Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Структура и свойства биофлавоноидов, определяющие их биологическую активность 12
1.2 Основные фармакологические свойства биофлавоноидов кверцетина и дигидрокверцетина 20
1.3 Роль свободнорадикального и перекисного окисления при ожогах 27
1.4 Использование растительных препаратов в лечении термических ожогов 33
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1 Характеристика экспериментальных животных 44
2.2 Характеристика препаратов, используемых в работе 45
2.3 Экспериментальная модель исследования дигидрокверцетина в составе мази при лечении термического ожога 47
2.4 Экпериментальная модель окислительного стресса с использованием дициклопентадиена 52
2.5 Методы исследования безопасности дигидрокверцетина 53
2.5.1 Методы исследования острой токсичности 53
2.5.2 Методы исследования кумуляции и хронической токсичности 56
2.5.3 Методы оценки местно-раздражающего действия 57
2.6 Методы статистической обработки 58
Глава 3. Результаты собственных исследований 59
3.1 Исследование ранозаживляющего действия дигидрокверцетина при экспериментальном термическом ожоге кожи 59
3.2 Экспериментальное исследование антиоксидантных свойств дигидрокверцетина 81
3.3 Экспериментальное исследование токсичности дигидрокверцетина и безопасности его применения 84
3.3.1 Исследование острой токсичности и кумуляции 84
3.3.2 Исследование местно-раздражающего действия 88
3.3.3 Исследование хронической токсичности 89
Глава 4. Обсуждение результатов исследований 101
Заключение 116
Выводы 118
Практические рекомендации 120
Список сокращений и условных обозначений 121
Список литературы 122
Список иллюстрированного материала 141
- Структура и свойства биофлавоноидов, определяющие их биологическую активность
- Использование растительных препаратов в лечении термических ожогов
- Исследование ранозаживляющего действия дигидрокверцетина при экспериментальном термическом ожоге кожи
- Исследование хронической токсичности
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В настоящее время высокие показатели ожогового травматизма являются одной из актуальных проблем медицины и общества в целом (Гусейнов Т.С. и соавт., 2013; Зиновьев Е.В., 2013). Почти два миллиона человек в мире получают ожоги ежегодно, приблизительно сто тысяч обожженных нуждаются в госпитализации и тысячи ожогов заканчиваются летальным исходом (Апарцин К.А. и соавт., 2009; Миронов С.П. и соавт., 2007; Вазина И.Р., 2009). При этом зачастую, несмотря на лечение, заживление ран происходит с образованием рубцов (Абаев Ю.К., 2003), что определяет необходимость создания новых лекарственных средств, улучшающих течение пролиферативно – репаративных процессов в ране .
В настоящее время интенсивно изучаются вопросы патогенеза раневого процесса при термической травме кожи, влияния различных фармакологических средств на течение и исходы длительно незаживающих ран (Абаев Ю.К., 2003). В фармакологии активно развивается направление создания лекарственных средств на основе растительного сырья (Сафонов В.В., Сафонова М.Ю., Лесиовская Е.Е., 1999). Это обусловлено высокой биологической активностью веществ растительного происхождения, благодаря сочетанию в них целого комплекса соединений, способных действовать на организм как самостоятельно, так и проявляя синергизм друг к другу (Лесиовская Е.Е., Саватеева-Любимова Т.Н., 2011). В отличие от синтетических лекарственных средств, многие вещества, синтезируемые растениями, являются физиологичными по отношению к человеку (Барабой В.А., 1984).
В последние годы для лечения ожогов и профилактики послеожоговых осложнений все большее внимание привлекают биологически активные вещества растительного происхождения, связывающие и нейтрализующие свободные радикалы, а также другие токсические соединения на поверхности ран (Никулин А.А. и соавт., 1992; Кулатаева А.К., 2006; Нестерова Ю.В. и соавт., 2009; Наумов А.А. и соавт., 2010). Применение антиоксидантов определяется важной ролью процессов свободнорадикального и перекисного окисления в заболеваниях и травмах, сопровождающихся повреждением и воспалением тканей, включая ожоги (Оковитый С.В., 2003). Показано, что многие биологически активные вещества растительного происхождения, входящие в состав лекарственных средств и содержащие в своём составе антиоксиданты, способны оказывать противогипоксическое, антимикробное и противовоспалительное действие, проявляя синергизм с другими природными и синтетическими фармакологическими средствами (Саватеева-Любимова Т.Н, Лесиовская Е.Е, Сивак К.В., 2008). Одним из таких веществ является дигидрокверцетин (ДКВ), который был впервые выделен из древесины лиственницы сибирской в лаборатории природных соединений Иркутского института органической химии Сибирского отделения РАН (Бабкин В.А., Остроухова Л.А., Дьячкова С.Г., 1997).
Степень разработанности темы. Дигидрокверцетин выделяют из комля и щепы лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.), даурской (Larix dahurica Turcz.) и лиственницы Гмелина (Larix Gmelinii), произрастающих на территориях северо-восточной и восточной части России, а также в Северной Америке. Лиственное сырьё ценно тем, что 80 % дигидрокверцетина находится в комле, который, как правило, не используется лесозаготовителями и остается на лесосеках.
