Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы . 12
1.1. Фармакологические эффекты пептидных лекарственных препаратов . 12
1.1.1 Опиоидные пептиды и их эффекты 12
1.1.2 Фармакологические эффекты пептидных иммуномодуляторов . 17
1.1.3 Влияние регуляторного пептида глицил-гистидил-лизина на функ-ции организма 22
1.2 Изменения показателей гомеостаза при травмах и их фармакологиче-ская коррекция . 24
1.3 Репаративная регенерация поврежденных тканей . 27
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 36
2.1 Экспериментальные исследования 36
2.2 Использованные препараты и способы их применения 36
2.3 Экспериментальные модели и способы оценки репаративной регенера-ции кожи и костей 37
2.4 Гистологические исследования . 38
2.5 Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов и кислородзависимых механизмов антиинфекционной защиты 39
2.6 Определение оксидантных и антиоксидантных показателей крови . 39
2.7 Статистическая обработка материала 40
ГЛАВА 3 Результаты собственных исследований. 41
3.1 Влияние глицил-гистидил-лизина, тимогена, даларгина, а также их комбинаций на заживление кожных ран, функцию нейтрофилов и актив-ность свободно-радикальных реакций при внутрибрюшинном введении 41
3.2 Репаративная, иммунотропная и антиоксидантная активности глицил-гистидил-лизина, тимогена, даларгина и их парных сочетаний в условиях кожных ран при внутрикожном введении 58
3.3 Эффекты глицил-гистидил-лизина, тимогена, даларгина и их комбинаций при внутрибрюшинном введении.
3.4 Репаративные, иммунотропные и антиоксидантные эффекты глицил-гистидил-лизина, тимогена, даларгина и их парных сочетаний при внутри-костном введении в условиях экспериментального перелома 90
ГЛАВА 4 Обсуждение полученных результатов
Выводы 112
Список сокращений 115
Список литературы 117
- Влияние регуляторного пептида глицил-гистидил-лизина на функ-ции организма
- Экспериментальные модели и способы оценки репаративной регенера-ции кожи и костей
- Влияние глицил-гистидил-лизина, тимогена, даларгина, а также их комбинаций на заживление кожных ран, функцию нейтрофилов и актив-ность свободно-радикальных реакций при внутрибрюшинном введении
- Репаративные, иммунотропные и антиоксидантные эффекты глицил-гистидил-лизина, тимогена, даларгина и их парных сочетаний при внутри-костном введении в условиях экспериментального перелома
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В последние годы рост травматизма наблюдается во многих странах, в том числе и в России, где травмы вышли на 2-е место среди причин временной нетрудоспособности (Андреева Т.М., 2010). Травматизм не только занимает ведущее место в структуре заболеваемости, но и является одной из основных причин первичной инвалидности и смертности взрослого населения и детей (Вишневский А.А., 2009). В связи с этим по-прежнему актуален поиск новых эффективных средств, стимулирующих заживление поврежденных тканей (Лазарь А.Д., 2010).
Репарация кожи и костной ткани находится под контролем механизмов, в которых принимают участие регуляторные системы организма: нервная, эндокринная, иммунная. Компонентами этих систем являются пептидные молекулы, осуществляющие их взаимодействие (Акмаев И.Г., 1996; Бердюгина О.В., 2009). Такие пептидные препараты, как миелопид, семакс, тимоген, даларгин, иммунофан, дельтаран и другие уже нашли применение в клинической практике, что свидетельствует о важном практическом значении этих исследований (Болдырева И.В., 2009, Орлова А.Ю., 2009; Строев Ю.В., 2011).
Также известен трипептид глицил-гистидил-лизин или Gly-His-Lys (GHL), который стимулирует процессы роста и дифференцировки клеток (Trachly, 1991). Первоначально он был назван фактором роста клеток печени, так как одним из его первых обнаруженных эффектов было повышение выживаемости гепатоцитов in vitro (Maquart F.X et al., 1993; Гомазков О.А., 1995). При этом выявление репаративных эффектов GHL в условиях целостного организма по-прежнему актуально.
В то же время получены убедительные данные о существенном влиянии иммунной системы на восстановительные процессы опорно-двигательного аппарата и кожи (Бердюгина О.В., 2009, Склянчук Е.Д., 2009). В связи с этим при травмах целесообразно дальнейшее выявление эффектов и механизмов действия пептидного иммуномодулятора - тимогена (Glu-Trp). При этом особенно важную роль в ранозаживлении играют нейтрофилы, которые первыми из фагоцитов приходят в очаг воспаления и от активности которых существенно зависит вероятность нагноения и длительность патологического процесса (Фрейдлин И.С., 2001).
