Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. необходимость и безопасность применения психоактивных препаратов (антидепрессантов, бензодиазепиновых транквилизаторов и ноотропов) в период беременности и лактации 10
1.1. Необходимость и безопасность применения бензодиазепи новых транквилизаторов (БДТ) в период беременности и лактации 13
1.2. Необходимость и безопасность применения антидепрессантов (АД) в период беременности и лактации 16
1.3. Необходимость и безопасность применения ноотропных препаратов (НП) в период беременности и лактации 21
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 30
2.1. Общая характеристика экспериментальных животных 30
2.2. Выбор препаратов 30
2.3. Методы исследования антенатального повреждающего действия фенотропила, регистрируемого в антенатальном периоде развития 31
2.4. Методы исследования антенатального повреждающего действия фенотропила, регистрируемого в постнатальном периоде развития 35
2.5. Статистическая обработка результатов 38
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 39
3.1. Исследование антенатального повреждающего действия фенотропила, регистрируемого в антенатальном периоде развития 39
3.2. Исследование антенатального повреждающего действия фенотропила, регистрируемого в постнатальном периоде развития 57
Заключение 85
Практические рекомендации 87
Выводы 88
Приложение 88
Библиографический список 103
- Необходимость и безопасность применения антидепрессантов (АД) в период беременности и лактации
- Необходимость и безопасность применения ноотропных препаратов (НП) в период беременности и лактации
- Методы исследования антенатального повреждающего действия фенотропила, регистрируемого в антенатальном периоде развития
- Исследование антенатального повреждающего действия фенотропила, регистрируемого в постнатальном периоде развития
Введение к работе
Актуальность проблемы. В течение последних десятилетий особое место в мировой научной медицинской литературе отводится проблеме психопатологии беременных [Сорокина Т.Т., 2003; Schaefer С., 2007]. Основой многокомпонентной терапии психических расстройств является патогенетическая психофармакотерапия. Вопреки обширности экспериментального и клинического материала, послужившего базисом для развития современной психофармакотерапии, единой и общепринятой мировой тактики ведения беременных пациенток с расстройствами психической сферы так и не сложилось. Причин тому множество, но основным ограничивающим любую фармакотерапию в период беременности фактором является влияние применяемых препаратов на эмбрион, плод и плаценту [Абрамченко В.В., 1994; Schaefer С., 2007].
Зачастую оценить точный вклад лекарственных веществ в развитие врожденной патологии сложно, прежде всего, из-за невозможности точного учета используемых при беременности препаратов, а порой и по причине бесконтрольного применения беременными лекарственных веществ. Предположительно именно лекарственные средства, принимаемые беременными в разные сроки гестации, являются причиной 1–3% врожденных аномалий [Ушкалова Е.А., 2005].
Применение лекарственных веществ при беременности остается одной из наименее изученных проблем клинической фармакологии. Считаем серьезной проблемой для практического российского здравоохранения отсутствие четкой принятой классификации вреда при использовании лекарственных препаратов в течение беременности, а также отсутствие в аналогичных международных классификациях (например, FDA) некоторых широко используемых в России групп препаратов (например, ноотропов). Для коррекции патологически протекающей беременности и родов может быть необходимо использование препаратов метаболического и ноотропного действия. Список разрешенных для применения в период беременности ЛВ указанных групп весьма скуден: из группы ноотропных препаратов используется только пирацетам, в качестве средств метаболической терапии – глюкоза, аскорбиновая кислота и поливитаминные препараты. Антидепрессанты первого ряда (селективные ингибиторы обратного захвата серотонина, селективные стимуляторы обратного захвата серотонина, обратимые ингибиторы МАО-А и др.) [Крылов В.И., 2003] в России в период беременности не назначаются из-за их дороговизны; препараты второго ряда (трициклические антидепрессанты и др.) не показаны беременным по причине их плохой переносимости.
Ввиду отсутствия литературных данных об эмбрио- и фетотоксичности ноотропного препарата с нейромодуляторными свойствами фенотропила нам представляется необходимым проведение экспериментальных исследований влияния фенотропила, вводимого пренатально, на пренатальное и постнатальное развитие животных. Выполнение данных исследований необходимо для решения вопроса о сообразности дальнейших клинических исследований применения фенотропила в период беременности для коррекции психических нарушений, что и позволило нам определить цель и задачи настоящего исследования.
