающих СД, что составляет 6% взрослого населения. По прогнозам ВОЗ к 2030 г. в мире число больных СД увеличится до 366 млн. человек. Высокий уровень инвалидизации и смертности от СД (3-е место среди непосредственных причин смерти) определяет его как серьезную медико-социальную проблему, что послужило основанием назвать ситуацию с СД «эпидемией неинфекционного заболевания» (М.И. Балаболкин и соавт., 2005; И.И. Дедов, М.В. Шестакова, 2011; А.С. Аметов, 2011, 2014; Т.А. Мелешкевич и соавт., 2011).
Известно, что СД сопровождается нарушениями периферического кровообращения, которые нередко влекут за собой ишемические повреждения различных органов и тканей, в частности кожи, и как следствие могут вызывать в них серьезные морфофункциональные изменения, вплоть до некротических. Развитие ишемии тканей в значительной мере индуцируется нарушениями микроциркуляции и изменением реологических свойств крови (Е.В. Кижаев, 1983; И.В. Алексанян и соавт., 1984; С.А. Муслимов, 2000; Р.Т. Нигматулин и соавт., 2003; Д.М. Аронов, 2009; Н.А. Данилова, 2010; В.М. Бенсман, 2010; А.С. Аметов, 2011; М.Б. Анциферов, Е.Ю. Комелягина, 2013; J.R. Dushay et al., 2013; R. Vahora et al., 2013).
В основе ишемического повреждения тканей при СД лежит гипоксия, феномен оксидативного стресса, угнетение энергопродукции в клетках и, как следствие, нарушение метаболических процессов (П.А. Галенко-Ярошевский и соавт., 2001; Е.А. Чикобава и соавт., 2002; В.И. Шумаков и соавт., 2002; В.В. Афанасьев, 2005; И.И. Павлюченко, 2005; К.А. Бедросова и соавт., 2013; В.Е. Новиков, О.С. Левчен-кова, 2013; А.С. Аметов, 2014; T.H. Sanderson et al., 2013; P. Zhang et al., 2013).
Несмотря на то, что к настоящему времени созданы лекарственные препараты [-адреноблокаторы – дигидроэрготоксин, фентоламин, тропафен и др.; биогенные стимуляторы биохимических процессов – актовегин и солкосерил; препараты витаминов РР – никотиновая кислота, В1 – тиамин и В2 – рибофлавин; препарат про-стагландина Е1 – алпростадил; антигипоксанты и антиоксиданты – мексидол и ди-бунол], активизирующие в коже микроциркуляцию и обменные процессы (А.В. Покровский и соавт., 1996; М.Д. Машковский, 2010; Ю.Ю. Кирячков, М.В. Полу-эктова, 2012; Д.Н. Нурманбетов и соавт., 2013; L.L. Sukharev, A.A. Guch, 1994), они не всегда проявляют высокую фармакотерапевтическую активность и могут вызывать различные побочные явления [фентоламин и тропафен: ортостатический коллапс, тахикардию, набухание слизистой носа и др.; актовегин и солкосерил: аллергические реакции; витамины РР (покраснение лица и верхней половины туловища, аллергическую крапивницу, парестезии и др.), В1 (аллергические реакции) и В2 (нарушение функции почек, аллергические реакции); алпростадил: снижение артериального давления, головные боли, гиперемию в месте инъекции; мексидол: аллергические реакции, сонливость, сухость во рту и др.; дибунол: аллергические реакции, токсическое поражение печени, повреждения тканей легкого, которые могут инициировать воспалительный процесс и развитие опухолей] (Н.Г. Гусева,
4 2002; С.Г. Бурчинский, 2008; М.Д. Машковский, 2010; М.Б. Плотников и соавт., 2010). Это диктует необходимость поиска и разработки высокоактивных дермато-протекторных средств, повышающих устойчивость кожи в условиях редуцированного кровообращения (РК), особенно инициированного СД (А.В. Тегай, 2004; Т.Н. Хропова, 2004; Е.Н. Багметова, 2005; Ю.Ю. Федченко, 2005; О.Н. Гулевская и со-авт., 2013; В.В. Селецкая, З.К. Ешева, 2013). В этом направлении большой интерес представляют такие препараты метаболического типа действия, как реамберин и рексод.