Разнообразие биологических эффектов ДКВ, многие из которых были обнаружены В.К. Колхир, Н.А. Тюкавкиной, В.А. Быковым (1995), в значительной степени связано с его антиоксидантными свойствами. ДКВ существует в виде четырех энантиомеров, что отражается на его физико-химических свойствах. Рядом авторов проведена оценка антиоксидантной активности производных этого вещества и взаимосвязь полученных эффектов с их химическим строением (Роговский В.С., Матюшин А.И., Шимановский Н.Л., 2010).
Дигидрокверцетин широко используют в пищевой промышленности, в косметологии и фармакологии. К настоящему времени известны такие фармакологические эффекты дигидрокверцетина, как антиоксидантный, капилляропротекторный, противоспалительный, гастропротекторный, гепатопротекторный, радиопротекторный, гиполипидемический, диуретический, которые по ряду показателей в 3 – 5 раз превосходят соответствующие эффекты кверцетина и рутина (Плотников М.Б., Тюкавкина Н.А., Плотникова Т.М., 2005).
Однако действие дигидрокверцетина на раневую поверхность и на заживление ожоговых поражений кожи практически не исследовано. Не изучено токсическое влияние на организм ДКВ, выделенного из лиственницы сибирской по новой технологии с применением мембранных фильтров и не дана оценка безопасности данного вещества, что является необходимым условием при создании новых лекарственных форм (Лесиовская Е.Е., Саватеева-Любимова Т.Н., 2011).
Таким образом, исследование влияния местного применения ДКВ на течение и исход термического ожога кожи, с оценкой безопасности этого вещества, является актуальной научной задачей, что и обусловило выбор цели настоящей работы.
Цель работы: экспериментально оценить ранозаживляющую эффективность дигидрокверцетина при термической травме кожи и обосновать возможность его использования в составе лекарственных форм для наружного применения.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
-
-
В экспериментальных исследованиях на кроликах оценить эффективность дигидрокверцетина при его применении в составе мазевой лекарственной формы для лечения термических ожогов кожи IIIА степени.
-
Установить основные механизмы противоожоговых эффектов дигидрокверцетина.
-
В острых и хронических экспериментальных исследованиях на двух видах лабораторных животных оценить безопасность применения дигидрокверцетина.
-
Установить основные поражаемые органы и характер токсического действия дигидрокверцетина на организм экспериментальных животных.
Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые:
- показана возможность использования дигидрокверцетина при его наружном применении для лечения термических ожогов кожи;
- установлено, что ДКВ при местном применении облегчает течение ожоговой болезни, способствует благоприятному протеканию процесса заживления раны и полностью предотвращает образование грубого рубца при термических ожогах кожи IIIА степени;
- выявлено, что ключевые звенья механизма действия ДКВ в эффективных (терапевтических) дозах связаны с его антирадикальной активностью, способностью стимулировать антиоксидантную защитную систему организма, оказывать местное противовоспалительное, мембраностабилизирующее и детоксицирующее действие, улучшать состояние микроциркуляции;
- показано, что ДКВ является малотоксичным веществом, не обладает местно-раздражающим действием, хорошо переносится и безопасен при длительном применении;
- установлены основные поражаемые органы при поступлении в организм ДКВ в высоких дозах (печень, сердце) и определено, что его токсичность связана с прооксидантной активностью.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость исследования состоит в раскрытии основных механизмов противоожоговой эффективности ДКВ при его наружном применении в составе мазевой лекарственной формы для лечения термических ожогов IIIА степени. Установлены закономерности реакции организма на длительное введение ДКВ в разных дозах и определены уровни доз, в которых дигидрокверцетин проявляет антиоксидантные и прооксидантные свойства.
Практическая значимость исследования заключается в доказательстве благоприятного влияния местного применения ДКВ на протекание процесса заживления ожоговой раны, наиболее важным результатом которого является предотвращение образования грубого рубца при термических ожогах кожи IIIА степени. Экспериментально обоснована схема местного применения ДКВ при ожогах и представлены рекомендации по разработке гидро- и липофильных форм для наружного применения на его основе.
Материалы исследования используются в НЦ реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН в научно-исследовательской работе по созданию модели раневой болезни и её лечения на лабораторных животных в условиях эксперимента (акт внедрения от 25.02.2010), в учебном процессе кафедры «Экология и безопасность деятельности человека» ФГБОУ ВПО «Ангарская государственная техническая академия» (АГТА) при изучении курса «Основы токсикологии» (акт внедрения от 15.02.2010), в работе отдела токсикологии НИИ биофизики ФГБОУ ВПО АГТА (акт внедрения от 4.02.2010), в системе Регионального управления Госсанэпиднадзора для оценки производств сопутствующих химических соединений на предприятиях, контролируемых территориальным органом Госсанэпиднадзора ФМБА России (акт внедрения от 19.02.2010).