Цель работы – в эксперименте на животных оценить эмбрио- и фетотоксическое влияние нейромодулятора фенотропила в анте- и постнатальном периодах развития.
Задачи
-
В эксперименте на белых крысах исследовать влияние фенотропила, вводимого в различных дозах в течение беременности, на внутриутробное развитие плодов крыс; выявить возможные эмбрио- и фетотоксические эффекты фенотропила.
-
Изучить влияние разных доз фенотропила на гистологическую структуру плацентарного комплекса при введении фенотропила беременным крысам.
-
Определить влияние фенотропила на течение беременности, а так же на ориентировочно-исследовательское поведение беременных крыс, получавших фенотропил в разных дозах.
-
Изучить влияние фенотропила, вводимого пренатально в разных дозах, на постнатальное сенсомоторное и биологическое развитие потомства белых крыс.
-
Изучить влияние фенотропила, вводимого беременным крысам в разных дозах, на показатели клеточного состава периферической крови потомства.
Научная новизна исследований определяется тем, что впервые изучено влияние фенотропила, вводимого в различных дозах беременным беспородным белым крысам, на течение беременности крыс, пренатальное развитие потомства. Нами изучено влияние фенотропила, вводимого беременным самкам белых крыс, на плацентарный комплекс – с использованием стандартных гистологических методов и на постнатальное развитие потомства – при помощи тестов развития сенсомоторной сферы и теста исследования ориентировочно-исследовательского поведения «Открытое поле». Использование модернизированной установки «Открытое поле», снабженной автоматизированной системой регистрации, позволило значительно повысить точность подсчета локомоций и исключить субъективный фактор при исследовании параметров двигательной активности.
Необходимо отметить, что впервые эмбрио- и фетотоксические свойства фенотропила изучены в сравнительном аспекте с эталонным ноотропным препаратом пирацетамом.
Тератогенных свойств у фенотропила не выявлено. Однако совокупность изменений постнатального развития потомства, получавшего внутриутробно фенотропил, расценена нами как свидетельство формирования комплекса ответных реакций на минимальное повреждающее воздействие, которым являлось введение ксенобиотика фенотропила. Нами выявлено наличие у фенотропила колоколообразной зависимости «доза-эффект», характерной для других препаратов ноотропного ряда.
Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость работы состоит в получении новых экспериментальных данных о влиянии фенотропила, вводимого беременным беспородным крысам, на пренатальное и постнатальное развитие потомства. Полученные данные позволяют в новом свете оценить влияние ноотропных препаратов с метаболической активностью на эмбрион, плод, плаценту. Практическая значимость определяется разработкой и модификацией морфологических и экспериментальных методик изучения эмбрио- и фетотоксичности ЛВ (методики Вильсона, Стейплса, Доусона), тестов развития сенсомоторной сферы, теста «Открытое поле». Выявленные особенности развития потомства, получавшего внутриутробно фенотропил, позволяют дополнить данные ранее выполненных доклинических исследований, являющихся основой для клинических исследований фенотропила в акушерской практике.
Положения, выносимые на защиту:
-
В эксперименте на белых беспородных крысах фенотропил, вводимый в период беременности, не индуцирует развития неправильностей формирования структуры и топографии внутренних органов у потомства.
-
Фенотропил, вводимый в среднеэффективной дозе беременным крысам, приводит к уменьшению численности плодов в помете, что сочетается с повышением средних массы и длины плодов; вызывает уменьшение количества точек окостенения скелета задних конечностей плодов. Перечисленные эффекты при увеличении дозы фенотропила в 4 раза не воспроизводятся. Фенотропил приводит к увеличению относительных масс внутренних органов плодов (сердца, почек и тимуса), что обусловлено метаболическим эффектом препарата.
-
Фенотропил индуцирует развитие адаптационных процессов в фетоплацентарном комплексе крыс, расцениваемых как реакция на минимальное повреждающее воздействие.
-
В тесте «Открытое поле» выявлено разнонаправленное влияние фенотропила на ориентировочно-исследовательское поведение беременных крыс. Свойства фенотропила могут быть охарактеризованы колоколообразной зависимостью «доза-эффект», характерной для других ноотропных препаратов.