Реамберин – изотонический сбалансированный детоксицирующий инфузион-ный раствор, в состав которого входит меглюмина натрия сукцинат, синтезированный на основе янтарной кислоты (ЯК). Последняя, как известно, является естественным эндогенным субстратом клетки – интермедиатом цикла Кребса. ЯК улучшает тканевое дыхание, снижает концентрацию лактата, пирувата и цитрата, которые накапливаются в клетке при развитии гипоксии, и усиливает образование энергии, необходимой для обеспечения регенераторных процессов при ишемии тканей (С.В. Оболенский, 2002; Г.Л. Вышковский и соавт., 2004; В.В. Афанасьев, 2005; И.А. Волчегорский и соавт., 2008; Е.Л. Карасулова и соавт., 2013). Натрия сукцинат, как экзогенный адаптоген, повышает резистентность тканей (в том числе и при СД) к повреждающим воздействиям, улучшает окислительно-восстановительные и энергетические процессы в тканях, что обусловливает наличие у него мембраностабилизирующего и противогипоксического действия (П.А. Галенко-Ярошевский и соавт., 2001, 2012; В.В. Афанасьев, 2005; Т.А. Воронина, 2012; В.К. Леонтьев и соавт., 2012; Е.Л. Карасулова и соавт., 2013).
Рексод представляет собой рекомбинантную супероксиддисмутазу (СОД) человека, получаемую по генноинженерной технологии с использованием в качестве продуцента культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae (штамм Y2134). СОД является ферментом антиоксидантной системы (АОС) клеток, защищающим их от токсического воздействия активных форм кислорода (АФК), накопление которых в клетке приводит к развитию таких патологических процессов, как гипоксия, воспаление и др. АФК и свободные радикалы, образующиеся в процессе перекисного окисления липидов (ПОЛ), оказывают воздействие на соединительную ткань (гиа-луронововую кислоту) и на все компоненты клеток, что приводит к угнетению тканевого дыхания, процессов гидроксилирования в микросомах и дисбалансу клеточного метаболизма (П. Щвец, 1996; Н.К. Зенков и соавт., 2001; А.В. Гейниц и со-авт., 2003; Л.А. Дмитриева, Е.П. Просвирова, 2004; А.Ю. Андреев и соавт., 2005; А.В. Ваваев и соавт., 2007; Т.В. Гайворонская, 2008; П.А. Галенко-Ярошевский, В.В. Гацура, 2009; В.В. Селецкая, З.К. Ешева, 2013).
Показано, что СОД удаляет супероксидные радикалы и предотвращает образование гидроксильного радикала и синглетного кислорода, снижает накопление в очаге воспаления нейтрофилов, которые секретируют значительные количества лизосомальных ферментов, разрушающих близлежащие ткани, нормализует окислительные процессы с участием свободных кислородных радикалов и предупреждает разрушение биомембран, связанное с активацией ПОЛ (Р. Бекманн и соавт., 1995; Б.А. Парамонов, 1999; Т.А. Пичукова и соавт., 1999; И.В. Чурилова и соавт., 1999, 2002; А.В. Стефанов и соавт., 2004; Т.В. Гайворонская и соавт., 2007; П.А. Галенко-Ярошевский, В.В. Гацура, 2009; S.M. Drogovoz, L.V. Derimedved, 1998).
Исходя из приведенных данных, представлялось целесообразным исследовать
5 дерматопротекторные (ДП) свойства реамберина, рексода и их сочетания в условиях РК на фоне нормо- и гипергликемии, индуцированной аллоксановым СД (АСД), осложненной экзогенной гиперхолестеринемией (ЭГХ).
Цель работы: выявить дерматопротекторное действие реамберина, рексода и их сочетаний в условиях редуцированного кровообращения на фоне нормо- и гипергликемии, вызванной аллоксановым сахарным диабетом, осложненной экзогенной гиперхолестеринемией.
Основные задачи исследования:
-
Исследовать острую токсичность реамберина [при внутривенном (в/в) введении мышам и крысам], рексода [при в/в и внутрибрюшинном (в/бр) введениях мышам] и их сочетания (при в/в введении крысам).
-
Провести сравнительное исследование влияния реамберина, рексода и их сочетания на выживаемость кожи крыс в условиях РК на фоне нормо- и гипергликемии, индуцированной АСД, осложненной ЭГХ.
-
Изучить влияние реамберина, рексода и их сочетаний на пролиферативную активность и ПОЛ остео- и фибробластов крыс.
-
Исследовать молекулярные механизмы ДП действия реамберина, рексода и их сочетания в опытах на крысах.
Научная новизна. В представленной работе впервые обосновано гистопро-текторное действие реамберина и его сочетания с рексодом – способность повышать выживаемость тканей (кожи) в условиях РК.
Показано, что реамберин и, особенно, композиция реамберин + рексод при парциальной ишемии кожи, моделированной в области хвоста, спины и передней брюшной стенки крыс на фоне нормо- и гипергликемии, индуцированной АСД, осложненной ЭГХ, оказывают ДП (антинекротическое) действие, которое может быть обусловлено активизацией энергетических процессов и повышением резервных возможностей системы антиоксидантной защиты.