В то же время повреждение тканей и органов вызывает развитие окислительного стресса с повышенным образованием активных форм кислорода (Воронина Т.А., 2001; Прокопенко Л.Г. и др., 2003; Giray Belma et al., 2003). Поэтому в этих условиях актуально не только выявление репаративных эффектов, но и изучение механизмов действия пептидов в отношении активности свободно-радикальных реакций.
В связи с наличием болевого синдрома при травмах также представляется целесообразным выявление эффектов опиодных пептидов, являющихся компонентами стресс-лимитирующей системы организма (Лишманов Ю.Б. и др, 2012). Опиатные рецепторы для энкефалинов обнаружены в большинстве органов и тканей (Максакова Е.В., 2000) . Эти факты обусловили выбор для исследования аналога природного лейэнкефалина – даларгина.
В то же время в нейроэндокринной регуляции значительный интерес представляют вопросы потенцирования или ослабления эффектов регулятор-ных пептидов (Розен В.Б., 1994; Акмаев И.Г., 2001), в связи с чем также целесообразно изучение эффектов комбинированного введения пептидных субстанций.
Степень разработанности темы исследования. В доступной литературе отсутствует сравнительная оценка репаративных, иммунотропных и антиокси-дантных эффектов пептидов различных функциональных групп при травмах кожи и костей, а также степени выраженности этих эффектов в зависимости от способа введения пептидов. Большинство выполненных исследований с пептидом GHL проведено in vitro, а не в условиях целостного организма. Кроме того, вопросы потенцирования или ослабления эффектов регуляторных пептидов остаются малоизученной областью медицины, а эффекты комбинированного введения таких пептидов как глицил-гистидил-лизин (GHL), тимоген и даларгин при травмах кожи и костей неизвестны.
Цель исследования. Целью исследования является выявление репара-тивных, иммунотропных и антиоксидантных эффектов регуляторных пептидов глицил-гистидил-лизина, тимогена, даларгина и их комбинаций при травмах кожи и костей.
Задачи исследования:
Выяснить особенности влияния трипептида глицил-гистидил-лизина,
тимогена, даларгина и их комбинаций на репаративную регенерацию кожи, ак
тивность нейтрофилов и свободно-радикальных реакций при внутрибрюшин-
ном введении.
Выявить репаративные, иммунотропные, антиоксидантные эффекты
глицил-гистидил-лизина, тимогена, даларгина и их парных сочетаний в усло
виях кожных ран при внутрикожном введении.
Установить особенности действия глицил-гистидил-лизина, тимогена,
даларгина и их комбинаций на выраженность репаративного остеогенеза, ак
тивность нейтрофилов и свободно-радикальных реакций при внутрибрюшин-
ном введении.
Выявить репаративные, иммунотропные, антиоксидантные эффекты
глицил-гистидил-лизина, тимогена, даларгина и их сочетаний при внутрикост-
ном введении в условиях экспериментального перелома.
Провести сравнительную оценку эффективности глицил-гистидил-
лизина, тимогена, даларгина и их комбинаций при травмах кожи и костей.
Научная новизна. Установлены репаративные и антиоксидантные эффекты регуляторных пептидов глицил-гистидил-лизина (GHL), тимогена, да-ларгина и стимулирующее действие тимогена и даларгина на активность ней-трофилов крови в условиях кожных ран как при внутрибрюшинном, так и при внутрикожном способах введения. Показана более выраженная репаративная активность пептида GHL по сравнению с тимогеном или даларгином при внут-рикожном способе введения в эквимолярных дозах. Выявлено синергичное действие парных комбинаций пептида GHL, тимогена и даларгина в отношении
репаративной регенерации кожи, функции нейтрофилов крови и антиоксидант-ной активности при внутрибрюшинном и внутрикожном способах введения.
Установлены репаративные, антиоксидантные эффекты пептида GHL, тимогена, даларгина и их стимулирующее действие на активность нейтрофилов крови при переломе трубчатых костей, как при внутрибрюшинном, так и при внутрикостном способах введения. Показана более выраженная репаративная активность пептида GHL по сравнению с тимогеном или даларгином при внут-рикостном способе введения в эквимолярных дозах. Выявлено синергичное действие парных комбинаций пептида GHL, тимогена и даларгина в отношении репаративного остеогенеза, антиоксидантной активности и функции нейтрофи-лов крови при внутрибрюшинном и внутрикостном способах введения.
Теоретическая и практическая значимость работы. Экспериментально показана перспективность применения пептида GHL в комбинации с пептидными препаратами даларгин и тимоген для стимуляции заживления кожных ран и репаративного остеогенеза.