-
Исследование формирования рефлексов потомства выявило, что фенотропил, вводимый беременным самкам белых беспородных крыс, вызывает ускорение созревания сенсомоторной сферы потомства. В тесте «Открытое поле» выявлено, что фенотропил повышает исследовательскую активность потомства при первичном предъявлении условий эксперимента, а так же ускоряет процесс адаптации потомства к новым условиям среды.
Апробация диссертационного материала. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2008), I Всероссийском конгрессе молодых ученых в области медицины и биологии по итогам конкурса «Свет знаний во имя здоровья человека» (Москва, 2009), Съезде терапевтов Юга России «Врач ХХI века: сегодня и завтра» (Ростов-на-Дону, 2009), IV Национальном конгрессе терапевтов (ХХ Съезд российских терапевтов) (Москва, 2009).
Публикация результатов исследования. По результатам диссертационного исследования опубликовано 6 научных работ, из них в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК – 2.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 28 таблицами, 16 фотографиями и 30 рисунками. Библиографический указатель содержит 49 отечественных и 81 иностранный источников.
Необходимость и безопасность применения антидепрессантов (АД) в период беременности и лактации
В 70-80-е годы XX века было сделано множество сообщений о развитии врожденных аномалий (аномалии сердца, конечностей, полидактилия, ги-поспадия) у новорожденных, получавших ТЦА внутриутробно [91]. Однако причинно-следственная связь между приемом этих препаратов и развитием мальформаций не установлена до настоящего времени [74, 120]. Проспективные и ретроспективные исследования, посвященные изучению риска органной дисгенезии после использования ТЦА в первом триместре беременности, не выявили повышения риска развития врожденных аномалий [64]. Согласно другим данным, использование матерью ТЦА повышает риск спонтанных выкидышей, однако депрессия без лечения также может выступать как фактор риска прерывания беременности [55]. У новорожденных, чьи матери принимали ТЦА длительно, отмечены краткосрочные симптомы отмены ТЦА — судорожный синдром, плаксивость [86]. Nulman [107, 108] не обнаружил влияния внутриутробного воздействия ТЦА на последующее развитие когнитивных, поведенческих и речевой функций детей до 6 лет.
При назначении ТЦА во время беременности рекомендуется определение сывороточной концентрации препаратов в крови матери с целью коррекции дозы JIB для оптимизации терапевтического эффекта и уменьшения выраженности НЛР со стороны плода [119].
Клинические данные об использовании ТЦА в период лактации свидетельствуют об их минимальном влиянии на организм новорожденного. Wiessman [126] и Yoshida [130] не наблюдали изменения развития детей, вскармливаемых матерями, принимавшими амитриптилин. При проведении фармако-кинетического исследования на 4 парах мать-дитя (кормящие матери принимали кломипрамин в дозах 75-125 мг/сутки), Wisner не обнаружил препарат и его метаболиты в сыворотке детей [128].
По физико-химическим свойствам молекулы ТЦА липофильны, поэтому легко проникают через все гистогематические барьеры, в том числе - плацентарный [119]. Экспериментальные данные Cuomo свидетельствуют о глубоких нарушениях нейрохимических процессов, развития и созревания нервной системы у потомства, получавшего пренатально ТЦА [69]. У животных, пренатально получавших имипрамин и кломипрамин, было выявлено снижение уровня гипоталамического дофамина, числа р-адренорецепторов коры [85, 123]. У крысят, получавших внутриутробно амитриптилин, на первый день жизни выявлено снижение уровня основного метаболита серотонина в головном мозге - 5-гидроксииндолуксусной кислоты [54].
Длительное применение амитриптилина у беременных крыс приводит к изменениям локомоторной активности потомства [54], пренатальное воздействие других ТЦА (имипрамин и дезипрамин) приводит как к кратковременным, так и к длительным нарушениям развития — задержке созревания рефлексов избегания обрыва и отрицательного геотаксиса [85], ослаблению подвижности и обучаемости [68].
Селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (СИ-ОЗС) Результаты клинических исследований вреда, наносимого пренатальным использованием СИОЗС, противоречивы. В исследованиях, посвященных изучению эмбрио- и фетотоксического действия СИОЗС, принимаемых в первом триместре беременности, не выявлено увеличения уровня значимых аномалий развития [58, 74, 82, 90]. Однако Kallen [87] и Diav-Citrin [71] высказывают предположение о связи между приемом флуоксетина в первом триместре беременности и развитием кардиоваскулярных аномалий, в частности пороков межпредсердной и межжелудочковой перегородок. Опубликованный Rossi [113] обзор исследований, выполненных в период с 1966 по 2003 годы об использовании флуоксетина во время беременности и проведенный мета-анализ, не выявили зависимости между использованием флуоксетина в первом триместре беременности и развитием больших врожденных аномалий у потомства. Chambers et al. [120] в клинических исследованиях типа «случай-контроль» выявлена связь между приемом беременными после 20 недели гестации препаратов группы СИОЗС и развитием персистирующей легочной гипертензии у новорожденных. Alwan [53] сообщает о зависимости между приемом беременными пароксетина и рождением у этих женщин детей с пупочной грыжей, кроме того, высказывает предположение о развитии на фоне приема препаратов группы СИОЗС краниосиностоза (преждевременной оссификации черепа и облитерации швов).
Согласно данным S.A. Tabakova [122] у новорожденных, получавших циталопрам внутриутробно, были выявлены аномалии развития зрительного анализатора - дефекты зрительного нерва и сетчатки. В нескольких исследованиях сообщается о связи между повышением вероятности преждевременных родов и использованием препаратов группы СИОЗС в течение всей беременности или во второй ее половине [86, 66,-120, 74]. Simon [120] пишет о малом весе новорожденных, подвергшихся внутриутробно воздействию СИОЗС, однако к шести месячному возрасту вес этих детей нормализовался.
С использованием СИОЗС беременными так же связано нарушение системы гемостаза у потомства, что, по-видимому, обусловлено блоком обмена серотонина, участвующего в тромбогенезе [89]. Nordeng [102] сообщает о четырех случаях внутрижелудочковых кровоизлияний у новорожденных, чьи матери принимали в поздние сроки гестации СИОЗС.
Развивающийся в 30-60% у новорожденных после воздействия in utero СИОЗС синдром отмены проявляется тремором, повышенным мышечным тонусом, респираторным дистрессом, нарушением пищеварения и сна, раздражительностью, ажитацией, плаксивостью [100, 102].
Исследования развития детей, получавших СИОЗС внутриутробно, не выявили отставания в развитии когнитивных, поведенческих, речевой функций по сравнению с детьми контрольной группы [78, 104, 102]. Однако Matt-sone [102] сообщает о небольшом отставании в моторном развитии детей, подвергшихся воздействию СИОЗС внутриутробно.
В ряде публикаций рассматриваются НЛР со стороны новорожденного при использовании СИОЗС в период лактации. Lester [112] сообщает о таких НЛР как жидкий стул, рвота, плаксивость у детей, чьи матери принимают флуоксетин; симптомы исчезают при переходе на искусственное вскармливание. Масса детей, чьи матери в период лактации принимают флуоксетин, достоверно меньше массы детей контрольной группы [63]. Концентрация СИОЗС в секретируемом молоке выше по сравнению с ТЦА, кроме того, период полувыведения у СИОЗС выше, чем у ТЦА. Возможно по этим причинам частота НЛР у новорожденных, вскармливаемых матерями, принимающими СИОЗС выше, чем у новорожденных, чьи матери принимают ТЦА [126].
Необходимость и безопасность применения ноотропных препаратов (НП) в период беременности и лактации
Класс НП согласно принятой у нас в стране классификации психотропных препаратов относятся к группе психоаналептиков. Ноотропы активно используются в неврологической и общеклинической практике в России и в других странах мира. По статистике ВОЗ, треть взрослого населения Европы и Японии принимает ноотропы, и их с полным основанием можно отнести к группе жизненно важных препаратов [10].
Группа ноотропных препаратов чрезвычайно разнообразна как по химическому строению, так и по механизмам действия, однако все препараты объединяет наличие ноотропного эффекта — способности улучшать процессы обучения и памяти, а так же наличие адаптогенного действия — НП повышают устойчивость мозга к различным патогенным воздействиям и гипоксии [16]. Наиболее известными и признанными в мире являются ЛВ из группы пирролидонов; к этой группе относятся: пирацетам («эталонный» ноотропный препарат), этирацетам, анирацетам, оксирацетам, прамирецетам, дипрацетам, ползирецетам, фенотропил и др. [14, 16].