Методология и методы исследования. Диссертационное исследование выполнялось в несколько этапов. На первом этапе изучалась отечественная и зарубежная литература по проблеме исследования. На втором этапе отрабатывалась экспериментальная модель термической травмы кожи, а также адекватные методы оценки противоожоговой эффективности и безопасности ДКВ. На третьем этапе проводились экспериментальные исследования ранозаживляющих свойств ДКВ при термическом ожоге кожи у кроликов. На четвертом – экспериментальные исследования по оценке безопасности ДКВ в острых и хронических опытах. На пятом – анализировались результаты собственных исследований, формулировались и обосновывались научные положения и выводы, вытекающие из результатов работы.
Для решения поставленных задач и достижения поставленной цели проведены экспериментальные исследования на трех видах животных (кролики, крысы, мыши). Использованы современные токсикологические, физиологические, биохимические, гематологические, патоморфологические и физико-химические методы с последующей статистической обработкой полученных данных.
Положения, выносимые на защиту:
1. Дигидрокверцетин в составе мазевой лекарственной формы эффективен при лечении термических ожогов кожи IIIА степени, обеспечивая процесс заживления ран без повреждения свежеобразованной кожи и без образования грубого рубца.
2. В основе ранозаживляющего действия дигидрокверцетина при термических ожогах кожи лежат его свойства стимулировать антиоксидантные механизмы защиты клеток от окислительного стресса, улучшать микроциркуляцию, уменьшать воспалительные процессы в ране, оказывать местное детоксицирующее действие.
3. В дозах, рекомендуемых для лечения ожоговой болезни, дигидрокверцетин не оказывает неблагоприятного побочного действия на организм, безопасен при длительном применении. Основными органами, поражаемыми при введении в организм дигидрокверцетина в высоких дозах, являются сердце и печень.
Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности определяется репрезентативным объемом выборки экспериментальных животных, применением комплекса современных методов экспериментальных исследований (токсикологических, физиологических, морфологических, гистохимических, биохимических, гематологических) и адекватных приемов математической статистики.
Материалы диссертации доложены и обсуждены: на XI международной научной школе-конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2007г); на международной научно-практической конференции «Дальневосточная весна-2008» (Комсомольск-на-Амуре, 2008); на III съезде токсикологов России (Москва, 2008); на научно-практической конференции «Лабораторные животные как основа экспериментальной медицины» (Томск, 2009); на международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы электрофизиологии и незаразной патологии животных» (Улан-Удэ, 2009); на XXIII международной научно-практической конференции «Современная медицина: актуальные вопросы» (Новосибирск, 2013); на VI Международной научной конференции «Европейские прикладные науки: современные подходы в научных исследованиях» (Штутгарт, Германия, 2013).
Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ отдела токсикологии НИИ биофизики ФГБУ ВПО АГТА и ФГБУН «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства» в 2007 – 2013 гг. по теме НИР: «Исследование влияния дигидрокверцетина, полученного по новой технологии с применением мембранных фильтров, на термический ожог кожи».
Личное участие автора. Тема и план диссертации, ее основные идеи и содержание разработаны совместно с научными руководителями на основе многолетних целенаправленных исследований. Автор самостоятельно обосновала актуальность темы диссертации, ее цель, задачи и этапы научного исследования. Лично проведен анализ литературы, отработана экспериментальная модель оценки фармакологической активности ДКВ, освоены и самостоятельно выполнены токсикологические, физиологические, биохимические методики, приемы забора биологического материала для патоморфологических исследований, способы окраски и приготовления гистологических препаратов. Лично выполнены экспериментальные исследования по изучению ранозаживляющих свойств дигидрокверцетина при термической травме кожи и проведена оценка безопасности ДКВ на лабораторных животных, с их последующей статистической обработкой и анализом полученных данных. Личный вклад автора составляет 90-95%.
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 23 научных работах, из них 8 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получен патент № 2405536 РФ на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста: состоит из введения, обзора научной литературы, главы с изложением результатов экспериментальных исследований, главы с обсуждением результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы (152 отечественных и 46 зарубежных источников). Содержит 7 таблиц, 78 рисунков и 1 приложение.
Методы статистической обработки цифрового материала. Полученные цифровые данные обрабатывали с помощью пакетов прикладных программ Microsoft Excel и "Biostat". Для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при р0,05 (Петри А., Сэбин К., 2009). Для оценки значимости различий результатов, представленных в альтернативной форме, использовали точный метод Фишера для четырехпольной таблицы.
Структура и свойства биофлавоноидов, определяющие их биологическую активность
Флавоноиды - природные полифенольные соединения, структурными элементами которых служат два ароматических кольца, соединенных трёхуглеродным мостиком, образующим у-пироновое кольцо в виде фенилбензопирона (рисунок 1.1).
В 1814 году М.Э. Шевроле выделил из растений флавоноид, названный кверцетином (рисунок 1.2).
В 1936 году венгерский биохимик А. Сент-Дьердьи из кожуры лимона экстрагировал витамин Р (рисунок 1.3), который повышал прочность капилляров и снижал кровоточивость у морских свинок и крыс на моделях скорбута (Роговский B.C., Шимановский Н.Л., Матюшин А.И., 2012).