Выяснено, что при травмах кожи и костей проявление репаративных эффектов пептида GHL и его комбинаций с тимогеном или даларгином зависит от способа введения. Выявлена более выраженная репаративная активность пептида GHL и его комбинаций с тимогеном или даларгином при внутрикожном или внутрикостном способах введения по сравнению с внутрибрюшинным введением.
Применение пептида GHL, тимогена и даларгина при травмах кожи и костей в парных сочетаниях сопровождается усилением репаративного эффекта с максимальной выраженностью в комбинации GHL+даларгин.
Разработаны способы стимуляции репаративного остеогенеза (патент № 2429002) и заживления кожных ран (патент № 2452508).
Выявленные особенности действия регуляторных пептидов могут быть учтены при экспериментальном или клиническом применении их аналогов.
Внедрены и апробированы результаты работы:
результаты работы используются в практической деятельности Курской биофабрики - фирмы «Биок» (акт внедрения № 3 от 24.01.13 г.), а также в лекционных курсах и на практических занятиях кафедр фармакологии (акт внедрения № 23 от 09.09.13), биологической химии (акт внедрения № 25 от 09.09.13.), травматологии, ортопедии и ВПХ (акт внедрения № 24 от 09.09.13) Курского государственного медицинского университета, кафедры адаптивной физкультуры и медико-биологических наук Курского филиала Российского государственного социального университета (РГСУ) (акт внедрения № 4 от 20.02.13 г.).
Методология и методы исследования. Методологической составляющей диссертационного исследования стали труды отечественных и зарубежных ученых (Смахтина М.Ю., 2004; Курцева А.А., 2009; Pickart L., 2012).
В диссертационной работе использованы биохимические, иммунологические, гистологические, рентгенологические методы исследования, а также основные правила работы с экспериментальными животными при доклинических исследованиях фармакологических препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту:
Регуляторные пептиды глицил-гистидил-лизин (GHL), тимоген и да-
ларгин в эквимолярных дозах сопоставимо стимулируют заживление кожных
ран при внутрибрюшинном введении, проявляют антиоксидантную активность,
а тимоген и даларгин повышают активность нейтрофилов крови.
В условиях кожных ран пептиды GHL, тимоген и даларгин в парных
сочетаниях обладают синергичным репаративным, антиоксидантным, а также
и иммуностимулирующим действием в отношении функции нейтрофилов
крови.
Пептиды GHL, тимоген и даларгин стимулируют репаративный остео-
генез, а в парных сочетаниях обладают синергичным репаративным, антиокси-
дантным, а также и иммуностимулирующим действием в отношении функции
нейтрофилов крови.
Пептид GHL и его комбинации с тимогеном или даларгином более
эффективны в отношении репаративной регенерации кожи и костей при мест
ном, чем при внутрибрюшинном способе введения.
Степень достоверности и апробация результатов. Научные положения и выводы диссертационного исследования основаны на анализе экспериментального материала, полученного при проведении опытов с использованием современных иммунологических, биохимических, гистологических методов. Статистическая обработка осуществлялась с применением комплекса учетно-оценочных и аналитических показателей, адекватных математических методов и ЭВМ, что определяет высокую достоверность результатов.
Основные положения диссертации представлены на международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2007» (Москва, 2007); 2-м международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения» (2007); II Международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2007); 71-й итоговой научно-практической конференции с международным участием, посвященной 130-летию со дня рождения профессора Войно-Ясенецкого и 65-летию КрасГМА (Красноярск, 2007); международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2008); международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2010, 2013); всероссийской научной конференции «Молодежная наука и современность» (Курск, 2007, 2008, 2010-2012); на заседании Курско-Старооскольской региональной общественной организации «Общество травматологов-ортопедов» (2012); III международной конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2012); XX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2013); итоговой научной конференции сотрудников КГМУ, ЦентральноЧернозёмного научного центра РАМН и отделения РАЕН, посвященной 78-летию КГМУ (Курск, 2013); международной научно-практической конференции РГСУ (Курск, 2012, 2014); межкафедральной научно-практической конференции кафедр травматологии, ортопедии и ВПХ, фармакологии, патологической физиологии и биологической химии Курского государственного медицинского университета (2013).
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности 14.03.06 «Поиск новых биологически активных фармакологических веществ среди природных и впервые синтезированных соединений, продуктов биотехнологии, генной инженерии и других современных технологий на экспериментальных моделях патологических состояний».
Связь задач исследования с проблемным планом медицинских наук.
Диссертация выполнена в соответствии с планом научных исследований ГБОУ ВПО КГМУ Росздрава, тематикой проблемной комиссии «Фармакология, клиническая фармакология» (номер государственной регистрации 01201055012).
