Введение к работе
Актуальность проблемы. Молекулярно-клеточные механизмы защитных функций в настоящее время являются предметом изучения большинства экспериментальных работ, создающих основу для формирования общих представлений о типовых защитных и компенсаторно-приспособительных реакциях организма (Корнева Е.А. и соавт., 2000).
Особое внимание уделяется семейству эффекторных и сигнальных биологически активных веществ – антимикробным пептидам, обеспечивающим реализацию защитных и приспособительных реакций при инфицировании, стрессорном воздействии (Korneva E.A. et al., 1997; Aberg K.M. et al., 2007), паразитарной инвазии (McGwire B.S. et al., 2010), опухолевом росте (Jin G. et al., 2010). Антимикробные пептиды (АМП) - группа биологически активных веществ, преимущественно продуцируемых нейтрофильными гранулоцитами и макрофагами, а также эпителиальными клетками барьерных органов. Эффекты их действия на клетки и ткани разнообразны и зависят от концентрации пептидов. Наиболее изученной является их непосредственная антимикробная биологическая активность, отражающая наиболее значимую роль этих пептидов в защитных функциях организма (Korneva E.A., Kokryakov V.N., 2003).
Одним из основных направлений исследования антимикробных пептидов в последнее десятилетие стало изучение молекулярных и клеточных механизмов их биологической активности, обеспечивающих участие АМП в реализации защитных функций организма (Кокряков В. Н., 2006). Антимикробные пептиды обладают уникальными свойствами: они селективно действуют на бактерии, поскольку их катионные молекулы имеют высокое сродство к мембранам бактерий, обогащенным отрицательно заряженными компонентами – липополисахаридом и др. Выработка у бактерий резистентности к АМП затруднена в связи с особенностями механизма их бактерицидного действия – быстрого, в течение минут, повышения проницаемости мембран микроорганизмов, утратой их барьерной функции, приводящей к осмотическому разрушению клеток (Orlov D.S. et al., 2002). АМП не задерживаются и не накапливаются в организме, их связывают и инактивируют белки плазмы, разрушают протеазы. Антимикробные пептиды не угнетают функции иммунной системы, а обладают различными иммуномодулирующими эффектами, например, свойством стимулировать активность естественных киллерных (ЕК) клеток, что может быть полезным при создании лекарственных препаратов (Chernysh S. et al., 2012). Эти особенности выгодно отличают природные петидные соединения от классически применяемых антибиотиков (Gordon Y. J., Romanowski E. G., 2005).
Однако клиническое применение АМП ограничивается сходным диапазоном эффективных концентраций пептидов как антимикробных средств и концентраций, при которых проявляется их токсическое действие на клетки человека. Положительные примеры удачных попыток практического использования природных АМП в традиционных лекарственных формах имеются, но только в качестве препаратов местного действия, используемых в виде аэрозоля, мази или таблеток для рассасывания. In vivo АМП действуют в составе сложного ансамбля молекул, чаще в ограниченном объеме – фагосоме, слое слизи барьерных органов.
Применение АМП возможно после изменения биологических свойств природных пептидов, и способом такого изменения может быть их структурная модификация, создание синтетических соединений с новыми эффектами действия. Однако так как структура АМП обуславливает их биологическую активность, молекулярно-клеточные механизмы действия синтетических аналогов природных пептидов требуют специального изучения.
Настоящая работа посвящена изучению возможностей получения антибиотических веществ на основе природных антимикробных пептидов со свойствами, оптимальными для поддержания защитных функций, наиболее перспективных для получения препаратов нового поколения.
Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение антибиотической и иммуномодулирующей активности природных антимикробных пептидов и их синтетических структурных модификаций.
В задачи исследования входило:
-
Изучение антибиотической и гемолитической активности протегрина-1 и его синтетических аналогов с измененным, по сравнению с природной молекулой, расположением дисульфидных связей.
-
Исследование антимикробной, цитотоксической и гемолитической активности природного пептида индолицидина и его синтетических структурных аналогов.
-
Сравнительное изучение эффектов действия природного индолицидина и его синтетических структурных модификаций на цитотоксическую и пролиферативную активность спленоцитов крысы.
Научная новизна и практическая значимость работы. В результате проведенных экспериментов получены новые данные, характеризующие антибиотические свойства природных антимикробных пептидов в сравнении с их синтетическими аналогами с измененным расположением дисульфидных связей. Приоритетный характер носят результаты исследования антимикробной, цитотоксической и гемолитической активности природного пептида индолицидина и его синтетических структурных модификаций. Впервые изучены изменения пролиферативной и цитотоксической активности спленоцитов крысы под действием индолицидина в сравнении с эффектами действия его синтетических аналогов различной структуры. В работе впервые использованы хромогенные и флюоресцентные маркеры для оценки антимикробной активности и возможного механизма антибиотического действия пептидов.
Проведенное экспериментальное исследование способствует формированию новых представлений о молекулярно-клеточных механизмах реализации защитных функций с участием катионных пептидов, обладающих антибиотическими и иммуномодулирующими свойствами. Практическая значимость исследования определяется проблемами и вопросами, стоящими перед современной медициной. По данным ВОЗ рост резистентности микроорганизмов к существующим антибиотикам делает необходимым разработку противомикробных препаратов нового поколения в ближайшие годы. Выявление модификаций пептидов с оптимальными антимикробными и иммуномодулирующими свойствами, а также теоретическая разработка способов их получения, открывают возможность создания на их основе противомикробных, противовирусных, фунгицидных лекарственных препаратов (Чаттерджи П., Флек Ф., 2011). Полученные в работе данные также открывают перспективу для разработки путей коррекции нарушенных защитных функций с помощью антимикробных пептидов.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Синтетические структурные аналоги протегрина-1 с измененным расположением дисульфидных связей обладают сниженной антимикробной и гемолитической активностью по сравнению с активностью природного пептида.
-
Триптофан-богатые пептиды обладают высокой антимикробной активностью, которая усиливается при увеличении заряда молекулы. Пептиды 3В3, GSP-1, пуроиндилин А, Ind23, Ind34, Ind35, Ind36, Ind7, Ind8, Ind20, Ind21 и Ind22 проявляют низкую гемолитическую активность.
-
Пептиды – аналоги индолицидина – с низкой токсичностью в отношении клеток К562 проявляют иммуномодулирующую активность: изменяют цитотоксическую активность ЕК-клеток и пролиферативную активность спленоцитов крыс.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследования вошли в содержание курса лекций, читаемых на Кафедре патологии медицинского факультета и Кафедры биохимии биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета. Методические подходы, разработанные в ходе исследования, применяются при изучении биологической активности пептидов в Отделе общей патологии и патофизиологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН, Кафедры биохимии биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета, в Государственном НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на Конференции молодых ученых, посвященной 115-летию образования ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 2006), Научно-практической конференции с международным участием «Ученые будущего» (Одесса, 2006), Международных симпозиумах «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и при патологии» (Санкт-Петербург, 2007, 2009, 2011), Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008). По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, и 7 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 190 страницах и включает 39 рисунков, 11 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов работы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Библиографический указатель содержит 229 источников, в том числе 15 работ на русском и 214 – на иностранных языках.