Впервые установлено, что при сочетании реамберина с алпростадилом (ваза-простаном) ДП активность последнего существенно увеличивается. Кроме того, сочетание реамберина с рексодом по способности повышать выживаемость кожи в условиях РК практически сопоставимы с вазапростаном.
Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты исследований являются основанием целесообразности клинического изучения реамбе-рина, композиций реамберин + рексод и реамберин + вазапростан в качестве ДП средств при РК в коже, вызванном травматическими повреждениями и СД.
Связь темы диссертации с планом научно-исследовательской работы учреждения. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармакологии ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России «Поиск и изучение кардио-, нейро- и дерматотропных веществ среди гетероциклических соединений и веществ метаболического типа действия» (№ гос. регистрации 01201263450) .
Внедрение в практику результатов исследования. Результаты исследований ДП активности реамберина и его сочетаний с рексодом и вазапростаном внедрены в учебный процесс кафедр фармакологии Кубанского, Ростовского и Волгоградского государственных медицинских университетов.
Композиция реамберин + вазапростан используется в клинической практике кафедр общей хирургии и сосудистой хирургии ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Реамберин, рексод и их сочетания при однократном введении мышам и
крысам проявляют низкую токсичность.
-
В условиях ишемии тканей хвоста, кожи спины и передней брюшной стенки крыс, вызванной нарушением в них кровообращения, реамберин, рексод и в большей мере их сочетание при 1- и 7-кратном введениях обладают гистопротек-торным действием.
-
Вазапростан и, особенно, его сочетание с реамберином при частичной арте-риовенозной недостаточности кожного лоскута (КЛ) передней брюшной стенки крыс повышают его выживаемость. Сочетание вазапростана с рексодом не обладает ДП действием.
-
При артериовенозной недостаточности КЛ передней брюшной стенки крыс на фоне нормо- и гипергликемии, индуцированной АСД, осложненной ЭГХ, сочетание реамберина с рексодом (в/в в течение 14 дней) обладает ДП действием и оказывает нормализующее влияние на углеводный и липидный обмен.
-
Реамберин, рексод и в большей мере их сочетания оказывают протекторное действие на культивируемые остео- и фибробласты крыс при токсическом воздействии на них метаболическими гипоксантами натрия цианидом (NaCN) и 2,4-динитрофенолом (ДНФ).
-
При ишемии кожи, вызванной моделированием кожной складки (КС) в области спины крыс, реамберин, рексод и в большей мере их сочетание активизируют в ней энергетические процессы и повышают резервные возможности АОС.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на расширенных заседаниях (17.11.2010 г., 06.10.2011 г., 23.05.2012 г. и 23.12.2013 г.) Краснодарского краевого отделения Российского научного общества фармакологов с приглашением представителей кафедр фармакологии, клинической фармакологии и функциональной диагностики ФПК и ППС, нормальной физиологии, общей и клинической патофизиологии, биологии с курсом медицинской генетики, клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС, общей хирургии, факультетской хирургии с курсом анестезиологии и реаниматологии, госпитальной хирургии, глазных болезней, пропедевтики и профилактики стоматологических заболеваний, ортопедической стоматологии, хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, стоматологии ФПК И ППС ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России, кафедры анатомии и морфологических дисциплин НОЧУ ВПО КМИ, кафедры органической химии ФГБОУ ВПО «КубГТУ» и Краснодарского филиала ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, а также на конгрессе «Человек и лекарство. Краснодар – 2008» (16 – 18 октября 2008 г., г. Краснодар), VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием по клинической фармакологии, посвященной 90-летию профессора А.А. Столярчука «Клиническая и экспериментальная фармакология метаболических корректоров, органопротек-ция, доказательная медицина» (10 – 11 ноября 2010 г., г. Винница, Украина) и на первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (3 – 5 июня 2013 г., ФГБУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, г. Москва).
Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в выборе направления и разработке дизайна исследования. Все эксперименты проведены ав-
7 тором лично или при его активном участии. Автор самостоятельно проводил статистическую обработку результатов исследований и их анализ, формулирование выводов и рекомендаций, принимал активное участие в подготовке публикаций по результатам работы (авторский вклад составил 80%).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации и 1 монография.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 183 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2 глав с описанием результатов собственных исследований, заключения, выводов, научно-практических рекомендаций, благодарности, списка принятых сокращений, библиографии, включающей 367 источников на русском и 72 – на иностранных языках. Работа содержит 47 рисунков и 22 таблицы.
