Содержание к диссертации
Введение
CLASS Глава 1. Литературный обзор 1 CLASS 5
1.1. Микробиоценоз и его значение для процессов жизнедеятельности у человека и животных 15
1.2. Связь микробиоценоза с состоянием регуляторных систем макроорганизма 27
1.3. Дисбактериозы и дисбиозы у человека 36
1.4. Механизмы действия пробиотиков на макроорганизм 52
1.5. Пробиотики и пребиотики в коррекции патологических состояний 58 CLASS
Глава 2. Материал и методы 72 CLASS
2.1. Экспериментальные животные 72
2.2. Обследуемый контингент 73
2.2.1. Формирование групп лиц разного возраста для определения частоты встречаемости и характеристики дисбактериоза 73
2.2.2. Формирование групп лиц разного возраста для оценки эффективности применения пробиотиков в схемах коррекции патологических состояний 74
2.2.2.1. Группа детей в возрасте до 1,5 лет 74
2.2.2.2. Группа детей в возрасте от 1,5 до 7 лет 75
2.2.2.3. Группа детей в возрасте от 7 до 17 лет 76
2.2.2.4. Группы лиц в возрасте старше 17 лет 77
2.3. Характеристика применяемых в оздоровительных
мероприятиях препарата Йодид-100 и пробиотиков -
биологически активных добавок «Биовестин» и «Биовестин-
лакто» 78
2.4. Микробиологические исследования 79
2.5. Клинико-инструментальное исследование состояния щитовидной железы 85
2.6. Психофизиологическое тестирование детей в возрасте от
7 до 17 лет 85
2.7. Определение йодурии 86
2.8. Определение гормонов в сыворотке крови 86
2.9. Исследование показателей иммунного статуса 87
2.9.1. Определение параметров клеточного иммунитета 87
2.9.2. Определение субпопуляций клеток методом проточной цитофлуориметрии 88
2.9.3. Определение концентрации секреторного иммуноглобулина класса А 90
2.10. Определение метаболитов в сыворотке крови и моче, активности ферментов в печени 90
2.11. Морфометрическое исследование слизистой оболочки тонкой и толстой кишки экспериментальных животных 91
2.12. Статистический анализ полученных результатов 91
Результаты исследования 93
ГЛАВА 3. Экспериментальное исследование влияния жидкого комплексного пробиотика на местные и системные реакции организма здоровых и больных животных 93
3.1. Влияние приема пробиотика на состояние микробиоценоза, морфометрические характеристики тонкой и толстой кишки, гормонально-метаболические показатели у здоровых животных 93
3.2. Влияние приема пробиотика на морфометрические характеристики тонкой и толстой кишки, гормонально- метаболические показатели у крыс с аллоксановым диабетом 104
РЕЗЮМЕ 113
ГЛАВА 4. Сравнительная оценка состояния микробиоценоза кишечника у лиц разных возрастных групп 117
4.1. Частота встречаемости дисбактериоза в группах условно здоровых лиц 118
4.2. Частота встречаемости дисбактериоза у лиц разного возраста из групп риска по развитию дисбиоза 120
Резюме 128
ГЛАВА 5. Системные эффекты действия пробиотиков у лиц разных возрастных групп 135
5.1. Показатели состояния кишечного микробиоценоза, эндокринной и иммунной систем в группе условно здоровых лиц в динамике приема пробиотика 135
5.2. Использование пробиотиков в коррекции состояния дисбактериоза у новорожденных детей в условиях стационара 149
5.3. Исследование утилизации йода в организме детей разного возраста на фоне приема пробиотиков 155
5.3.1. Изучение утилизации йода у детей в возрасте от 1,5 до
7 лет на фоне приема жидкого комплексного пробиотика 155
5.3.2. Изучение эффективности совместно приема препарата йода и комплексного пробиотика в коррекции функционального состояния щитовидной железы у детей в возрасте от 7 до 17 лет 157
5.4. Использование пробиотиков в схемах лечения воспалительных заболеваний органов малого таза 169
5.5. Иммунный статус у женщин с воспалительными заболеваниями органов малого таза в стадии клинической ремиссии в динамике приема пробиотиков 175
Резюме 181
Обсуждение результатов 188
Выводы 201
Список литературы 204
- Микробиоценоз и его значение для процессов жизнедеятельности у человека и животных
- Формирование групп лиц разного возраста для определения частоты встречаемости и характеристики дисбактериоза
- Влияние приема пробиотика на состояние микробиоценоза, морфометрические характеристики тонкой и толстой кишки, гормонально-метаболические показатели у здоровых животных
- Частота встречаемости дисбактериоза в группах условно здоровых лиц
Введение к работе
Актуальность проблемы. Микрофлора человека составляет основу его микроэкологии. Все поверхности организма человека, соприкасающиеся с внешней средой, населяют примерно 500 видов бактерий, не считая персистирующих вирусов, простейших, а также грибов (Воробьев А.А. и др,, 1997; 2004; Пименов Е.В. и др., 2003; Xu J., Gordon J.I., 2003). Бактериальные клетки составляют своеобразный "экстракорпоральный" орган, который имеет свои функции, критерии и показатели функционального состояния (Шендеров Б А, 1996; 1998; 2005; Воробьев АА. и др., 1997; 2004; Несвижский Ю.В., 2003; Жемчугов В.Е., 2004).