Личный вклад автора. Автором составлены план и дизайн исследования, проведен анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации, лично проводилось моделирование травматического повреждения кожных покровов и бедренных костей лабораторных животных, забор крови, анализировались лабораторные показатели процессов перекисного окисления липидов, функции нейтрофилов крови, репаративные процессы поврежденных тканей. Диссертантом самостоятельно выполнялись анализ и обобщение результатов, составление таблиц и графиков, написание диссертации, сопоставление с литературными данными. Доля автора в совместных публикациях составила 80-90%.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 работ в центральной и местной печати, в том числе 4 в рекомендуемых ВАК изданиях. Получено 2 патента на изобретение. В работах содержится полный объем информации, касающейся темы диссертации.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 таблицами и 36 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений, библиографического указателя, включающего 157 отечественных и 166 иностранных источников.
Влияние регуляторного пептида глицил-гистидил-лизина на функ-ции организма
В настоящее время учеными выделена определенная группа пептидов, способная оказывать влияние на процессы физиологической и репаративной регенерации тканей [200,219,225,235]. Такие пептиды, способные регулировать клеточную активность, называются матричными. Одним из представителей этой группы пептидов является глицил-гистидил-лизин, имеющий формулу NH2-Gly-L-His-L-Lys-COOH (GHL). Он является активатором образования и восстановления нормального состава экстрацеллюлярного матрикса [297,302,316].
Первоначально GHL был обнаружен в плазме крови, трипептид увеличивал выживание нормальных клеток печени in vitro, вследствие чего был назван фактором роста клеток печени [227,231,272,273,274]. В ходе многочисленных исследований было показано, что GHL является хемотаксическим агентом для моноцитов/макрофагов и клеток костного мозга [158], активизирует регенерацию нервной ткани [273] и стимулирует ангиогенез in vivo [273]. Ряд исследователей указывает на физиологическую роль этого пептида, в частности, в отношении процессов ранозаживления [292].
Известно, что GHL вступает в соединения с ионами различных металлов, в частности, с катионом меди Cu (ІІ) [208], с ионами кобальта, железа, молибдена, марганца, никеля и цинка [158].
Выявлена антиинфекционная активность GHL, так как он предупреждает высвобождение железа, ионы которого способствует размножению патогенных микроорганизмов [187,200].
GHL может играть существенную роль в заживлении ран [162,203,291]. На модели кожных ран у крыс и в культуре кожных фибробластов крыс было исследовано стимулирующее влияние GHL на синтез гликозаминогликанов и малых протеогликанов [202,316]. Этот эффект дополнялся активацией синтеза коллагена I типа. Также GHL оказывал стимулирующее влияние на накопление хондроитин сульфата [194,251]. Показано, что комплекс GHL с коллагеном (PIC), применяемый местно в виде аппликаций у мышей с открытыми ранами кожи, стимулирует заживление ран при сахарном диабете [173,250], в условиях нарушенного кровообращения [180]. В условиях экспериментальной иммуносупрессии синтез коллагена у лабораторных животных составлял 23% от нормального, тогда как на фоне введения GHL он поднимался до 77% [204]. Также в коже мышей, обработанной PIC, повышался уровень глутатиона и аскорбиновой кислоты, что способствовало росту фибробластов [215]. При этом эффекты PIC оказались выше, чем при обработке ран одним коллагеном. Кроме того, известно, что GHL сам по себе усиливает синтез коллагена фибробластами и увеличивает количество фибробластов in vitro [292], активирует фибробласты и тучные клетки, благодаря чему ускоряет эпите-лизацию [178]. Glycyl-L-histidyl-L-lysine активирует аутокринную продукцию факторов роста фибробластами (оФРФ, ТФР-, сосудистого эндотелиального фактора роста), что также способствует ускорению процессов регенерации [180,197,302].
Трипептид GHL увеличивает экспрессию экстацеллюлярных матричных макромолекул на различных этапах заживления ран, повышает накопление межклеточного вещества соединительной ткани и, тем самым, ускоряет ее образование [228,302,316].
Установлено, что последовательность аминокислот глицин-гистидин-лизин присутствует в a2 - цепи коллагена I типа [292]. Ряд исследователей полагает, что GHL освобождается из коллагена, содержащим такую же аминокислотную последовательность, под влиянием протеаз [292].
Также экспериментально было доказано, что Glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu[II] активирует экспрессию проматричной металлопротеиназы-2 и матричной металлопротеиназы-2 на поздних стадиях ранозаживления (18-22 сутки), тогда как в контрольной группе крыс эти ферменты исчезают к этим срокам [302,303].
GHL также увеличивает количество остеобластов и стромальных клеток костного мозга в эксперименте, стимулирует пролиферацию хондроцитов [160,187].
В экспериментальных и клинических исследованиях доказано, что пептид стимулирует рост волос [272,300,308], уменьшает выпадение волос после химиотерапии [170].