Фармакологические свойства янтарной кислоты и препаратов ее содержащих
ЯК представляет собой внутриклеточный метаболит, который широко участвует в обменных процессах организма и выступает в качестве субстрата окислительного фосфорилирования в митохондриальном цикле трикарбоновых кислот, выполняя каталитическую функцию, способствует снижению концентрации лак-тата, пирувата и цитрата, уровень которых увеличивается на ранних стадиях гипоксии, и способствует образованию энергии, необходимой для нормального функционирования клеток. Данный интермедиат относится к малотоксичным соединениям и не оказывает мутагенного и тератогенного действия (М.Н. Кондра-шова, 1976; М.Н. Кондрашова и соавт. 1996; Ю.Ю. Ивницкий и соавт., 1998; В.А. Исаков и соавт., 2001; А.Л. Коваленко и соавт., 2001; С.В. Оболенский, 2002; А.Ю. Яковлев, 2008; Л.А. Фаустов, 2009).
В тканях содержание ЯК находится на уровне 0,2 – 0,8 ммоль/кг, а в плазме крови ее концентрация составляет не выше 0,04 ммоль/л (Н.Д. Ещенко, Г.Д. Вольский, 1982; Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин, 1983; В.А. Исаков и соавт., 2001). Окисляясь сукцинатдегидрогеназой (СДГ), ЯК монополизирует дыхательную цепь (А. Ленинджер, 1976), что приводит к быстрому ресинтезу аденозинтрифосфата (АТФ) клетками (М.Н. Кондрашова, 1976; В.А. Исаков и соавт., 2001), и более выраженно, чем другие субстраты цикла Кребса, повышает количество восстановленных митохондриальных никотинамиддинуклеотидов (НАД+), а также стимулирует протекание восстановительных синтезов в клетке и поддерживает транспорт кальция (Е.Б. Окон и соавт., 1976; П.А. Галенко-Ярошевский и соавт., 2001). Ее положительное влияние на функции органов связано с энергизирующим воздействием на функциональное состояние структур, оказывающих центральное регуляторное действие (Г.Ф. Филатова и соавт., 1986; П.А. Галенко-Ярошевский и соавт., 2001). ЯК обладает широким спектром действия, но в чистом виде она плохо проникает через естественные барьеры. Транспортными формами ЯК яв 15 ляются ее натриевые соли, метиловые эфиры, комплексы с N-(1-дезокси-де-глюцитол-1-ил)-N-метиламмонием и некоторые другие соединения (Л.В. Дери-медведь, В.А. Тимченко, 2002).
ЯК способствует нормализации уровня гистамина и серотонина в крови и эпидермисе, а также оказывает благоприятное действие на микроциркуляторное русло, не влияя на уровень артериального давления и функцию сердца (П.А. Га-ленко-Ярошевский и соавт., 1998). Экзогенное введение ЯК при остром инфаркте миокарда приводит к ограничению зоны некроза (П.В. Сергеев и соавт., 1991; Л.Н. Сернов, 1991), при этом наблюдается увеличение биоэлектрической активности сердца, улучшение гемодинамики и повышение толерантности сердца к физическим нагрузкам (В.Н. Анисимов, М.Н. Кондрашова, 1979; В.А. Исаков и со-авт., 2001).
Антигипоксический эффект ЯК основан не только на способности активировать в зоне ишемии сукцинатдегидрогеназный путь ресинтеза АТФ, снижать уровень НАД-зависимых субстратов цикла Кребса и жирных кислот, но и связан со стимуляцией активности цитохромоксидазы, которая является ключевым ферментом дыхательной цепи митохондрий клеток (М.Н. Кондрашова, 1976; И.Р. Саакян, А.Г. Саакян, 1998; В.А. Исаков и соавт., 2001; П.А. Галенко-Ярошевский, В.В. Гацура, 2009; П.Д. Шабанов и соавт., 2010; В.К. Леонтьев и соавт., 2012; Е.Л. Ка-расулова и соавт., 2013; C.В. Cairns et al., 1997; M. Sacamoto et al., 1998).
При парентеральном введении крысам ЯК может предупреждать развитие фибрилляции сердца, не снижая его сократительную активность. Антиаритмическое действие ЯК обусловлено оптимизацией метаболических процессов в миокарде, угнетением процессов ПОЛ и нормализацией коронарного кровообращения (В.А. Исаков и соавт., 2001; П.А. Галенко-Ярошевский и соавт., 2012). Помимо влияния на метаболические процессы, ЯК оказывает действие на калиевый/кальциевый обмен в кардио-миоцитах, что в частности способствует потенцированию противоаритмического эффекта новокаинамида (П.В. Сергеев и соавт., 1991; В.А. Исаков и соавт., 2001; W.J. Malaisse et al., 1993).
В условиях экспериментального шока, вызванного временной остановкой сердца, введение ЯК приводило к снижению уровня свободнорадикальных процессов в мозге и сыворотке крови, способствовало ослаблению деструкции мембранных элементов нейронов. В постреанимационном периоде приводило к нормализации функций ЦНС, к снижению накопления свободнорадикальных продуктов и восстановлению морфологических изменений в крови и в головном мозге (В.А. Исаков и соавт., 2001).