Нормальная микрофлора является обязательным и полноправным участником различных физиологических процессов, протекающих в органах и тканях хозяина: пищеварения, выделения, дыхания, дифференцировки клеток, регуляции газового состава полостей и жидкостей, водно-солевого обмена, метаболизма углеводов, белков, липидов, стероидов, желчных кислот, детоксикации экзогенных субстратов и метаболитов, продукции биологически активных соединений. Нарушения состава и функции нормальной микрофлоры человека могут приводить не только к дисбактериозам, но и к развитию многих инфекционных и соматических заболеваний (Пименов Е.В. и др., 2003; Ткаченко Е.И., 2004; Шендеров Б.А., 2005; Hopkins MJ., et al., 2000; Nocek J.E. et al., 2003; Pereira D.I.A. et al., 2003; Backhed F. et al., 2004). Представители индигенной микрофлоры играют важную роль в повышении иммунологической реактивности и общей
неспецифической резистентности организма человека и животных (Бондаренко В.М., 2003; Perdigon G. et al.,2001; Лахтин B.M. и др., 2006; Воропаева Е.А. и др., 2006; McCracken V., Lorenz R.G., 2001).
Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта выделяется из общей массы биотопов тела человека богатством своего компонентного состава и разнообразием выполняемых функций (Несвижский Ю.В., 2003; Corzo G.,
Gilliland S.E., 1999; Schneeman B.O., 2002). Формирование дисбактериоза кишечника и дисбиозов различной этиологии характеризуется снижением облигатной микрофлоры - бифидобактерий и лактобактерий, кишечной палочки и выраженным увеличением условно-патогенных микроорганизмов, оказывающих негативное влияние на многие процессы жизнедеятельности макроорганизма, причем не только в желудочно-кишечном тракте (Захаренко СМ., 2001; Созинов А.С. и др., 2002; Бондаренко В.М. и др., 2003; 2004; Циммерман Я.С., Циммерман И.Я., 2005; Mdlmann R. et.al., 1995; Berg R.D, 1996; HusebyeE.P, 2001).
Распространенность дисбиотических изменений среди лиц различных возрастных групп чрезвычайно высока. По некоторым данным, дисбактериоз той или иной степени определяется у 80-90% населения России (Воробьев А.А. и др., 1997; Глушанова Н.А. и др., 1999; Черешнев В.А. и др., 2000; 2001). При дисбиотических изменениях кишечника ухудшается клиническое течение основного заболевания, нарастает выраженность клинических симптомов, удлиняются сроки, утяжеляется общее состояние, ухудшаются показатели лечения и качество жизни пациентов (Гриневич В.Б. и др., 2003; Циммерман Я.С., Циммерман И.Я., 2005).
Причинами дисбактериоза могут быть как экзогенные, так и эндогенные факторы, которые достаточно разнообразны и характерны для определенных возрастных групп (Харченко Г.А., Колоколов В.А., 1999; Шахмарданов М.3.,1999; Григорьев П.Я. и др., 1999; Коршунов В.М. и др., 2000; Berg R.D., 1995). На первом месте среди них стоит антибактериальная терапия (Смирнов В.В., 1998; Лобзин Ю.В. и др., 2002; Кулаков В.И. и др., 2004; Кафарская Л.И. и др., 2006). Широкая практика использования антибиотиков привела к тому, что в последние десятилетия XX века произошла радикальная смена микроокружения в человеческом сообществе. Эволюционно созданный в процессе естественного отбора устойчивый бактериальный микробиоценоз исчез, нарушено эндоэкологическое равновесие, созданное в ходе эволюции в пользу вирусного и грибкового
микроокружения, на которое антибактериальные средства действия не оказывают (Черешнев В.А. и др., 2000; 2001).
Применение препаратов нормальной кишечной микрофлоры или пробиотиков является общепринятым и традиционным методом коррекции дисбиотических нарушений (Гребнев А.А., 1994; Григорьев П.Я., 1997; Щербаков П.Л. и др., 1998; Бондаренко В.М., Грачева Н.М., 2005; Апешкин В .А. и др., 2005). ГТробиотики - это препараты, содержащие живые микроорганизмы и вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения позитивные эффекты на физиологические, биохимические и иммунные реакции организма хозяина через стабилизацию и оптимизацию функций его нормальной микрофлоры (Сокрокулова И.Б. и др., 1997; Онищенко Г.Г. и др., 2002; Бондаренко В.М. и др., 2003). Многочисленные исследования показали высокую эффективность пробиотиков в гастроэнтерологии, дерматологии, акушерстве, гинекологии, стоматологии, при лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата, ревматизма, туберкулеза, сахарного диабета и другой патологии (Воробьев А.А. и др., 2004; Циммерман Я.С., Циммерман И.Я., 2005; Алешкин В.А. и др., 2005; Klaenhammer T.R., 2000; Hooton Т. М., 2001; Drisko J.A., 2003; Hamilton-Miller J. et al., 2003; Goodman S., 2004; Silva С et al., 2004).