Выявлены антиоксидантные эффекты фактора роста GHL [274,321]. Показано, что внутрибрюшинные инъекции трипептида GHL стимулируют митотиче-скую активность гепатоцитов [306]. Установлено, что эффекты глицил-гистидил-лизина, очевидно, связаны не только с пептидом, но и с действием составляющих его аминокислот [72,165,205,296]. Введение глицина приводило к повышению фагоцитарного индекса (ФИ), фагоцитарного числа (ФЧ) и функционального резерва нейтрофилов (ФРН) за счет усиления уровня индуцированной реакции теста восстановления нитросинего тетразолия. Введение лизина сопровождалось усилением поглотительной способности нейтрофилов, так как повышалось ФЧ. Вероятно, репаративные эффекты лизина усиливают и пролонгируют ранозаживляющую активность пептида глицил-гистидил-лизина [72].
Таким образом, большое количество исследований, посвященное изучению вопроса стимуляции репаративной регенерации различных тканей, указывает целесообразность продолжения исследований в данном направлении. По-прежнему остаются малоизученными вопросы сравнительного действия пептидных препаратов, не до конца выяснены их эффективные дозы и комбинации при различных способах введения.
Известно, что воздействие травмирующего агента на живой организм сопровождается развитием стресса. При возникновении первичной стресс-реакции организма первоначально происходит активация нервной системы. При стрессе многие физиологические системы приходят в полнофункциональное состояние, и, как следствие, резистентность организма увеличивается. Исследования показали, что развитие стресса всего зависит от гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы [32]. Травматическое повреждение сопровождают процессы, регулируемые иммунной и эндокринной системами, а также органами кроветворения [54].
Патогенетические составляющие иммунных нарушений претерпевают значительные изменения в ходе последовательной смены этапов после травмы: шокового, раннего постшокового, позднего постшокового и периода реабилитации [105].
Анализ изменений иммунной системы при механической политравме свидетельствует о формировании множественных изменений со стороны системы иммунитета и неспецифической защиты [124]. При повреждениях тканей выявлено достоверное угнетение функциональной активности фагоцитов [195], определявшееся по тесту восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). В тоже время известно, что в патогенезе гнойно-септических осложнений при травме ведущее место занимает супрессия фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоци-тов [133].Наибольшая супрессия НСТ-теста отмечена на 3-и -10-е сутки после травмы.
Экспериментальные модели и способы оценки репаративной регенера-ции кожи и костей
Эксперименты проводились под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг массы тела животного) [93].
Раневой процесс моделировали по методике Хотинян В.Ф. [3]. При этом полнослойные раны стандартного размера (около 1 см2) наносились на холке сра 38 зу после моделирования раневого процесса, а также через пять и десять дней раны фотографировали цифровой фотокамерой Canon Powershot A410 с применением миллиметровой сетки с последующим измерением начальной (1-е сутки), промежуточной (через 5 суток) и конечной (через 10 суток) площадей ран. Вычисление площадей ран производилось с помощью программы Image Tool. На основании полученных данных вычислялся коэффициент относительного ранозаживления ран (КОР) по формуле: Y= So-St/So, где Y – коэффициент относительного заживления, So – начальная площадь раны, St – конечная площадь раны [3]. При вычислении первого коэффициента регенерации (КОР1) за So была взята площадь ран на первые сутки, а за St – через пять суток. При вычислении второго коэффициента регенерации (КОР2) за So была взята площадь ран через пять суток, а за St – через десять суток. При вычислении третьего коэффициента регенерации (КОР3) за So была взята площадь ран на первые сутки, а за St – через десять суток. Также проводились гистологические исследования раневых срезов, моделированных под хлоралгидратным наркозом.
Моделировался закрытый перелом правой задней конечности (производилась закрытая остеоклазия бедренной кости в средней трети зажимом Кохера) с последующей интрамедуллярной фиксацией её спицей [136]. Процесс консолидации переломов оценивали рентгенологически на аппарате Арман-1 8Л3 (Россия) и гистологически.
После выведения животных из эксперимента для дальнейшего гистологического исследования иссекали кожные раны с окружающими здоровыми тканями и фрагменты бедренной кости (участок перелома и окружающих мышц). Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. После стандартных процедур обезвоживания и заливки в парафин на санном микротоне изготавливали срезы толщиной 7-10 мкм. Срезы окрашивали гематокилин-эозином [123].
При исследования гистологических препаратов в световом микроскопе Leica CME подсчитывали процентное соотношение различных типов резидентных и нерезидентных клеток в воспалительном инфильтрате грануляционной ткани и костной мозоли. Идентификация типов клеток осуществлялась по кариоло-гическим признакам.