В нервной ткани ЯК синтезируется из ГАМК через образование янтарного альдегида (цикл Робертса) (К.С. Раевский, В.П. Георгиев, 1986; В.А. Исаков и со-авт., 2001) и ее антистрессорный эффект обусловлен противогипоксическим действием, путем воздействия как на транспорт медиаторных аминокислот, так и на увеличение содержания в мозге ГАМК через шунт Робертса (М.Н. Кондрашова, 1976; В.Н. Анисимов, М.Н. Кондрашова, 1979; Е.И. Маевский и соавт., 1989; В.А. Исаков и соавт., 2001).
В условиях экспериментального шока, вызванного массивной кровопотерей, применение ЯК способствовало повышению выживаемости животных и приводило к восстановлению функциональной активности почек (В.А. Исаков и соавт., 2001).
Способность ЯК интенсифицировать утилизацию кислорода тканями и восстановление НАД-зависимого клеточного дыхания (Ю.Ю. Ивницкий, 1994; B.Х. Ваизов и соавт., 1994) характеризует ее антигипоксическое действие. Введение ЯК полностью нейтрализует блокирование дыхательной цепи митохондрий при действии сублетальных доз нитрита натрия (M. Sacamoto et al., 1998).
ЯК способствует повышению устойчивости тканей к воздействию повреждающих факторов (К.С. Васьков, 1989; Е.В. Козырева, 1997; И.Р. Саакян, М.Н. Кондрашова, 1997; П.А. Галенко-Ярошевский и соавт., 2012; Е.Л. Карасулова и соавт., 2013).
Биохимические методы
СОД – активный радикальный фермент, который действует на стадии обра 41 зования АФК и играет ключевую роль в утилизации свободных радикалов и других продуктов оксидативного повреждения клетки (В.А. Гусев, 1978; А.В. Журавлев, 1982; В.В. Соколовский, 1984; Ж.И. Абрамова, Г.И. Оксигендлер, 1985; Е.Б. Бурлакова, 1985; М.В. Биленко и соавт., 1989; Т.А. Девяткина, 1990; М.В. Биленко, 1991; Ю.И. Губский и соавт., 1994; В.В. Абрамченко и соавт., 1995; Н.Г. Гурин, 1997). Она встречается у всех кислородпотребляющих организмов. В биологической среде образуется внеклеточная (экстрацеллюлярная) и внутриклеточная СОД, которая по своей природе относится к металлопротеинам.
В ходе исследований было выделено несколько изоэнзимных форм СОД, которые отличаются друг от друга строением активного центра: Cu-, Zn-содержащая СОД – металлопротеид, состоящий из двух субъединиц, каждая из которых связывает по 1 атому Cu и Zn, локализуется у эукариотов преимущественно в цито-золе эритроцитов, в пространстве между мембранами митохондрий, в цитоплазме и ядре нервных клеток (М.В. Биленко, 1991; Л.Ф. Дмитриев и соавт., 1993; S. Elchuri et al., 2005); Mn-содержащая СОД содержит 4 субъединицы и локализуется в митохондриях печени и миокарда эукариот, рядом с анионными каналами (В.А. Гусев и соавт., 1980; О.Н. Воскресенский, 1985; Л.Ф. Дмитриев и соавт., 1993; А. Ленинджер, 1999; Y. Li et al., 1995); Fe-содержащая СОД найдена в небольших количествах в митохондриях эукариот, в основном находится у прокариот в периплазматическом пространстве (В.А. Гусев, 1978; Л.И. Иванюта, 1989; М.В. Биленко, 1991). Вышеописанные изоферментные формы СОД относятся к внутриклеточным энзимам и в экстрацеллюлярной жидкости подвергаются разрушению в течение 5 – 10 минут (В.А. Гусев, 1978; Л.И. Иванюта, 1989; М.В. Би-ленко, 1991). В то же время была выявлена внеклеточная высокомолекулярная форма СОД, которая не вступает во взаимодействие с лейкоцитами и эритроцитами, не оказывает влияния на образование АФК гранулоцитами (Е.Е. Дубинина, И.В. Шугалей, 1993). Внеклеточная СОД оказывает протекцию эндотелиоцитам от повреждающего действия АФК (А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский, 1981; Д.Н. Маянский, Д.Д. Цырендоржиев, 1990), по химическому строению и свойствам схожа с широко распространенным ферментом цитозоля – Cu-Zn-СОД, которая является наиболее изученной (В.А. Гусев, 1978; М.В. Биленко, 1991; Ю.И. Губ-ский и соавт., 1994; Н.Г. Гурин, 1997; Т.А. Девяткина и соавт., 2000; В.Г. Зайцев, 2000а; Н.П. Чеснокова и соавт., 2006а; S. Elchuri et al., 2005).