Впервые термин «биофлавоноид», т.е. флавоноид, обладающий биологической активностью, стали применять в 1949 году (Комов В.П., Шведова В.Н., 2004; Тюкавкина Н.А., Руленко И.А., Колесник Ю.А., 1997). Все флавоноидные соединения делятся на агликоновые формы и гликозиды. Первые не содержат в своей структуре сахарных остатков, а во второй форме содержится остаток сахара (Андреева В.Ю., Плотников М.Б., Калинкина Г.И., 2001; Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., 2006; Селиванова И.А., Тюкавкина Н.А., Колесник Ю.А., 1998; Пасічна Е.П., Морозова Р.П, Доченко Г.В., 2007; Mayer В., Schumacher М., Brandstater Н., 2001).
Названия флавоноидов преимущественно связанны с источником их выделения из растений. Так, например, источником выделения кверцетина послужила кора дуба Quercus velutina Lam, таксифолина (дигидрокверцетина) -древесина псевдотсуги тиссолистной Pseudotsuga taxifolia. В зависимости от природы ароматического фрагмента различают собственно фенолы (а-токоферол, гидрохинон и др.), оксипроизводные конденсированных аренов (нафтолы и т.п.), а также гетероароматические соединения (эмоксипин).
По числу присоединенных к ароматическому ядру ОН-групп различают моно- и полифенолы, существенно различающиеся по антиокислительной активности, зависящей от взаимного расположения ОН-групп. Так, по своей способности ингибировать окисление различных липидных субстратов незамещенные фенолы располагаются в следующем порядке: пирокатехин (1,2 дигидроксибензол) а-нафтол (3-нафтол гидрохинон (1,4-дигидроксибензол) резорцин (1,3-дигидроксибензол) фенол. Высокая антиокислительная активность пирокатехина обусловлена образованием внутримолекулярной водородной связи между двумя гидроксильными группами, расположенными у соседних атомов углерода (рисунок 1.4). Вследствие этого не участвующий в образовании водородной связи атом Н становится более подвижным и более реакционноспособным по отношению к радикалам (Меньщикова Е.Б., Панкин В.З., Зенков Н.К., 2006).
Одним из основных источников образования радикалов при окислении липидов в биологических системах являются гидроперекиси, разлагающиеся в присутствии ионов металлов переменной валентности (Бубенчиков Р.А., Воротынцева Н.И., Дроздова И.Л., 2001; Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 2009; Курлянский Б.А., Филов В.А., 2002; Хавинсон В.Х. и соавт., 2003). Поэтому вещества, реагирующие с гидроперекисями с образованием стабильных молекулярных продуктов или связывающие каталитически активные ионы металлов, также проявляют антиокислительную активность (Ланкин В.З., Бондарь Т.Н., Тихазе А.К., 1997; Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н., 2000; Селиванова И.А., Тюкавкина Н.А., Колесник Ю.А., 1998; Пасічна Е. П., Морозова Р. П., Донченко Г. В., 2007). Способностью связывать ионы металлов переменной валентности и за счёт этого ингибировать ПОЛ в биологических системах обладают многие природные флавоноиды, поэтому их рассматривают как антиоксиданты комбинированного действия (Attaguile G., Russo A., Campisi А., 2000; Del Bello В., Maellaro Е., Sugherini L., 1994).
Самый многочисленный класс природных фенольных соединений флавоноиды (Барабой В.А., 1984). Флавоноиды входят в состав овощей, фруктов, цветов, семян, стеблей и корней растений. Количественное содержание их находится в широком диапазоне. Так, содержание кверцетина (мг/кг веса) меняется от 0-2 в моркови и картофеле до 708 в томатах. В растениях флавоноиды синтезируются в результате сложного каскада реакций, так называемых шикиматного и ацетато-малонатного (поликетидного) путей (рисунок 1.5). Из продуктов шикиматного пути (активированная молекула оксикоричной кислоты: пара-кумария-КоА) образуется кольцо В, а из трёх молекул малонил-КоА - кольцо А (Роговский B.C., Шимановский Н.Л., Матюшин А.И., 2012). В настоящее время из растений выделено и охарактеризовано более 500 соединений класса флавоноидов.
Флавоноиды представляют собой полифенолы, структурной основой которых служит флавоновое ядро, содержащее два ароматических кольца А и В, соединенных СЗ-мостиком (рисунок 1.6). Разнообразие флавоноидов достигается за счёт наличия асимметричных атомов углерода в гетероцикле, а также различных заместителей в ароматических ядрах А и В. Флавоноиды способны проявлять как прооксидантные, так и антиоксидантные свойства, которые зависят от их растворимости, соотношения окислителей и восстановителей в среде, наличия металлов переменной валентности, рН среды, наличия ОН-заместителей и двойной связи С2-СЗ между кольцами А и В и количеством фенольных ОН-групп в их молекулах (Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., 2006; Роговский B.C., Шимановский Н.Л., Матюшин А.И., 2012).
Наиболее важными для антирадикальной активности структурными элементами молекул флавоноидов являются (Ernster L., 1998):
1) две ОН-гругаты в положениях СЗ и С4 ;
2) двойная связь между 2 и 3 атомами углерода, желательно совместно с карбонильной группой в положении С4;
3) ОН-группы в положениях СЗ и С5 совместно с карбонильной группой.