Примечание: гистологические исследования кожи проводились на базе МБУЗ «Патоло-гоанатомическое бюро» с последующей консультативной помощью зав. кафедрой гистологии, эмбриологии и цитологии д.м.н., профессора А.В. Иванова, а гистологические исследования костных мозолей проводились на кафедре патологической анатомии КГМУ при непосредственном участии зав. кафедрой к.м.н., доцента В.Т. Дудки, за что мы выражаем им огромную признательность.
Фагоцитарную активность нейтрофилов крови исследовали после их инкубации с латексом [82] Для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов использовали фагоцитарный индекс (ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ). ФИ (процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе) и ФЧ (среднее количество поглощенных частиц латекса на один фагоцит) определяли в мазках, окрашенных по Романовскому [82]. В каждом мазке просчитывали 100 нейтрофилов.
Активность кислородзависимых механизмов защиты в фагоцитах оценивали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) на аппарате Multiscan MC 400 (Labsystems, Финляндия) [48]. Параллельно со спонтанным (НСТ-сп.), ставили стимулированный (НСТ-инд.), при этом в качестве стимулятора использовали зимозан. Об уровне функционального резерва нейтрофилов судили по коэффициенту КАо(оз/с) [48].
Интенсивность перекисного окисления липидов определяли по уровню малонового диальдегида (МДА) с использованием набора реактивов для определе 40 ния ТБК-активных продуктов ("Агат", Россия) по общепринятому методу [254] с помощью спектрофотометра «DU-65» («Beckman», Великобритания). Состояние антиоксидантной защиты определяли по активности каталазы крови [83]. После определения типа распределения полученных цифровых данных, они обрабатывались с помощью встроенных алгоритмов пакета анализа приложения Excel 2003. Достоверность различий сравниваемых параметров между средними значениями контрольной группы и групп животных различных серий определяли по расхождению границ доверительных интервалов при значениях р 0,05 и с помощью критерия Манна-Уитни [45].
Влияние глицил-гистидил-лизина, тимогена, даларгина, а также их комбинаций на заживление кожных ран, функцию нейтрофилов и актив-ность свободно-радикальных реакций при внутрибрюшинном введении
Первым этапом исследований было выявление эффектов регуляторных пептидов GHL, даларгина и тимогена в отношении репаративной регенерации кожи. В ранее проведенных исследованиях на крысах было установлено, что пептид GHL проявляет наиболее выраженную ранозаживляющую активность в разовой дозе 0,5 мкг/кг массы при десятикратном внутрибрюшинном введении [72]. Поэтому для исследования была выбрана эта доза и кратность введения препарата.
Учитывая тот факт, что эффекты регуляторных пептидов зависят от количества молекул в среде [1,118,138], введение тимогена и даларгина осуществлялось в эквимолярных GHL дозах. Установлено, что введенные по отдельности трипеп-тид GHL, тимоген и даларгин достоверно сокращали площадь экспериментальной раны через 5 суток – в 1,3; 1,3 и 1,4, а через 10 суток в 1,6; 1,5 и 1,7 раза соответственно (таблица 2). При этом увеличение коэффициента относительного раноза-живления через 5 суток (КОР1) составило в группах: введения GHL – в 2,7 раза; введения тимогена – в 2 раза; введения даларгина – в 3,1 раза, а через 10 суток повышение КОР3 в 3-х группах были сопоставимы - в 1,5; 1,4 и 1,6 раз соответственно (рисунок 1). Парное введение пептидов сопровождалось усилением репа-ративного эффекта. На 5-е сутки комбинация пептидов GHL+тимоген уменьшала размер раны в 1,5 раза; GHL+даларгин – 1,6 раза; тимоген+даларгин – в 1,3 раза. На 10-е сутки площади раневых поверхностей были сокращены в 1,9; 2,3 и 1,5 раза соответственно. Вычисление показателя КОР1 через 5 суток после начала парного введения пептидов экспериментальным животным показало, что его значения по сравнению с контрольной группой увеличились в 4; 4 и 2.4 раза, а значения КОР3 возросли в 1,9; 2,4 и 1,8 раза соответственно (таблица 2; рисунки 2,3).
Полиморфноядерные лейкоциты и лимфоциты в составе инфильтрата. Признаки отечности грануляционной ткани. Увеличение х400. Окраска гематоксилин-эозином.
По сравнению с контрольной группой животных, у крыс, получавших пептид в дозе 0,5 мкг/кг, отмечается не только выраженное снижение плотности клеточного инфильтрата, но и иное соотношение относительного количества клеток в соединительной ткани за счет снижения представительства лимфоцитов и макрофагов, а также преобладание зрелых форм фибробластов над незрелыми. Определяется послойная ориентация грануляционной ткани, слой горизонтальных фиб 47 робластов (рисунок 5). При увеличении визуализируется фрагмент плотной волокнистой неоформленной соединительной ткани с очагами разрушения пучков коллагеновых волокон. Интенсивная инфильтрация ПЯЛ. Отмечаются отдельные скопления лимфоцитов, дифференцирующихся в макрофаги, скопление макрофагов.