СОД является эндогенным акцептором свободных кислородных радикалов, избыточное накопление которых в клетке имеет большое значение в развитии кис-лородзависимых патологических процессов (гипоксии, воспаления, интоксикации и др.). Она действует на начальных этапах СРО и катализирует превращение супероксид-анион-радикала в Н2О2 (В.А. Гусев, 1978; Н.П. Чеснокова и соавт., 2006а), но при избыточном образовании Н2О2 активность СОД снижается (А.В. Журавлев, 1982; М.В. Биленко и соавт., 1989; В.В. Абрамченко и соавт., 1995). В то же время высокая активность данного фермента приводит к угнетению фосфолипазы А2 и снижает синтез арахидоновой кислоты, которая является предшественницей эйка-заноидов (В.В. Абрамченко и соавт., 1995). СОД является эндогенным мембрано- и цитопротектором, так как оказывает тормозящее действие на процесс избыточного накопления Оf (В.А. Гусев, 1978; А.В. Журавлев, 1982; Т.А. Девяткина, 1990; М.В. Биленко, 1991; Д.Э. Мецлер, 1998; Н.К. Зенков и соавт., 2001; О.А Гомазков, 2003). Необходимо отметить, что катализируемые ею реакции являются частью механизма регуляции в клетке стационарной концентрации липо- и водорастворимых АО (Л.И. Иванюта, 1989; М.В. Биленко, 1991; А.Е. Франчук и соавт., 1991; В.В. Абрамченко и соавт., 1995; В.К. Чайка и соавт., 1997; Т.А. Девяткина и соавт., 2000; В.И. Пешкова и соавт., 2000). СОД удаляет супероксидные радикалы и предотвращает образование синглетного кислорода и гидроксильного радикала, которые являются более опасными для организма (П.А. Галенко-Ярошевский, В.В. Гацура, 2009), предотвращает накопление в очаге воспаления нейтрофилов, секретирую-щих значительные количества лизосомальных ферментов, разрушающих близлежащие ткани. Она нормализует протекающие с участием свободных радикалов кислорода окислительные процессы и предупреждает окислительную модификацию белков, а также связанное с активизацией ПОЛ разрушение биомембран клеток. В различных органах млекопитающих активность СОД не одинакова. Так, у человека она проявляет низкий уровень активности в сердце, селезенке и костном мозге, высокий – в печени, почках, эритроцитах, головном мозге, надпочечниках, гипофизе и щитовидной железе (П.А. Галенко-Ярошевский, В.В. Гацура, 2009; S. Elchuri et al., 2005).
СОД обладает очень узкой субстратной специфичностью, так как основное действие связано с влиянием на полувосстановленную молекулу кислорода, причем катализирует она как прямую, так и обратную реакцию. При определенных условиях СОД способна генерировать из Н2О2 супероксидный радикал, поддерживая в интактной клетке ее стационарный уровень (В.А. Гусев,1978; Л.И. Ива-нюта, 1989; М.В. Биленко, 1991; Т.А. Девяткина, 1990).
Экзогенное введение СОД приводит к подавлению активности СРО в головном мозге, способствует нормализации метаболических процессов, благодаря чему снижается вероятность повреждения и гибели нервной ткани, что позволяет применять СОД-содержащие препараты в терапии эпилепсии, болезни Альцгеймера, гидроцефалии, амниотического латерального склероза, ишемии, черепно-мозговых травм, субарохноидальных кровоизлияний, деменции и др. (М.Н. Волгарев и соавт., 1993; Ю.А. Зозуля и соавт., 2000; О.К. Кульчицкий и соавт., 2001; C. Wolfinan et al., 1994).
Исследование дерматопротекторного действия при частичной артериовенозной недостаточности кожно го лоскута в области передней брюшной стенки крыс
Проведенные исследования показали, что на культуры остеобластов теменной кости и фибробластов кожи реамберин и рексод токсического действия не оказывали. При внесении в среду инкубации реамберина (10, 50 и 100 мг/мл), рек-сода (0,0001, 0,0005 и 0,001 мг/мл) и их сочетания (10 и 0,0001, 50 и 0,0005, 100 и 0,001 мг/мл) наблюдалась отчетливая тенденция к повышению метаболической и пролиферативной активности клеток (таблицы 12 и 13, рисунки 21 и 22).
При добавлении в среду инкубации NaCN и ДНФ наблюдалось снижение степени адгезии к субстрату (уменьшение их площади и увеличение межклеточного расстояния). При этом под действием NaCN и ДНФ рост остеобластов угнетался на 22 и 44%, а фибробластов – на 21 и 62,5% соответственно (таблицы 12 и 13).
В цитотоксическом действии ДНФ возможно участие свободнорадикальных механизмов повреждения, поскольку ДНФ вызывает усиление окислительных процессов и уменьшение образования макроэргических соединений.