Имеющиеся литературные данные указывают на высокую эффективность использования пробиотиков в схемах коррекции различных патологических состояний. Однако, выяснению механизмов действия пробиотиков на разных уровнях функционирования организма посвящено значительно меньше исследований. При этом, если вопросы изменения иммунной реактивности при приеме пробиотиков обсуждаются достаточно детально (Хромова С.С. и др., 2004; Воропаева Е.А. и др., 2006), то работы, посвященные изучению функционального состояния различных гормональных систем при приеме пробиотиков, практически отсутствуют. Достаточно мало внимания уделяется проведению экспериментальных исследований механизмов действия пробиотиков, хотя такой подход
позволяет детально изучать внутриклеточные, клеточные, тканевые и системные реакции, формирующиеся в организме под влиянием их приема. Цель исследования. Изучить местные и системные реакции организма человека и экспериментальных животных на прием жидкого комплексного пробиотика; определить эффективность его применения в коррекции патологических состояний. Задачи исследования.
Изучить состояние микробиоценоза и клеточного состава слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника у экспериментальных животных в динамике приема жидкого комплексного пробиотика.
Исследовать гормональные и биохимические параметры крови экспериментальных животных в динамике приема жидкого комплексного приобиотика.
Изучить влияние приема пробиотика на клеточный состав слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника, а также на состояние клеточных структур колоноцитов у крыс с аллоксановым диабетом; оценить тяжесть течения заболевания на фоне приема пробиотика.
Определить частоту встречаемости и характер нарушений микробиоценоза у лиц разных возрастных групп.
Исследовать состояние микробиоценоза кишечника, гормональные и иммунные показатели крови у взрослых лиц в динамике приема жидкого комплексного пробиотика.
Изучить влияние приема жидкого комплексного пробиотика на процессы утилизации йода в организме лиц разных возрастных групп.
Оценить эффективность использования жидкого комплексного пробиотика в коррекции антибиотикоассоциированного дисбактериоза у новорожденных детей.
Исследовать параметры клеточного иммунитета у женщин с хроническими воспалительными заболеваниями органов малого таза на фоне приема жидкого комплексного пробиотика.
Научная новизна. Впервые показано влияние приема жидкого комплексного пробиотика на клеточный состав слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника экспериментальных животных. В подвздошной кишке выявлено преходящее повышение количества бокаловидных клеток, что свидетельствует об увеличении барьерных свойств слизистой оболочки в начальные этапы приема пробиотика; увеличение количества межэпителиальных лимфоцитов в эпителиальной выстилке и плазматических клеток в собственной пластинке в динамике приема пробиотика указывают на стимуляцию местного иммунитета.
В слизистой оболочке толстой кишки крыс с аллоксановым диабетом впервые выявлены структурные изменения, указывающие на снижение барьерных свойств эпителия и развитие дистрофических изменений колоноцитов. Под влиянием приема пробиотика возрастает плотность межклеточных контактов в эпителиальной выстилке слизистой оболочки толстой кишки, восстанавливаются морфометрические показатели ультраструктурной организации колоноцитов и клеточный состав слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника, снижается тяжесть нарушений углеводного обмена.
Впервые выявлено влияние приема пробиотиков на гормональный статус здоровых женщин. Повышение содержания в крови гипофизарных гормонов - адренокортикотропного и пролактина, а также основного глюкокортикоидного гормона кортизола, указывает на увеличение адаптивных резервов организма. Повышение содержания в крови тиреотропного гормона и снижение - тироксина, свидетельствуют об усилении гормональной регуляции процессов обмена веществ.
Сравнительное изучение встречаемости дисбактериоза кишечника у лиц разных возрастных групп выявило его высокую частоту как у условно здоровых людей, так и у лиц с факторами риска развития дисбиоза. Применение жидкого комплексного пробиотика, охарактеризованного по его влиянию на состояние слизистой оболочки кишечника в эксперименте,
инициирует местные и системные реакции организма обследованных лиц: у детей первого года жизни способствует элиминации условно патогенной и восстановлению численности индигенной микрофлоры кишечника; у лиц разных возрастных групп повышает утилизацию йода в организме; у подростков вызывает снижение выраженности признаков субклинического гипотиреоза и улучшение структуры щитовидной железы; у женщин с хроническими воспалительными заболеваниями органов малого таза восстанавливает баланс клеточного звена иммунной системы. Научно-практическая значимость. Выявлены и охарактеризованы местные и системные эффекты приема per os жидкого комплексного пробиотика на организм человека и экспериментальных животных; показано его позитивное влияние на изменения микробиоценоза и клеточного состава слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника, активизацию местного иммунитета, улучшение утилизации микроэлементов (на примере йода), эндокринный статус. Полученные результаты послужили методологической основой для применения жидкого комплексного пробиотика в схемах коррекции патологических состояний у лиц разных возрастных групп, что отражено в трех актах внедрения в практику работы лечебных учреждений.
Разработана технология производства жидкого комплексного пробиотика «Биовестин-лакто»; получены патенты; № 2099956 «Способ получения бифидосодержащего продукта» / Е.Е. Горбунова, СВ. Хомичева, А.И. Калмыкова, 1997; № 2091036 «Способ получения мороженого» / А.И. Калмыкова, В.И. Байбаков, Г.Э. Солдатова, 1997.