В общеклинической практике используются следующие клинические эффекты НП [42]: 1) собственно ноотропное действие, т.е. улучшение интеллектуальных способностей за счет влияния на нарушенные высшие корковые функции, уровень суждений; 2) мнемотропное действие, а именно улучшение памяти, повышение успешности обучения; 3) повышение уровня бодрствования, ясности сознания ввиду влияния на состояние угнетенного и помраченного сознания; 4) адаптогенное действие - повышение толерантности к различным экзогенным и психогенным неблагоприятным воздействиям, в том числе медикаментам, повышение общей устойчивости организма к действию экстремальных факторов; 5) антиастеническое действие, а именно уменьшение явлений слабости, вялости, истощаемости, явлений психической и физической астении; 6) психостимулирующее действие ввиду эффективности при апатии, гиподинамии, гипобулии, аспонтанности, бедности побуждений, психической инертности, двигательной и интеллектуальной заторможенности; 7) анксиолитическое (транквилизирующее) действие — уменьшение чувства тревоги, эмоциональной напряженности; 8) седативное действие, уменьшение раздражительности и эмоциональной возбудимости; 9) антидепрессивное действие; 10) вегетативное действие - эффективность при головной боли, головокружении, церебрастеническом синдроме; 11) антикинетическое действи е; 12) противопаркинсоническое действие; 13) противоэпилептическое действие, влияние на эпилептическую паро-ксизмальную активность. Множественность эффектов ноотропов обусловлена не единственным механизмом, а оптимизацией взаимодействия различных биологических систем. Ноотропы имеют множественные точки приложения, вовлекая в механизм своего действия большое количество анатомо-функциональных систем — нейротрансмиттерные, сосудистые, метаболизм клетки, реологические и т. д. Многокомпонентность действия этих препаратов, регулирующих множество метаболических, нейромедиаторных и других сдвигов в организме, тем самым расширяет компенсаторные возможности мозговых структур [1]. НП, обладающие различным спектром фармакологической активности, проявляют однотипное адаптогенное действие. Ноотропы регулируют адекватность ответа на силу раздражителя, повышая тем самым устойчивость к стрессу. К транквилизирующему или психостимулирующему компоненту действия НП нельзя подходить с общепринятых фармакологических и клинических принципов понимания этих эффектов — в зависимости от дозы и состояния организма НП проявляют как транквилизирующий, так и психостимулирующий эффекты. По всей вероятности, адаптогенное действие ноотропов напрямую связано с ноотропным эффектом и, по-видимому, является одним из основных фармакологических тестов для этой группы лекарственных препаратов. Экспериментальные данные дают возможность более четко разграничить понятия «стресс-протекторное» (антистрессорное — подавление транквилизаторами ответа ЦНС на стресс-реакцию является классическим проявлением пассивной защиты) и «адаптогенное» действие (сохранение ноотропами достаточного уровня активности мозга позволяет формировать активную защиту при стресс-воздействии, что повышает устойчивость организма и расширяет его адаптационные возможности) [9].
Необходимо отметить, что адаптогенное действие НП развивается уже после однократного применения. Проявление других совойств НП зависит от дозы препарата. Например, при использовании пирацетама в диапазоне доз 100-300 мг/кг проявляются его ноотропные свойства, при увеличении дозы до 400-1000 мг/кг - анксиолитический эффект, то есть ноотропный и анксиолитический эффекты пирацетама не развиваются параллельно, а проявление эффекта зависит от дозы препарата [25].
Группу пирролидонов относят к веществам нерецепторного типа действия [1, 14, 47, 92]. Например, влияние пирацетама на функционирование нейротрансмиттерных систем обусловлено его способностью выступать в качестве нейромодулятора, повышающего количество рецепторов на пост-синаптической мембране и сохраняющего их нормальное функционирование [127].
Предполагаются следующие механизмы реализации фармакологических эффектов пирролидонов (на примере пирацетама): повышение утилизации глюкозы; снижение активности Nab-K+-АТФазы, угнетение кортикального выброса L-пролина, являющегося мнестической аминокислотой; оптимизация биоэнергетических процессов в нервной клетке; повышение скорости оборота информационных макромолекул - повышение уровеня АТФ за счёт активации аде-нилатциклазы, фермента, катализирующего превращение АДФ в АТФ; ингибирование фермента нуклеотидфосфатазы; активация пластических процессов за счет усиления синтеза белка и ядерной РНК в мозге [1, 10, 16,14,101].