Применение реамберина и рексода на фоне гипоксии, индуцированной NaCN и ДНФ, приводило к нормализации адгезии и количества культивируемых остео-и фибробластов. Существенных отличий в действии реамберина, рексода и их сочетаний не выявлено (таблицы 12 и 13, рисунки 23 – 26).
Наиболее выраженный протекторный эффект рексод проявлял на модели гипоксии, индуцированной ДНФ. Данные, полученные в ходе исследования, подтверждают наличие у рексода антиоксидантной, антигипоксантной и цито-протекторной активности.
Обозначения. Здесь и на рисунках 22 – 26: К – контроль, 1, 2 и 3 – показатели ОП образцов культивируемых клеток при концентрациях реамберина – 10, 50 и 100 мг/кг, рексода – 0,0001, 0,0005 и 0,001 мг/мл, их сочетаний – 10 и 0,0001, 50 и 0,0005, 100 и 0,001 мг/мл соответственно.
Сравнительная активность реамберина, рексода и их сочетаний при влиянии на жизнеспособность культивируемых фибробластов крыс. Рисунок 23. Сравнительная активность реамберина, рексода и их сочетаний при влиянии на жизнеспособность культивируемых остеобластов крыс в условиях гипоксии, индуцированной NaCN.
Примечание. Здесь и на рисунке 24: - различие статистически достоверно по сравнению с контролем, + - по сравнению с NaCN. Рисунок 24. Сравнительная активность реамберина, рексода и их сочетаний при влиянии на жизнеспособность культивируемых фибробластов крыс в условиях гипоксии, индуцированной NaCN. 94 Рисунок 25. Сравнительная активность реамберина, рексода и их сочетаний при влиянии на жизнеспособность культивируемых остеобластов крыс в условиях гипоксии, индуцированной ДНФ. Примечание. Здесь и на рисунке 26: - различие статистически достоверно по сравнению с контролем; о – по сравнению с ДНФ. Рисунок 26. Сравнительная активность реамберина, рексода и их сочетаний при влиянии на жизнеспособность культивируемых фибробластов крыс в условиях гипоксии, индуцированной ДНФ. Применение реамберина на фоне гипоксии, вызванной ДНФ, также приводило к повышению жизнеспособности культур клеток, благодаря поддержанию потенциала митохондриальных мембран.
Учитывая, что NaCN угнетает дыхательную цепь и приводит к накоплению продуктов цикла трикарбоновых кислот, возможно, что реамберин, который являет собой слабощелочной буфер, в условиях гипоксии способствует нормализации метаболических процессов.
Таким образом, реамберин, рексод и их сочетания в интактных условиях не оказывают цитотоксического действия на культивируемые остео- и фибробласты, а при гипоксии, индуцированной NaCN и ДНФ, стимулируют их пролиферацию.
Влияние на перекисное окисление липидов остеобластов и фибробластов крыс Установлено, что введение субтоксических доз NaCN и ДНФ в среду инкубации приводило к увеличению уровня ТБК-активных продуктов в остеобластах на 12 и 18% и в фибробластах на 7 и 8% соответственно (таблицы 14 и 15).
Реамберин (10, 50 и 100 мг/мл), рексод (0,0001, 0,0005 и 0,001 мг/мл) и их сочетания (10 и 0,0001, 50 и 0,0005, 100 и 0,001 мг/мл) при суточной инкубации в интактных условиях не оказывали влияния на процессы ПОЛ в остео- и фиб-робластах (таблицы 14 и 15, рисунки 27 и 28).
Введение реамберина, рексода и их сочетаний в инкубационную среду культивируемых остео- и фибробластов с гипоксией, индуцированной NaCN и ДНФ, приводило к снижению содержания ТБК-реактивных продуктов (таблицы 14 и 15, рисунки 29 – 32).
Таким образом, реамберин, рексод и их сочетания при их суточной инкубации с остео- и фибробластами не токсичны и не оказывают влияния на уровень ПОЛ. При гипоксии, вызванной субтоксическими дозами NaCN и ДНФ, реамбе
Влияние на перекисное окисление липидов остеобластов и фибробластов крыс
В отмеченном плане наше внимание привлекли препараты реамберин и рек-сод. Реамберин содержит меглюмина натрия сукцинат, являющийся производным ЯК. Последняя, как известно, является важнейшим интермедиатом цикла Кребса, способствующим образованию макроэргов, улучшающим энергообеспечение регенеративных процессов при повреждающих воздействиях на органы и ткани (КС. Васьков, 1989; СВ. Оболенский, 2002; Г.Л. Вышковский и соавт., 2004; В.В. Афанасьев, 2005; И.А. Волчегорский и соавт., 2008; П.А. Галенко-Ярошевский и соавт., 2001, 2012).