Разработаны в комплексе с врачами-педиатрами, гастроэнтерологами и эндокринологами и утверждены на региональном уровне методические рекомендации:
Комплексное лечение и реабилитация детей с патологией толстой
кишки / Сост. Т.И. Рябиченко, М.Ю. Денисов, А.И. Пальцев, С.Н.
Кутина, Е.Р. Слободская, А.И. Калмыкова и др. - Новосибирск, 2003. -
28 с.
Использование пробиотиков в лечении H.pylori - инфицированных детей с хроническими гастритами и гастродуоденитами / Сост. Е.И. Прахин, О.В. Перьянова, А.И. Калмыкова и др. - Красноярск, 2004. -17 с.
Использование препарата «Йодид-100» и БАД «Биовестин-Лакто» для проведения оздоровительных мероприятий среди детей и подростков / Сост. В.Г. Селятицкая, А.И. Калмыкова, НА. Хоментовская, НА. и др. - Новосибирск, 2004. - 15 с. На основе выполненных разработок подготовлена научно-техническая
документация на продукты функционального питания, содержащие
пробиотики:
Бифидосметана. ТУ 9222-005-41378733-99 / Т.В. Михайлова, А.И.
Калмыкова, О.И. Кильмухаметова//Новосибирск, 1999;
Масло с бифидобактериями «Бифидомасло» ТУ 9221-008-41378733-99 /
Т.В. Михайлова, НА. Юрченко, А.И. Калмыкова, О.И.
Кильмухаметова // Новосибирск, 1999;
Бифидомороженое. ТУ 9228-006-41378733-99 / Т.В. Михайлова, А.И.
Калмыкова, О.И. Кильмухаметова//Новосибирск, 1999;
Биовестин (жидкий концентрат бифид о бактерий) ТУ 9222-071-00419
785-97 / В.Д. Харитонов, В.Ф. Семенихина, В.П. Ильин, А.И.
Калмыкова и др. // Москва, 1997.
Основные положения, выносимые на защиту. 1. Длительный прием жидкого комплексного пробиотика экспериментальными животными повышает численность индигенной микрофлоры временно в тонком и постоянно - в толстом кишечнике; инициирует фазные изменения клеточного состава слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника, свидетельствующие об усилении барьерных свойств слизистой оболочки подвздошной кишки и повышении местного иммунитета; вызывает изменения биохимических
показателей крови, указывающие на стимуляцию процессов обмена веществ,
Длительный прием пробиотика крысами с сахарным диабетом, вызванном введением аллоксана, нормализует морфометрические показатели ультраструктурной организации колоноцитов, восстанавливает клеточный состав слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника до показателей, характерных для здоровых животных, принимавших пробиотик, снижает тяжесть нарушений углеводного обмена.
Частота встречаемости дисбактериоза у условно здоровых и лиц с факторами риска развития дисбиоза одинаково высока; характерной особенностью дисбактериоза у условно здоровых лиц является снижение численности индигенной микрофлоры, а у лиц с факторами риска - дополнительное повышение численности условно патогенной микрофлоры.
Длительный прием жидкого комплексного пробиотика вызывает местные и системные реакции в организме лиц разного возраста: восстанавливает микробиоценоз кишечника, усиливает утилизацию йода в организме, нормализует в сочетании с приемом препарата йода структуру и функцию щитовидной железы, меняет гормональный статус и активность клеточного звена иммунной системы.
Диссертационное исследование выполнено в рамках основной темы НИР лаборатории эндокринологии ГУ НЦКЭМ СО РАМН: «Изучить экологически обусловленные закономерности формирования сочетанных с эндокринной патологией хронических заболеваний на этапах онтогенеза», № гос. регистрации 0120.0 402796.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на следующих научных собраниях: Научно-практическая конференция «Продукты питания, пищевые добавки, упаковка: экология производства и переработки отходов», Москва, 1998; Третья
международная конференция «Проблемы стабилизация развития сельского хозяйства Казахстана, Сибири и Монголии», Алматы, 2000; Одиннадцатая научно-практическая конференция «Актуальные вопросы современной медицины», Новосибирск, 2001; Пятый Международный симпозиум «Биологически активные добавки к пище и проблемы здоровья семьи», Красноярск, 2001; IX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2002; Вторая научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, 2002; Международный симпозиум «Федеральный и региональный аспекты государственной политики в области здорового питания», Кемерово, 2002; Шестой Международный симпозиум «Биологически активные добавки к пище и проблемы оптимизации питания», Сочи, 2002; Всероссийская конференция «Компенсаторно - приспособительные процессы: фундаментальные и клинические аспекты», Новосибирск, 2002; Международная научно -практическая конференция «Высокоэффективные биотехнологии нового поколения в производстве экологически безопасных продуктов питания и биопрепаратов для населения», Новосибирск, 2002; Шестой Российский" съезд врачей - инфекционистов, Санкт-Петербург, 2003; X Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2003; Пятый Балтийский научный форум "Санкт-Петербург - Гастро-2003"; Межрегиональная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы гинекологической эндокринологии, репродуктивной медицины и планирования семьи», Новосибирск, 2005; XII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2005; V Сибирский физиологический съезд, Томск, 2005.