Использование растительных препаратов в лечении термических ожогов
В мире отмечается неуклонный рост пострадавших от ожогов (iftci І., Arslan К., Altunbas Z., Kara F., Yilmaz H., 2012). По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), термические поражения занимают третье место среди прочих травм, что объясняется широким использованием токов высокого напряжения, высокой энерговооруженностью современного производства, транспорта, агрессивностью химических жидкостей и взрывоопасных газов. Неоднократно отмечалось, что термические травмы имеют сложный и недостаточно изученный патогенез. При обширных и глубоких ожогах возникают значительные нарушения в работе основных органов и систем, причем причинная взаимосвязь нарушения находится на клеточном и субклеточном уровне, что весьма затрудняет распознавание этих тонких патологических процессов (Алексеев А.А., Лавров В.А., 1998).
Известно, что длительное воздействие повышенной температуры на поверхность человеческого тела не приводит к большим изменениям в тканях благодаря быстрому распространению и рассеиванию тепла. Однако, если степень поглощения тепла превысит степень его рассеивания, то температура тканей поднимается до уровня клеточного распада. При температуре от 44С до 51 С для разрушения клеток достаточно кратковременной экспозиции. Особенно быстро идет клеточное разрушение при температуре, превышающей 51 С. Если при относительно низких температурах рассеивание тепла путём кровообращения оказывается эффективным, то при высоких - этот фактор теряет свою значимость (Кузин, М.И., Сологуб В.К., Юденич В.В., 1982).
В клинической практике различают 4 степени ожогов, в зависимости от глубины поражения тканей (Маслов В.И., 1999):
I степень - только гиперемия и отек кожи;
II степень - некроз и отслойка эпидермиса с образованием пузырей, заполненных серозным экссудатом;
IIIA степень - частичный некроз кожи с сохранением росткового слоя эпидермиса, выводных протоков желез, с образованием серо-коричневого тонкого струпа, который отторгается через пол-месяца; болезненность ожоговой поверхности при укалывании сохранена;
ШБ степень - характеризуется некрозом кожи на всю глубину с потерей болевой чувствительности самого ожога при укалывании, с образованием темного, плотного струпа, который отторгается через 1-1,5 месяца;
IV степень - поражена не только кожа на всю глубину, но и подлежащие ткани, включая нередко и кость; чувствительность ожоговой поверхности утрачена, струп толстый, черный, плотный, отторгается через несколько месяцев.
Ожоги I - IIIA степени относятся к поверхностным, ожоги ІІІБ - IV степени относят к глубоким ожогам. Принципиальное различие их состоит в том, что поверхностные ожоги могут самостоятельно заживать с восстановлением кожного покрова (рубцы осложняют заживление ожогов IIIA), а глубокие ожоги без лечения заживают длительно и только с формированием рубцов. При этом дефект кожного покрова замещается соединительной тканью с развитием десмогенных контрактур и обширных рубцов.
Вторым основным элементом, который определяет степень тяжести ожоговой травмы, является площадь ожога. Площадь ожога измеряют с помощью "правило ладони", согласно которому к ожоговой поверхности примеряют ладонь, площадь которой примерно соответствует 1% площади тела. Также используют "правило девятки", по которому площадь отдельных областей тела равна или кратна цифре 9: так голова и шея - 9%, верхняя конечность - 9%, нижняя конечность - 18%, передняя и задняя поверхности туловища - по 18%, промежность - 1%. Сопоставляя обожженную поверхность с указанными сегментами, определяют ее площадь, выраженную в процентах к поверхности тела (Маслов В.И., 1999; Клигуненко Е.Н., Лещев Д.П., Сличенков В.В., 2004).
Кроме площади ожога определяют глубину ожога. В диагностике помогает исследование болевой чувствительности ожоговой раны: при поверхностных ожогах такая чувствительность сохранена, при глубоких (ШБ и IV степени) - она утрачена. Достоверно уточняется глубина ожога через 1-2 недели, когда определяется струп и демаркационная линия (Слесаренко СВ., Козинец Г.П., Клигуненко Е.Н., 2002).
При достаточно обширных и глубоких ожогах развивается ожоговая болезнь, которая проходит через: ожоговый шок, токсемию, инфекцию, истощение, реконвалесценцию и в любой из этих периодов может наступить гибель. Тяжесть всех периодов ожоговой болезни определяется площадью глубокого ожога, от которого зависит летальность во все периоды болезни (Кузин, М.И., Сологуб В.К., Юденич В.В., 1982),
Известно, что ожоговая болезнь объясняется нарушением гомеостатических механизмов транспорта и утилизации кислорода вследствие возникновения циркуляторной, гемической, гипоксической и тканевой форм гипоксии (Рябинин В.Е., Лифшиц Р.И., 1990).
Заживление ожоговых ран проходит стадии коагуляции, воспаления, синтеза матрикса, ангиогенеза, фиброплазии, эпителизации, контракции и ремоделирования рубца, а процесс заживления состоит из трех фаз: воспаления, фиброплазии и созревания. В любом случае конечный результат неосложненного процесса раневого заживления при достаточной глубине поражения - это рубец (Абаев Ю.К., 2003).