Методы исследования антенатального повреждающего действия фенотропила, регистрируемого в антенатальном периоде развития
Изучение безопасности фенотропила в антенатальном периоде проводили на беспородных виргинных крысах 3-х групп (п=15 в каждой группе) с исходной массой 200-300 г. Животным вводили следующие препараты: 5% крахмальный гель (растворитель) - I группа (контроль); фенотропил 100 мг/кг — II; фенотропил 400 мг/кг - III. Препараты вводили внутрижелудочно через зонд (субстанцию фенотропила разводили на 5% крахмальном геле) один раз в сутки в одно и то же время с 1 по 19 дни беременности (расчёт первого дня беременности — день обнаружения сперматозоидов во влагалищном мазке самок после ссаживания их с интактными самцами в соотношении 2:1). На 20 день беременности под эфирным наркозом производили эвтаназию крыс, их вскрытие с последующим выявлением морфологических пороков развития (аномалии развития внутренних органов и скелета) и общей задержки развития плодов. Эвтаназию самок осуществляли дислокацией шейных позвонков. Вскрывали брюшную полость, вырезали матку, переносили в чашку Петри с физиологическим раствором. Вскрывали рога матки, подсчитывали количество живых, мертвых, резорбцированных плодов. Вынимали плоды, освобождали их из оболочек. Все плоды каждого помета обследовали под бинокулярным микроскопом для обнаружения внешних видимых аномалий развития. После этого плоды взвешивали, отмечали состояние каждого плода и отмечали наличие видимых аномалий. После наружного осмотра плоды каждого помета делили на три группы. Одну группу плодов фиксировали в жидкости Боуэна и использовали для изучения внутренних органов по методике Вильсона. Вторую группу фиксировали в 10% формалине и проводили исследование внутренних органов по Стейплсу. Третью группу плодов фиксировали в 96 этаноле и использовали для изучения состояния скелета по методике Доусона, модифицированной в отделе эмбриологии НИИЭМ АМН СССР. Одновременно с извлечением плодов из матки крыс проводили извлечение плацент с их последующим гистологическим исследованием.
Исследования проводили на плодах, которые фиксировали в жидкости Буоэна не менее 1 недели. Плод укрепляли на пробковом столике и, при помощи безопасной бритвы, разрезом параллельно нижней челюсти отделяли голову от туловища. Первый разрез головы проводили перпендикулярно нижней челюсти непосредственно за вибрисами. Второй разрез проводили через середину глазных яблок. Третий разрез — через большой поперечный диаметр черепа. Четвертый разрез — параллельно третьему. Исследовали мозжечок и продолговатый мозг. Пятый разрез — через гортань, пищевод, спинной мозг, сосуды и слюнные железы. Шестым разрезом отсекали шею от туловища. Разрез проводили перед передними лапами. Оценивали пищевод, трахею, спинной мозг, крупные сосуды. Седьмой разрез - через органы грудной клетки непосредственно за передними конечностями. На разрезе оценивали синтопию сердца, легких, бронхов, пищевода, спинного мозга. Восьмой разрез выполняли по середине между седьмым разрезом и пупочным кольцом. Осматривали печень, а затем удаляли ее пинцетом и исследовали состояние диафрагмы. Девятый разрез производили ниже пупочного кольца, после чего оценивали кишечник, поджелудочную железу. Удалив петли кишечника и печень, наблюдали органы таза: почки, мочеточники, мочевой пузырь, прямую кишку, внутренние половые органы. Исследовали топографию почек, матки с придатками и тестикул.
После внешнего осмотра живых плодов на наличие аномалий развития, определения массы и краниокаудального размера, производили декапитацию. Декапитированный плод фиксировали, глазными ножницами разрезали переднюю брюшную стенку и грудь вдоль левого края грудины. Пинцетом удаляли вилочковую железу и исследовали топографию и состояние крупных сосудов, отходящих от сердца (правая и левая подключичные артерии, общая сонная артерия, нисходящая аорта и легочная артерия), обращали внимание на их форму и размеры. Пинцетом фиксировали сердце за ушко правого предсердия, рассекали сердце ножницами двумя разрезами от верхушки к основанию (1-правее, 2-левее межжелудочковой перегородки) и исследовали состояние межжелудочковой перегородки и клапанов. Затем исследовали со-стояние легких (количество долей) и органов брюшной полости. После извлечения печени, определяли состояние диафрагмы, а удалив петли кишечника, осматривали надпочечники, почки, мочеточники и мочевой пузырь. Почки разрезали на уровне почечных лоханок и исследовали их. Определяли абсолютную и относительную массу вилочковой железы, сердца, почек. Устанавливали пол плода и изучали топографию половых органов.