Микробиоценоз и его значение для процессов жизнедеятельности у человека и животных
Мир населяет огромное число микробов (бактерии, вирусы, грибы, простейшие). Только бактерий насчитывается 100 000 разных видов, из них 3000 - патогенные. Организм человека населяют примерно 500 видов бактерий, не считая перси стирующих вирусов, простейших, а также грибов. Они населяют все поверхности организма, соприкасающиеся с внешней средой: кожу, верхние дыхательные пути, желудочно-кишечный тракт на всем протяжении, урогенитальный тракт. При этом видовой состав микрофлоры качественно и количественно формируется в зависимости от характера микроэкологии в биотопах, поскольку каждый вид микробов требует оптимальных для своей жизнедеятельности условий, обеспечивающих удовлетворение его биологических потребностей, а также адаптацию к тому микроокружению, которое складывается в местах его обитания. Характер микроокружения, т.е. микроэкология в биотопах, эволюционно сложился и приобрел устойчивость применительно к видовым особенностям микроорганизма, а также физиоло-го-анатомическим, биохимическим и иным особенностям данного макроорганизма и его вида (Воробьев А.А. и др., 1997а; XuJ., Gordon J.I.., 2003).
Показано, что организм взрослого человека состоит примерно из 10 клеток, в то же время в органах, тканях, а также в полостях человека обитает до 1014-1015, а при некоторых патологических состояниях - до 1017 особей микроорганизмов (Пименов Е.В. и др., 2003). Бактериальные клетки составляют своеобразный "экстракорпоральный" орган. Этот "орган", как и любой другой орган человека, имеет свои функции, критерии и показатели функционального состояния, свои показатели нормы функционирования и отклонений от нормы. На работу этого "органа" влияют различные экзогенные и эндогенные факторы климатогеографического, социального, экологического, профессионального, медицинского характера, т.е. этот "орган" также может болеть и иметь определенные симптомы заболевания (Шендеров Б.А., 1996; Воробьев АЛ. и др., 1997а).
Созданная в процессе эволюции на протяжении многих тысячелетий микробиота человека представляет собой симбиотическое сообщество, взаимодействующее с макроорганизмом на принципах комменсализма и мутуализма - высшей формы взаимовыгодных симбионтных отношений. Взаимно дополняя друг друга, человеческий организм и сопровождающие его бактерии образуют единую систему, надорганизм. При этом макроорганизм представляет собой не только среду обитания, находясь в состоянии динамического равновесия с собственной микрофлорой, он является частью этой системы (Несвижский Ю.В., 2003).
У популяции микроорганизмов в определенном ареале, которые объединены функционально в единый «многоклеточный организм», качественно иные по сравнению с отдельной бактериальной клеткой уровни взаимодействия с макроорганизмом (Жемчугов В.Е., 2004; Воробьев А.А. и др., 2004).
Резидентная микробиота формирует в организме человека филогенетически сложившиеся микробиоценозы, в первую очередь на слизистых желудочно-кишечного тракта, дыхательных и мочеполовых путей, на поверхности кожи. Нормальная микрофлора является обязательным и полноправным участником многих физиологических процессов, протекающих в органах и тканях хозяина: пищеварения, выделения, дыхания, дифференцировки клеток, регуляции газового состава полостей и жидкостей, водно-солевого обмена, физико-химического гомеостаза, метаболизма углеводов, белков, липидов, стероидов, желчных кислот, детоксикации экзо- и эндогенных субстратов и метаболитов, продукции биологически активных соединений (летучих жирных кислот, витаминов, гормонов, антибиотиков, токсинов). Нарушение состава и функции нормальной микрофлоры человека может приводить не только к дисбактериозам, но и к развитию многих инфекционных и соматических заболеваний (Пименов Е.В. и др., 2003).
Несмотря на то, что населяющая человека микрофлора чрезвычайно многообразна, каждому индивидууму в отдельности присущ свой собственный фенотип, проявляющийся различным качественным и количественным составом микробных компонентов. До конца механизмы формирования микробиоценоза не выяснены ни в отношении микроорганизмов, ни в отношении влияния самого макроорганизма. Известно, что присутствие индигенных родов микроорганизмов - Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus и Escherichia, имеет жесткое генетическое детерминирование, встречаемость родов Citrobacter и Clostridium обусловлена равнозначным влиянием гено - и паратипических составляющих, а наличие других транзиторных микроорганизмов зависит от средовой составляющей общей фенотипической дисперсии. При этом количественные характеристики наличия различных микроорганизмов и видовое содержание не имеют генотипической подверженности, обладают свободным варьированием и существуют в режиме саморегуляции (Несвижский Ю.В., 2003). Преобладание средовых влияний в процессе формирования микробиоценоза различных биотопов человека указывает на их выраженную подверженность влиянию различных факторов, как экзогенных, так и эндогенных. Внутриклеточные физико-химические процессы бактериальных клеток формируют электромагнитные колебания, которые также участвуют в межклеточных связях (Колпакова С.Д., Колпаков А.И., 1994).