Формирование рубца подробно описано в работе А.Е. Белоусова «Рубцы и их коррекция»5. Формируется рубец вследствие нарушения целостности кожного покрова в результате процессов закрытия дефекта новой соединительной тканью. Автором отмечается, что поверхностное повреждение эпидермиса заживает без образования рубцов, так как клетки базального слоя обладают хорошей регенерационной способностью. Чем глубже поражение слоев кожи, тем длительнее процесс заживления и выраженнее рубец. Классифицируют четыре типа рубцов (Белоусов А.Е., 2005):
1. Нормотрофические рубцы не столь заметны, т.к. их эластичность близка к нормальной, они имеют бледную или телесную окраску и находятся на уровне окружающих кожных покровов.
2. Атрофические рубцы могут возникнуть вследствие угревой болезни или некачественного удаления родинок или папиллом. Растяжки (стрии) также представляют собой именно этот тип рубцов. Атрофические рубцы находятся ниже уровня окружающих кожных покровов, характеризуются дряблостью тканей, возникающей из-за снижения выработки коллагена. Недостаток роста кожи приводит к образованию ямок и рубцов, создающих видимый косметический дефект.
3. Гипертрофические рубцы имеют розовую окраску, ограничены поврежденной областью и выступают над окружающими кожными покровами. Гипертрофические рубцы могут частично исчезнуть с поверхности кожи в течение двух лет. Они прекрасно поддаются лечению, поэтому не стоит ждать их самопроизвольного исчезновения.
4. Келоидные рубцы имеют резкую границу, выступают над окружающими кожными покровами. Келоидные рубцы зачастую болезненны, в местах их образования ощущается зуд и жжение. Этот тип рубцов плохо поддается лечению, возможны рецидивы возникновения келоидных рубцов еще больших размеров.
Местное лечение ожогов включает не только борьбу с бактериальной инфекцией в ожоговой ране, но также применение различных средств, улучшающих заживление и ускоряющих эпителизацию ожоговых ран (Белоусов А.Е., 2005; Кузин, М.И., Сологуб В.К., Юденич В.В., 1982).
В клинической медицине местное лечение ожогов проводится закрытым и открытым способом (Маслов В.И., 1999). Наиболее часто применяется метод закрытого лечения - под повязками с мазевыми субстанциями. Используются водорастворимые мази: мафилон (сульфамилона гидрохлорид), сульфадиазиновые мази; синтомициновую эмульсию. Применяются контурные повязки. Преимущества этого метода - подвижность, транспортабельность больного.
При ожогах лица, промежности применяют открытый метод. Ожоговую поверхность 3-4 раза в сутки смазывают перечисленными выше мазями или покрывают специальными аэрозолями (пантеноль, олазоль, винизоль и др.). Ожоги II и IIIA степени заживают самостоятельно: при II степени через 1-2 недели происходит эпителизация, при IIIA степени - на 4-ой неделе. При глубоких ожогах открытый метод лечения применяется с целью подсушивания и быстрейшего формирования струпа, демаркация которого наблюдается на 2-ой неделе. Важно превратить влажный струп в сухой, так как влажный имеет наклонность к дальнейшему распространению и углублению, развитию нагноения и более выраженной интоксикации. Достигается подсушивание струпа помещением обожженного в специальные палаты или камеры с установками для теплового облучения больного (инфракрасными, ультрафиолетовыми лучами), обдувания ламинарными потоками теплого очищенного воздуха в амикробной среде (в гнотобиологических условиях). Ускоряется отторжение струпа применением протеолитических ферментов, 40% салициловой или бензойной кислоты (Маслов В.И., 1999).
Исследование ранозаживляющего действия дигидрокверцетина при экспериментальном термическом ожоге кожи
Доклинические исследования на животных предполагали выявить влияние ДКВ на раневую поверхность во времени (от момента нанесения раны до её полного заживления). Поэтому целесообразно было контролировать специфические показатели раневого процесса и состояния подопытных кроликов через 24 часа после нанесения ожога и далее на 3, 7, 14, 21, 30 и 40 сутки.
Влияние дигидрокверцетина на заживление термического ожога кожи К концу первых суток после нанесения кроликам ожога на поврежденной поверхности кожи в основном завершались изменения, свойственные первой фазе течения раневого процесса, и имело место первичное образование сухого струпа из некротизированных тканей, характерного для ожога IIIА степени (рисунок 3.1).
Площадь поврежденной поверхности в этот период была одинакова во всех группах кроликов, так как ожог наносился стандартной контактной пластинкой, и составляла 20500 мм2 (таблица 3.1).
В норме температура тела у кроликов находится в пределах 38,8 — 39,5С. В наших исследованиях исходная температура тела составляла 39,0 ± 0,2С. Через 6 часов от момента нанесения ожога температура тела возросла от исходной на 1С во всех группах, что свидетельствовало о начале ожоговой болезни. Через 24 часа от момента нанесения ожога температура тела снизилась почти до первоначальной, достоверно не различаясь во всех трех группах и составляла в среднем 39,1 ± 0,1 С (рисунок 3.2).