Окрашивание скелета ализарином (методика Доусона, модифицированная в отделе эмбриологии НИИЭМ АМН СССР) Плоды фиксировали в 96 этаноле не менее 7 дней. Объем спирта превышал объем фиксируемых плодов в 10 раз. После фиксации у плодов удаля ли внутренности и погружали в 1% раствор КОН для просветления мягких тканей. Время пребывания плодов в этом растворе определяли эмпирически (примерно 1-2 суток). Когда становились видны закладки костей, плоды вынимали, промывали водопроводной водой и переносили их в раствор А (150 мл глицерина, 300 мл дистиллированной воды и 10 г КОН), к которому добавляли несколько капель раствора Б (1% раствор ализарина красного) до появления светло-фиолетового окрашивания. Через 3-5 суток окостеневшие участки скелета окрашивались в красно-фиолетовый цвет. Для обесцвечивания мягких тканей плоды переносили в раствор А на 7-14 дней, затем их проводили через смеси глицерина, спирта и воды с целью обезвоживания (1:2:7,2:2:6,4:4:2, равные части спирта и глицерина, чистый глицерин с добавлением 1-2 капель формалина). Плоды изучали под микроскопом МБС, учитывали аномалии скелета, количество точек окостенения в различных костных образованиях.
С целью изучения влияния фенотропила, вводимого беременным самкам, на морфологическую структуру плацент нами проведено гистологическое исследование и сравнительный анализ плацент крыс перечисленных групп. Извлечение плацент из матки крыс проводили одновременно с извлечением плодов на 20 день от обнаружения сперматозоидов во влагалищных мазках крыс. Из каждой группы нами произведено гистологическое исследование 10 плацент, полученных от разных самок. Согласно стандартным методикам изготовления гистологических препаратов, кусочки ткани плацент крыс размером 5x10 мм фиксировали в 10% растворе забуференного формалина, далее проводили по спиртам возрастающей крепости. Затем кусочки ткани заливали парафином, изготавливая парафиновые бруски, на микротоме выполняли гистологические срезы толщиной 5 мкм. Полученные гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином, реактивом Шиффа по ШИК для обнаружения гликогена и гликопротеидов.
Исследование антенатального повреждающего действия фенотропила, регистрируемого в постнатальном периоде развития
Выявленное уменьшение толщины трофобласта свидетельствовует об истончении плацентарного барьера, что может быть расценено как признак зрелости плаценты [20].
Окраска по ШИК использовалась для идентификации гликогеновых клеток в плаценте. Согласно литературным данным [2], наличие достаточного количества гликогена в гликогеновых клетках характеризует оптимальность обменных процессов в плацентарном комплексе, является показателем гестационного возраста плаценты, а так же косвенно свидетельствует о неос-ложненном течении беременности. При окраске по ШИК препаратов плацент крыс контрольной группы (рис.5) выявлено истощение запаса гликогена в гликогеновых клетках, что дает основание предположить «зрелость» плаценты, т.е. соответствие выявленной морфологической картины гестационному сроку, или напряжение компенсаторных механизмов фетоплацентарного комплекса, поскольку запас гликогена уменьшается к концу беременности и при осложненном ее течении. Выявленные при гистологическом исследовании плацент крыс контрольной группы морфологические признаки, согласуются с литературными данными описания нормальной гистологической картины плаценты крыс, наблюдаемой в конце беременности [2, 20, 21].