Локальные и системные функции микробиоты следующие: 1) трофические и энергетические функции, тепловое обеспечение организма; 2) энергообеспечение эпителия; 3) регулирование перистальтики кишечника; 4) участие в регуляции дифференцировки и регенерации тканей, в первую очередь эпителиальных; 5) поддержание ионного гомеостаза организма; 6) детокси-кация и выведение эндо- и экзогенных ядовитых соединений, разрушение мутагенов, активация лекарственных соединений; 7) образование сигнальных молекул, в том числе нейротрансмиттреров; S) стимуляция иммунной системы; 9) стимуляция местного иммунитета; 10) обеспечение цитопротекции; 11) повышение резистентности эпителиальных клеток к мутагенам (канцеро генам); 12) ингибирование роста патогенов; 13) ингибирование адгезии патогенов к эпителию; 14) перехват и выведение вирусов; 15) поддержание физико-химических параметров гомеостаза приэпителиальной зоны; 16) поставка субстратов глюконеогенеза; 17) поставка субстратов липогенеза; 18) участие в метаболизме белков; 19) участие в регуляции обмена желчных кислот, стероидов и других макромолекул; 20) регуляция газового состава полостей; 21) синтез и поставка организму витаминов группы В, пантотеновой кислоты и др. (Ткаченко Е.И., 2004; Mengheri Е. et al., 1999; Hopkins M.J., et at., 2000; Pacha J., 2000; El-Nezami H. et al., 2002; Nocek J.E. et al., 2003; Pereira D.I.A. et al., 2003; Backhed F. et al., 2004).
Формирование групп лиц разного возраста для определения частоты встречаемости и характеристики дисбактериоза
В работе были использованы белые лабораторные половозрелые крысы-самцы Вистар, полученные из питомника НИИ цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск), Содержание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12,08.1977 г. №755).
Животных содержали в индивидуальных клетках на стандартном рационе вивария и при свободном доступе к воде. Половину рациона составлял специализированный корм для животных - комбикорм ПК-120-1, Вторую половину - перловая каша с добавлением растительного масла и сухого молока. Крысы получали корм в 14 - 16 часов ежедневно. Экспериментальных животных (п=69) делили на 4 труппы; 1 группа, шифр «К» - контрольные крысы, получавшие ежедневно в течение эксперимента per os по 0,5 мл молока (n — 12); 2 группа, шифр «БВ» - опытные крысы, получавшие по той же схеме по 0,5 мл жидкого комплексного пробиотика «Биовесгин-Лакто» (n = 15); 3 группа, шифр «Ал» - крысы с аллоксановым диабетом, получавшие ежедневно в течение эксперимента per os по 0,5 мл молока (и = 14); 4 группа, шифр «Ал+БВ» - крысы с аллоксановым диабетом, получавшие по той же схеме по 0,5 мл пробиотика (n = 28).
Экспериментальный сахарный диабет вызывали однократным внутрибрюшинным введением диабетогенной дозы аллоксаиа - 17 мг/100 г массы тела. Пробиотик начинали давать животным со следующего после введения аллоксаиа дня.
В диссертационном исследовании для решения поставленных задач всего было обследовано 3907 человек разного возраста, Исследования на испытуемых лицах выполнены с их: информированного согласия (для детей с информированного согласия их родителей, педагогов и лечащих врачей) и соответствуют этическим нормам Хельсинской декларации (2000 г.).
В осенний сезон года были обследованы условно здоровые лица -жители Новосибирска (п=126), которые в соответствии с особенностями питания были разделены на три возрастные группы: дети в возрасте от 1,5 до 7 лет (дошкольный возраст, п=26); школьники от 7 до 17 лет (п=70); взрослые лица, преподаватели школ и научные сотрудники (п=30); на момент обследования не предъявлявшие жалоб на состояние своего здоровья.
Из группы условно здоровых взрослых лиц 10 женщин были отобраны в группу волонтеров, у которых дополнительно проводили исследование гормонального и иммунного статусов, йодурии, ультразвуковой картины щитовидной железы до и в динамике приема жидкого комплексного пробиотика, оценивая при этом состояние микробиоценоза толстой кишки.
Для определения особенностей дисбиоза ЖКТ у жителей Новосибирска, который является крупным промышленным городом с высокой степенью загрязнения окружающей среды, был использован следующий методический подход. Анализировали частоту встречаемости дисбиоза в группах лиц разного возраста, проживающих Б Новосибирске и направленных для проверки микрофлоры кишечника в муниципальные бактериологические лаборатории врачами разных специальностей в течение 2001 - 2002 гг. Всего было внесено в базу данных 3408 анализов на состояние кишечного микробиоценоза. Анализ состояния микробиоты кишечника был проведен у пациентов, проживающих в разных районах города: Центральный, Ленинский и Новосибирск - сельский.
Также, как и в случае здоровых лиц, ориентируясь на определенный тип пищевых рационов, свойственный для разных возрастов и связанный с социальными условиями проживания, выделяли возрастные группы; 1 группа - до 1,5 лет (грудной и ранний до ясельного возраста, п=1765); 2 группа - от 1,5 до 7 лет (ранний и дошкольный возраста, п-579); 3 группа - от 7 до 17 лет (школьный возраст, п=262), 4 группа - старше 17 лет (взрослые лица, п=802),
В 1 и 2 группах детей причинами направления пациентов на исследование микробиоценоза являлись: аллергодерматозы, неустойчивый стул, боли в кишечнике и частые ОРВИ. В 3 и 4 группах преимущественно были представлены пациенты с различными заболеваниями, имеющими клинические проявления дисбактериоза: неустойчивый стул, метеоризм, боли по ходу кишечника. Все лица указанных возрастных групп были отнесены в группы риска по развитию дисбиоза ЖКТ.