Лечение мазью с ДКВ и облепиховым маслом было начато через 24 часа после нанесения ожога. В это время (перед нанесением мази на рану) температура в области раневой поверхности во всех группах животных в среднем составляла 35,9 ± 0,3С, что на 1,1С превышало исходные значения (рисунок 3.3). Следует отметить, что у кроликов заживление ран протекает без активной реакции на инфекцию (Терентьев П.В., Дубинин В.Б., Новиков Г.А., 1952; Алиев А.А., Зеленевский Н.В., Лайшев К.А., 2002). Отсутствие видимых признаков первичного инфицирования раневой поверхности в наших опытах позволило начать лечение ожоговой раны мазью с ДКВ и облепиховым маслом через 24 часа после нанесения термического ожога.
Электрическое сопротивление кожи через 24 часа, после нанесения ожога, во всех группах возросло в среднем на 19 кОм (таблица 3.2). Электрическое сопротивление между двумя электродами, наложенными на поверхность кожи определяется сопротивлением двух слоев: наружного (эпидермис), и внутреннего (дерма). Эпидермис состоит из мёртвых ороговевших клеток, лишён кровеносных сосудов и нервов и поэтому является слоем неживой ткани. В сухом и незагрязнённом состоянии его можно рассматривать как диэлектрик, обладающий большим удельным сопротивлением. Дерма состоит из волокон соединительной ткани. В этом слое находятся кровеносные и лимфатические сосуды, нервные окончания, корни волос, потовые и сальные железы. Дерма обладает малым сопротивлением току (Буреш Я., 1962). Увеличение электрического сопротивления кожи у кроликов через 24 часа после нанесения ожога, свидетельствует об отмирании эпидермиса и дермы, нарушении кровообращения и образования сухого струпа, хорошо проводящего ток.
На третьи сутки во всех группах животных произошло увеличение ожоговой поверхности относительно первых суток (таблица 3.1). Однако площадь раны, обрабатываемой мазью с ДКВ, была меньше и относительно контроля, и той группы животных, которым наносили на рану облепиховое масло.
К третьим суткам наблюдения масса тела животных во всех группах уменьшилась. После образования плотного струпа и до момента полного заживления, в процессе систематического лечения, масса тела у всех животных достоверно увеличивалась (таблица 3.3).
К седьмым суткам температура тела возросла в контрольной группе (39,1 ± 0,1 С), а в группах с аппликацией облепиховым маслом и мазью с ДКВ изменения были незначительные и составляли 39,2 ± 0,2С и 39,1 ± 0,1 С, соответственно (рисунок 3.2).
На седьмые сутки отмечалось увеличение площади раны (таблица 3.1). Следует отметить, что увеличение поврежденной поверхности является характерным фактором в процессе раневой болезни (Адамская Н.А., Косова И.А., Кармазановский Г.Г, 2005). Однако, площадь раны, с аппликацией ДКВ, была по-прежнему меньше, чем у животных контрольной группы и группы, в которой использовали облепиховое масло.
Через семь суток температура тела во всех группах снизилась до первоначальных значений. Одновременно произошло увеличение толщины складки кожи, связанное с утолщением струпа.
К четырнадцатым суткам температура раны в контрольной группе снизилась (34,8 ± 0,8С), в то время как в группе, леченой мазью с ДКВ (35,9 ± 0,8 С) и облепиховым маслом (до 36,9 ± 0,2С) она была выше контроля (рисунок 3.3). Возможно, понижение температуры в контрольной группе связано с нарушением кровообращения в период начала отторжения струпа (Абаев Ю.К., 2003).
Динамика толщины складки кожи представлена на рисунке 3.4. Этот показатель характеризует отечность раневой поверхности. К четырнадцатым суткам толщина кожной складки уменьшилась в группе с аппликациями ДКВ и облепихового масла.
На четырнадцатые сутки, по нашим наблюдениям, наступила стадия заживления. На этой стадии мазь с ДКВ оказалась более эффективной для заживления ожоговой раны в сравнении с облепиховым маслом. Так, показатель комплексного сопротивления кожи, в группе, леченой мазью с ДКВ (2528,2 ± 6,6 кОм), превышал значения контрольной группы (2040,8 ± 4,7 кОм) (таблица 3.2). Это можно объяснить большим количеством некротизированных тканей, которые способствуют прохождению электрического тока, и свидетельствует о сформировавшемся «зрелом» струпе. Струп уменьшился в размерах, и началось его отделение от раневой поверхности (рисунок 3.5).
На двадцать первые сутки продолжалось отхождение струпа. В группе, с аппликацией облепиховым маслом, площадь раны уменьшилась (рисунок. 3.6), но оставалась больше, чем в контрольной группе (таблица 3.1), составляя значения 19237 ± 318 мм2 и 15408 ± 232 мм , соответственно. Струп в этих группах (контроль и лечение ОМ) имел жесткую поверхность, которая трудно удалялась хирургическими инструментами и мешала животным при движениях, цепляясь за стенки клетки, доставляя при этом дискомфорт (рисунки 3.5 и 3.6).