Рисунок 5 – Срез экспериментальной раны с момента ее моделирования. Внутрибрюшинное введение пептида GHL в дозе 0,5 мкг/кг
Увеличение плотности клеточных элементов за счет увеличения количества фибробластов. Увеличение Х400. Окраска гематоксилин-эозином.
В группе животных, получавших даларгин или тимоген видимых морфологических различий с крысами, которым вводили пептид GHL , не было выявлено. Наблюдались репаративные изменения сопоставимые с теми, которые отмечались у животных, получавших пептид GHL.
При сочетанном применении пептидов наблюдалось усиление репаративной активности с максимальной выраженностью в группе крыс, получавших комби 48 нацию GHL + даларгин. Изменение соотношения клеток соединительной ткани в сторону увеличения количества терминально-дифференцированных и зрелых форм механоцитов по сравнению с рекрутируемыми в очаг воспаления фагоцитирующими клетками (нейтрофилы и моноциты), а также завершение процессов эпителизации раневого дефекта позволяет сделать заключение о завершенности репаративной регенерации (рисунок 6).
Срез экспериментальной раны через 10 суток с момента ее моделирования. Внутрибрюшинное введение комбинации пептидов GHL+даларгин
Плотная волокнистая неоформленная соединительная ткань, полностью заполняющая объем раневого дефекта. Преобладание фиброцитов и зрелых фиб-робластов над другими типами клеток – как резидентных, так и не резидентных. Увеличение х400. Окраска гематоксилин-эозином.
Установлено, что при экспериментальной травме кожи наблюдалось сниже 49 ние показателей ФИ (в 1,9 раза), ФЧ (в 1,9 раза) и ИАФ (в 3 раза), что свидетельствовало об ослаблении фагоцитарной активности нейтрофилов крови (таблица 3). В этих условиях GHL не влиял на изучаемые показатели, а даларгин и тимоген повышали уровень фагоцитарного индекса (ФИ) по сравнению с группой, получавшей инъекции физиологического раствора в 1,3 и 1,4 раза соответственно. Наибольшей стимулирующей активностью обладал тимоген, который, кроме того, достоверно повышал и уровень ФЧ в 1,4 раза, ИАФ в 1,7 раза по сравнению с контрольной группой, получавшей физиологический раствор.
Примечание: - достоверность отличий (р 0,05), цифры рядом со звездочкой показы вают по отношению к показателю, какой группы эти различия достоверны При использовании комбинаций пептидов наблюдалось усиление эффекта. При этом в группе животных, получавших комбинацию пептидов GHL+тимоген, наблюдалась коррекция уровня ФИ (увеличение показателя в 1,9 раза) и ИАФ (увеличение в 3 раза), а при использовании комбинации GHL+даларгин – коррекция уровня ФИ, ФЧ и ИАФ, что сопровождалось ростом индексов в 2; 2,1 и 3,4 раза соответственно (таблица 3, рисунок 7).
Комбинация тимоген+даларгин достоверно повышала показатели ФИ, ФЧ и ИАФ в 1,5; 1,7 и 2,5 раза соответственно.
Травматическое повреждение кожных покровов экспериментальных животных также сопровождалось снижением показателей кислородзависимой бактерицидной активности нейтрофилов (mOD нст – в 1,9 раза; mOD н/з - в 1,8 раза; mOD о/з – в 2 раза) и угнетением их функционального резерва (коэффициент кАо – в 1,5 раза) (таблица 4). Пептид GHL не оказывал существенного влияния на функцию нейтрофилов. Раздельное введение, даларгина и тимогена достоверно усиливало кислородзависимую активность нейтрофилов периферической крови в спонтанной (1,3 и 1,4 раза соответственно) и индуцированной зимозаном реакциях. При стимуляции неопсонизированным зимозаном происходило увеличение показателя mOD н/з, эффекты пептидов были равнозначны и поднимали показатель в 1,3 раза, в то время как mOD о/з увеличивался в 1,3 и 1,4 раза (таблица 4).