Работу проводили на базе МДКБ №4 г, Новосибирска с целью коррекции антибиотикоассоциированного дисбактериоза. Методом случайной выборки были отобраны 56 новорожденных детей в возрасте от 0,5 до 6 месяцев, социальных сирот, с отягощенным акушерским анамнезом и сочетанной перинатальной патологией, получавших антибиотики широкого спектра действия по строгим показаниям в условии неонаталыюго стационара. Все дети находились на искусственном вскармливании и получали адаптированные молочные смеси по возрастным нормам с учётом тяжести состояния.
Дети были разделены на три группы наблюдения: группа (n=20) - дети, которым давали пробиотик «Биовестин-лакто» в дозе 1 мл 3 раза в день перед приемом пищи в течении 6-8 недель; 2 группа (п=21) - дети, которым давані пробиотик «Биовестин» в дозе 0,25 мл 3 раза в день перед приёмом пищи в течении 6-8 недель; 3 группа (п=15) - группа сравнения, детям из которой пробиотики не назначали.
Для анализа клинического течения заболевания, анамнеза и лечения новорожденных детей составляли карты клинико-бактериологического исследования, включавшие паспортные данные в объеме историй развития новорожденных и историй болезни, подробные акушерский, гинекологический и соматический анамнез матери, сведения о течении настоящей беременности, родов и послеродового периода, результаты клинического наблюдения, данные лабораторных и инструментальных методов исследование о проведенном лечении и клинических диагнозах.
Влияние приема пробиотика на состояние микробиоценоза, морфометрические характеристики тонкой и толстой кишки, гормонально-метаболические показатели у здоровых животных
Влияние приема пробиотика на состояние микробиоценоза, морфометрическис характеристики тонкой и толстой кишки, гормонально-метаболические показатели у здоровых животных
Видовой состав микрофлоры тонкого кишечника контрольных крыс был представлен: кишечной палочкой (10Мо6 КОЕ/г), бифидобактериями (106-107 КОЕ/г), лактобактериями (10 -10" КОЕ/г), энтерококками (104-105 КОЕ/г).
Видовой состав микрофлоры толстого кишечника контрольных крыс был представлен; кишечной палочкой (10-10 КОЕ/г), бифидобактериями (10 КОЕ/г), лактобактериями (10 -10 КОЕ/г), энтерококками (104 КОЕ/г),
В единичных случаях встречались лактозонегативная и гемолизированная кишечные палочки, клебсиелла и энтеробактер. Можно предположить, что практически полное отсутствие патогенной микрофлоры в биотопах тонкой и толстой кишки крыс явилось следствием стандартных условий содержания и использования специализированных сертифицированных кормов для животных.
В динамике приема пробиотика на 21, 35 и 56 дни эксперимента количество кишечной палочки у крыс в обеих отделах кишечника не претерпело изменений.
Содержание бифидо- и лактобактерий в тонком кишечнике животных, получавших пробиотик в течение 21 дня, увеличилось до 10 КОЕ/г, а через 35 - 56 дней эксперимента вернулось к исходному состоянию.
В толстом кишечнике опытных крыс через 21 день приема пробиотика количество бифидо- и лактобактерий также увеличилось до 107 КОЕ/г. Однако, в отличие от тонкой, в толстой кишке через 35-56 дней эксперимента содержание этих бактерий оставалось повышенным: бифидобактерий-до 106-107, лактобактерий -до 105- 107 КОЕ/г,
Содержание энтерококков в обоих обследованных отделах кишечника опытных крыс увеличилось через 21 день приема пробиотика до 10- 10 КОЕ/г, через 35 дней - до 105- 107 КОЕ/г, а через 56 дней вернулось к исходному уровню.
Повышение содержания энтерококков может быть связано с процессами изменения соотношения анаэробных и аэробных представителей микрофлоры в динамике приема пробиотика, а снижение содержания энтерококков к 56 дню - со снижением активности этих процессов.
Таким образом, наиболее существенное увеличение содержания бифидо-, лактобактерий и энтерококков в обоих отделах кишечника крыс было отмечено через 21 - 35 дней приема животными жидкого пробиотика. Снижение их количества до исходных уровней к концу эксперимента, несмотря на продолжающийся прием пробиотика, свидетельствует о стабилизации состояния биотопов как тонкой, так и толстой кишки.
Результаты морфометрическото исследования слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника крыс в динамике приема жидкого комплексного пробиотика представлены в таблицах 3.1, и 3.2.
Морфологическое исследование тонкого и толстого кишечника крыс показало, что наиболее значимые эффекты приема пробиотика проявляются изменением соотношения клеток в эпителиальной выстилке слизистой оболочки и в диффузной лимфоидной ткани собственной пластинки, а также эозинофилией последней. Содержание макрофагов, тучных клеток и фибробластов в собственной пластинке слизистой оболочки как подвздошной, так и толстой кишки, в исследованные сроки эксперимента не менялось.