Исследование хронической токсичности
В следующей серии наблюдений проводилось изучение эффектов дигидрокверцетина при многократном воздействии. Анализ динамики физиологических, гематологических, биохимических и морфологических показателей, при многократном воздействии, показал, что препарат в каждой дозе вызывал соответствующий эффект.
Первый месяц эксперимента с введением ДКВ.
Масса тела животных во всех группах увеличилась в пределах 31,0 - 33,2%, что сопоставимо с изменениями массы в контрольной группе; в группе крыс, получавших ДКВ в дозе 86 мг/кг привес составил 44,1%.
У животных, которым вводили ДКВ в дозах 86, 860 мг/кг и у группы животных, который вводили витамин Р двигательная активность была выше в 2 раза, чем в контроле. Этот же показатель у группы с токсической дозой ДКВ (D3 = 3 000 мг/кг) был ниже контроля в 1,5 раза (рисунок 3.48).
При изучении «норкового рефлекса» у крыс через один месяц наблюдали увеличение показателя в 2 раза от контроля в группах с дозами 86, 860 и 3000 мг/кг (рисунок 3.49). В группе получавшей витамин Р исследовательский рефлекс был ниже в 1,5 раза контроля. Изучение статического мышечного напряжения к первому месяцу показало превышение значений во всех подопытных группах по сравнению с контролем (4,6 ± 0,6 с): в группе, с ДКВ в дозе 86 мг/кг - в 2,3 раза, в группах с ДКВ в дозах 860 и 3000 мг/кг - в 1,5 раза (рисунок 3.50).
Можно отметить, что статическое мышечное напряжение во всех группах, где животные получали в ежедневном рационе ДКВ было значительно выше, в то время как в группе, которой вводился витамин Р показатель превышал значение контрольной группы. По показателям периферической крови во всех группах отмечались видимые изменения (таблица 3.5). Так, через 1 месяц после начала введения ДКВ в дозах 86, 860 мг/кг ДКВ и 86 мг/кг витамина Р содержание гемоглобина в периферической крови животных достоверно превышало контрольный уровень, в то время как в у животных, получавших ДКВ в дозе 3 000 мг/кг этот показатель был ниже контрольного.
Характерной оказалась и динамика свертывания крови (рисунок 3.51), которая заключалась в увеличении скорости образования фибрина у животных, получавших ДКВ в дозах 860, 3000 мг/кг и витамин Р в дозе 86 мг/кг.
Уровень меркаптуровых кислот, глюкуроновой кислоты и сульфатов отличались от контроля при введении ДКВ в больших дозах, а при введении препарата в меньших дозах были близки к контролю (рисунок. 3.52, 3.53, 3.54).
Из диаграммы (рисунок 3.52) видно, что содержание меркаптуровых кислот у животных, получавших препарат в дозе 3000 мг/кг, превысило уровень контроля в 1,5 раза. В остальных группах этот показатель приблизился к контролю. Аналогичные изменения наблюдались в содержании сульфатов (рисунок. 3.56): контроль (12 ± 0,64 мг/мл), ДКВ в дозе 86 мг/кг (13,04 ± 0,51 мг/мл), ДКВ в дозе 860 мг/кг (14,60 ± 1,62 мг/мл), ДКВ в дозе 3000 мг/кг (18 ± 1,90 мг/мл), витамин Р в дозе 86 мг/кг (11,5 ± 0,61 мг/мл).
К концу первого месяца, с увеличением концентрации ДКВ, наблюдалась тенденция к повышению уровня сульфатов.
Уровень глюкуроновой кислоты в моче (рисунок 3.53) в контрольной группе был 5,82 ±0,11 мг/мл сут., при применении ДКВ в дозе 86 мг/кг составил 6,72 ± 0,43 мг/мл сут., в группе получавшей ДКВ в дозе 860 мг/кг - 9,08 ± 0,72 мг/мл сут., в группе получавшей ДКВ в дозе 3000 мг/кг - 10,01 ± 0,78 мг/мл сут., при применении витамина Р в дозе 86 мг/кг - 6,45 ± 0,69 мг/мл сут.
К концу второго месяца наблюдали спад в привесе животных. Так, привес контрольной группы и группы животных, получавших ДКВ в дозе 860 мг/кг был на 23,4-25,9 % выше чем у групп, получавших ДКВ в дозах 3000 мг/кг и витамина Р в дозе 86 мг/кг (16,1-18,9 %) относительно первого месяца. Вес группы животных, получавших ДКВ в дозе 86 мг/кг увеличился на 35,0 %. Это нашло своё отражение в поведенческих реакциях животных: при приеме ДКВ двигательная активность снизилась во всех группах: при дозе 86 мг/кг - в 1,4 раза, при дозе 860 мг/кг - 1,2 раза, при дозе 3000 мг/кг - в 2,1 раза. Витамин Р в дозе 86 мг/кг не оказывал существенного влияния на двигательную активность. Аналогичная динамика прослеживалась в поведенческих реакциях и величине статического мышечного напряжения животных.
Похожие диссертации на Экспериментальное исследование ранозаживляющих свойств дигидрокверцетина при термической травме кожи.
-
-