Рексод, представляющий собой рекомбинантную СОД (ключевой фермент АОС) человека, нейтрализует избыток радикалов, вызывающих повреждение биомембран на фоне ускорения ПОЛ при различных патологических состояниях (И.В. Чурилова и соавт., 2002; П.А. Галенко-Ярошевский, В.В. Гацура, 2009;). СОД обладает выраженным противовоспалительным, противогипоксическим, мембрано-, цито-, кардио- и радиопротекторным действием (П.А. Галенко-Ярошевский, В.В. Гацура, 2009; Р. Бекманн и соавт., 1995), является самым мощным АО благодаря своей специфичности в отношении -О-2 (А.В. Стефанов и соавт., 2004).
Проведенные нами исследования показали, что при ишемии тканей хвоста крыс, вызванной избирательной окклюзией сосудов, реамберин оказывает гисто-протекторное действие. При сочетанном применении реамберина и рексода отмечается потенцирование гистопротекторного эффекта по сравнению с таковым реамберина и рексода, взятых отдельно: композиция реамберин (внутривенно) + рексод (внутрибрюшинно) повышает выживаемость тканей хвоста на 97,0 %, тогда как реамберин и рексод - на 31,9 и 6,2% соответственно.
В условиях ишемии кожи крыс, вызванной формированием кожной складки (путем ее прошивания в области спины), реамберин, рексод и их сочетание при однократном и 7-кратном внутривенных введениях индуцируют выраженное дер-матопротекторное действие, проявляющееся в большей мере при использовании реамберина. Композиция реамберин + рексод вызывает более значимый дермато-протекторный эффект, чем отдельно взятые реамберин и рексод, который может быть обусловлен повышением резервных возможностей системы антиоксидант-ной защиты.
При артериовенозной недостаточности КЛ передней брюшной стенки крыс реамберин, рексод и, в большей мере, их композиция в условиях однократного внутривенного введения проявляют существенное дерматопротекторное (антинекротическое) действие. В случаях 7-кратного внутривенного инъецирования реамберина, рексода и их сочетания отмечается значимый антинекротический эффект. При этом существенных отличий в гистопротекторном действии при однократном и многократном введении исследованных препаратов не выявлено.
В условиях артериовенозной недостаточности КЛ передней брюшной стенки крыс на фоне нормо- и гипергликемии, осложненной ЭГХ, композиция реамберин + рексод при предварительном многократном (в течение 14 дней) внутривенном введении оказывает дерматопротекторное действие. У крыс с АСД сочетание ре-амберин + рексод вызывает в цельной крови снижение содержания глюкозы, холестерина, триглицеридов, -липопротеидов и повышение уровня ЛПВП.
При исследовании некоторых сторон механизма гистопротекторного действия избранных нами веществ и их композиции выявлено, что реамберин, рексод и, в большей мере, их сочетание оказывают протекторное действие на культивируемые остео- и фибробласты крыс при токсическом воздействии на них метаболических гипоксантов NaCN и ДНФ. Так, реамберин (10, 50 и 100 мг/мл), рексод (0,0001, 0,0005 и 0,001 мг/мл) и их сочетания (10 и 0,0001, 50 и 0,0005, 100 и 0,001 мг/мл) в условиях суточной инкубации с остео- и фибробластами не оказывают на них сколько-нибудь значимого токсического действия и не проявляют существенного влияния на уровень ПОЛ. При гипоксии остео- и фибробластов, вызванной субтоксическими дозами NaCN и ДНФ, реамберин, рексод и в большей мере их сочетание снижают уровень ТБК-активных продуктов в клетках,
130 нормализуют окислительные процессы, которые протекают с участием свободных радикалов, и препятствуют разрушению биологических мембран, вызываемому активацией процессов ПОЛ.
В случаях 3-дневного внутривенного введения реамберина крысам в условиях моделированной кожной складки в области спины препарат способен вызывать коррекцию альтернативного сукцинатоксидазного окисления путем улучшения проникновения экзо- и эндогенного сукцината в митохондрии и повышения активности СДГ и сукцинат-убихинон-редуктазы, что влечет за собой возрастание резервных возможностей системы антиоксидантной защиты ишемизированной кожи и позволяет купировать ускорение в ней процессов ПОЛ.
Предварительное однократное внутрибрюшинное введение рексода крысам в условиях моделированной кожной складки в области спины приводит к снижению индекса цитолиза и содержания МДА (до уровня нормы), ингибированию процессов ПОЛ и повышению активности ГП, что обусловливает увеличение резервных возможностей ферментативного звена системы антиоксидантной защиты в целом и купирование некротических процессов, а также уменьшение повреждающего действия эндотоксинов, продуцируемых при некрозе кожи, на печень и сердце.