При комбинированном введении тимогена или даларгина с пептидом GHL, усиление эффекта наблюдалось в обеих группах животных, что сопровождалось коррекцией коэффициента КАо, отражающего функциональный резерв нейтро-филов (ФРН) (рисунок 8), а также показателя mOD в стимулированной опсонизи-рованным зимозаном реакции (таблица 4). Таким образом, уровень mOD о/з увеличивался в 1,7 раза в группе GHL+тимоген и в 1,7 раза в группе GHL+даларгин. Значения показателя mOD н/з увеличивались в 1,3; 1,5 и 1,25 раза соответственно. Комбинация тимоген+даларгин достоверно увеличивала, но не корригировала изучаемые показатели (mOD – в 1,4 раза; mOD н/з – в 1,6 раза; mOD о/з - в 1,7 раза).
Репаративные, иммунотропные и антиоксидантные эффекты глицил-гистидил-лизина, тимогена, даларгина и их парных сочетаний при внутри-костном введении в условиях экспериментального перелома
Десятикратные инъекции комбинаций GHL+даларгин и GHL+тимоген нормализовали изучаемые показатели так, что для сочетания GHL+даларгин уровни ФИ, ФЧ и ИАФ возросли в 2,1; 3 и 6,1 раза, а для сочетания GHL+тимоген в 2,2; 3,1 и 6,5 раза соответственно. Одновременное введение 2-х пептидов тимогена и даларгина увеличивало ФИ в 1,8 раза, ФЧ в 2.2 раза, ИАФ в 4,5 раза (таблица 13; рисунко 32).
Перелом бедренной кости у экспериментальных крыс сопровождался ослаблением бактерицидной функции нейтрофилов (таблица 14). Показатели mOD нст, mOD н/з, mOD о/з, КАо (оз/с) были снижены в 1,8; 2,6; 2,4 и 1,5 раза соответственно (таблица 14).
Также как и при внутрибрюшинном введении внутрикостные инъекции пептидов тимогена и даларгина стимулировали функцию нейтрофилов. В результате этого даларгин повысил изученные параметры в 1,5; 1,9; 1,6 и 1,3 раза соответственно. В тимоген в свою очередь изменил в положительную сторону уровни mOD нст, mOD н/з, mOD о/з, КАо (оз/с) в 1,4; 1,9; 1,6 и 1,3. Пептид GHL не влиял на кислородзависимый метаболизм нейтрофилов (таблица 14; рисунок 33, 34).
Одновременные внутрикостные инъекции GHL и даларгина нормализовали значения НСТ теста в спонтанной и индуцированной реакциях. mODнст увеличился в 1,9 раза, mOD н/з – в 3 раза, mOD о/з – в 2,3 раза, а уровень КАо, отражающего функциональный резерв нейтрофилов, в 1,6 раза (таблица 14; рисунок 33, 35). Эффекты совместного введения GHL+тимоген и тимоген+даларгин были сопоставимы. Было установлено повышение значений mOD нст, mOD н/з, mOD о/з, КАо (оз/с): GHL+тимоген – в 1,7; 2; 1,6 и 1,3 раза; тимоген+даларгин – 1,5; 1,9; 1,5 и 1,3 раза (таблица 14; рисунок 33, 35).
В дальнейшем нами была изучена система перекисного окисления липидов. Исследования показали, что при травматическом повреждении костной ткани наблюдается накопление продуктов ПОЛ (в частности, увеличение концентрации МДА в 2,6 раза), ослабление антиоксидантной системы (снижение активности ка-талазы в 2,2 раза) (таблица 15).
Раздельные десятикратные инъекции GHL и даларгина равнозначно снижали синтез МДА (в 1,5 раза) и стимулировали активность каталазы (в 1,3 раза) (таблица 15; рисунок 34). Эффект тимогена в отношении МДА был более выражен (снижение в 1,8 раза). Эффективность комбинации GHL+даларгин проявлялась в коррекции уровней МДА и каталазы. Сочетание тимоген+даларгин снижало уровень МДА в 1,4 раза и повышало активность каталазы в 1,8 раза. В тоже время сочетание GHL+тимоген не влияло на уровень МДА, но при этом значи 99 тельно активизировало фермент каталазу (в 2,4 раза) (таблица 15; рисунок 35).
Обозначения: Радиус окружности обозначает уровень интактных животных. обозначает показатели животных при введении им комбинации тимо ген+даларгин (в % по отношению к контрольной группе). . введение комбинации GHL+тимоген введение комбинации GHL+даларгин - достоверность отличий (р 0,05) 101 Таким образом, при местном (внутрикостном) введении комбинации GHL+даларгин наблюдалась более выраженная активность репаративного остео-генеза по сравнению с внутрибрюшинным введением, что согласуется с данными литературы о непосредственном влиянии пептида GHL и опиоидных пептидов на клетки костей [79,241]. Кроме того, комбинация GHL+даларгин корригирует как поглотительную стадию фагоцитоза нейтрофилов, так и их кислородзависимую активность, изучаемые показатели перекисного оксиления липидов, что сопровождается выраженной активацией восстановительных процессов.