При гистологическом исследовании плацент крыс, получавших фен-тропил в дозе 100 мг/кг, были выявлены отложения фибрина и очаги кровоизлияний над базальным отделом плаценты (рис.6). В базальном отделе обнаружены: неравномерное расширение материнских сосудов, расположенные в виде тяжей, инвагинирующих в лабиринт, базофильные клетки. Кроме того, обнаружены крупные полиморфные клетки с гиперхромными ядрами (рис.7). В лабиринтном отделе обнаружены фокусы кровоизлияний, материнские лакуны расширены, заполнены кровью (рис.8), базальные мембраны нечеткие. В плаценте крыс, получавших фенотропил в дозе 100 мг/кг, выявлено увеличение количества гликогена в гликогеновых клетках лабиринтного и базального отделов по сравнению с контрольной группой и группой, получавшей фенотропил 400 мг/кг (свидетельством этого является большая интенсивность окрашивания по ШИК — см. рис.9-10).
При гистологическом исследовании плацент крыс, получавших фен-тропил в дозе 400 мг/кг, примечательно расширение базального отдела плацент; в нем обнаружены фокусы некроза и кариорексиса (рис. 11). Материнские сосуды базального отдела плаценты расширены, в них выявлен облите-рирующий тромбоз, который ведет к уменьшению площади материнских лакун. Изменение кровообращения в материнских сосудах базального отдела плаценты наряду с признаками ишемии (некроз и кариорексис) свидетельствуют о формировании дисциркуляторных расстройств в плаценте (рис. 12). В базальном отделе обнаружены крупные полиморфные клетки с гиперхром-ными ядрами (рис. 13). В лабиринтном отделе плаценты выявлены клеточные тяжи, образованные крупными полигональными базофильными клетками (рис.14), фокусы кровоизлияний (рис. 15-16). Материнские лакуны дилятиро-ваны, базальные мембраны нечеткие, в лакунах - застойное полнокровие, неразрешенное сладжирование эритроцитов. Околоворсиннчатые пространства расширены, заполнены кровью. Плодовые капилляры сужены, запустевшие, местами спавшиеся. При окраске по ШИК гистологических препаратов плацент крыс, получавших фенотропил 400 мг/кг, в специализированных клетках лабиринтного и базального отделов плаценты выявлено снижение количества гликогена (рис. 17), что косвенно свидетельствует об уменьшении запаса энергетических субстратов и, следовательно - о напряжении компенсаторных механизмов фетоплацентарного комплекса [2].
С целью обсуждения результатов наших исследований мы выполнили обзор литературы, посвященной экспериментальным исследованиям изменений фетоплацентарного комплекса беременных крыс в ответ на воздействия патологических агентов. Ряд авторов сообщает о неспецифичности морфологических изменений фетоплацентарного комплекса. Например, Н.А. Пятышкина [30] сообщает о повышении кровенаполнения материнской части лабиринтного отдела плаценты при гипоксической гипоксии, что приводит к растяжению лакун и расширению околоворсинчатого пространства, следствием чего является оптимизация газообмена при контакте ворсин и крови матери. В статье Т.Г. Авакян [2], посвященной изучению гемодинамических расстройств плаценты, возникающих при экспериментальном краш-синдроме у беременных крыс, сообщает о выраженном расширении кровяных лакун, явлениях стаза, сладжирования и агрегации эритроцитов, диапедезных и мелкоочаговых кровоизлияниях в материнской части плаценты. Г.В. Куликова [21] обнаружила нарушения кровообращения в виде полнокровия сосудов в спонгиозном слое и сладжирования эритроцитов в лабиринтном отделе плацент крыс, подвергшихся воздействию свинца, присутствовавшего в питьевой воде в концентрации 0,3 мг/л, в течение месяца до беременности и на протяжении всей беременности. Р.А. Кузнецов [20] на модели экспериментальной плацентарной недостаточности у крыс (лигирование трети пучка преплацентарных артерий на 15-й день беременности) показал, что возможности адаптации структур плацент крыс к изменяющимся условиям кровоснабжения ограничены по сравнению с человеком, они проявляются в основном увеличением количества, площади и степени кровенаполнения материнских синусоидов, лакун и плодовых капилляров. Как сообщает автор, в плацентах крыс с нарушенным маточным и плацентарным кровотоком адаптационные процессы представлены дилятацией материнских лакун, что приводит к замедлению кровотока и развитию стазов в них, поэтому механизмы указанной адаптации малоэффективны. Следствием слабой выраженности приспособительных процессов и их несостоятельности может стать задержка внутриутробного развития плодов — уменьшение их массы и длины тела.