Направленность, синхронность и амплитуда изменений в структурной организации компонентов тканевых микрорайонов тонкого и толстого кишечника крыс, получавших пробиотак, имели свою специфику. На рисунках 3.1. и 3.2. показаны изменения (в % от контроля) показателей состояния слизистой кишечника крыс, получавших жидкий комплексный пробиотик.
Видно, что у животных, получавших пробиотик, возрастало количество бокаловидных клеток и межэпителиальных лимфоцитов (МЭЛ) в эпителиальной выстилке подвздошной кишки (см. рис, З.1.). В собственной пластинке слизистой оболочки тонкой кишки опытных животных на 21 день эксперимента достоверно увеличивалось количество эозинофилов, а на 35 день - плазматических клеток. Через 56 дней приема пробиотика число тех и других клеток оставалось выше контрольного уровня.
Частота встречаемости дисбактериоза в группах условно здоровых лиц
В главе 3 приведены результаты экспериментальных исследований, которые свидетельствуют о выраженных позитивных эффектах приема про биотика на состояние слизистой кишечника формирующихся вне зависимости от состояния организма животных; показана стимуляция местного иммунитета и фазная динамика биохимических показателей крови. Менее выраженное влияние приема пробиотиков было продемонстрировано у экспериментальных животных по изменению микрофлоры кишечника. Это может быть связано с тем, что работу проводили с использованием лабораторных животных, которых содерж&іи в стандартных условиях вивария с кормлением сертифицированными кормами, уборкой помещений с использованием дезинфицирующих средств и обработкой ультрафиолетовым излучением. В таких условиях появление Б микробиоценозе кишечника крыс УПМ маловероятно, что и подтверждалось в ходе эксперимента. В то же время вопрос, как меняется состояние микро биоценоза кишечника под влиянием приема пробиотика, имеет принципиальное значение, поскольку от состояния численности видов индигенногй микрофлоры и УПМ зависит вероятность формирования дисбактсриоза и дисбиоза ЖКТ.
Из литературных источников известно, что распространенность дисбактериозов среди населения разных возрастных групп в РФ составляет более 80% (Воробьев АА и др., 2004 а). Однако, каковы характерные особенности дисбактериозов у здоровых лиц и лиц с факторами риска по развитию дисбактериозов ЖКТ остается изученным достаточно мало, А это необходимо знать, чтобы отследить эффекты приема пробиотиков на состояние микро биоценоза кишечника, как первого звена в формировании местных и системных реакций организма.
В связи со сказанным, в 4 главе диссертационной работы изложены результаты сравнительного исследования состояния микробиоценоза кишечника у лиц разных возрастных групп - здоровых и с факторами риска по развитию дисбиозов.
В осенний сезон года обследованы условно здоровые лица - жители Новосибирска, которые были разделены в соответствии с особенностями питания, от которых зависит состояние микробиоценоза кишечника (Воробьев А.А. и др.., 2004 в), на три возрастные группы; дети от 1?5 до 7 лет (дошкольный возраст), школьники от 7 до 17 лет и взрослые лица, преподаватели школ и научные сотрудники, на момент обследования не предъявлявшие жалоб на состояние своего здоровья.
Показано, что отклонения в микрофлоре толстой кишки выявляются у 87,7% обследованных условно здоровых лиц, при этом преобладает дисбактериоз 1 степени, характеризующийся снижением численности индигенной микрофлоры, Дисбактериоз 2 степени (с наличием УПМ) диагностировали в среднем у 30%, а более выраженные изменения микробиоты, которые характеризуются наличием условно - патогенной микрофлоры в ассоциациях и часто сопровождаются клиническими проявлениями (3 степень дисбактериоза), встречались чаще в группе детей от 1,5 до 7 лет, чем в более старших возрастных группах (см, табл.4 Л.).
В таблице 4.2. представлены данные, характеризующие особенности микробиоценоза у условно здоровых лиц разных возрастных групп. Обращает на себя внимание тот факт, что снижение индигенной микрофлоры в большей степени выражено в группе детей от 1,5 до 7 лет, затем идет группа взрослых лиц и в наименьшей степени этот показатель снижен в группе школьников. Аналогичная картина проявляется и по частоте встречаемости УПМ: этот показатель наиболее высокий с преобладанием представителей семейства кишечных: Enterobacier aerogems, Proteus sp, Klebsiella sp также в группе детей в возрасте от 1,5 до 7 лет.
При анализе результатов обследования условно здоровых жителей Новосибирска обращает на себя внимание тот факт, что, как у детей, так и у взрослых, преобладают изменения в аэробной части нормофлоры. При этом более чем у 20% наблюдается снижение уровня типичной кишечной палочки (рис.4.1.). Встречаемость избыточного роста E.coli во всех группах низкая и составляет от 2 до 8 %.
С целью изучения шггогы жлретаёмости, а іакже шираитиых п сезонных особенностей днфжщтігт кишечника у лиц. проживающие в промышленном городе, был проведем анализ данных, нолучшных из муниципальных бактериологических лабораторий. Учитывал, что жжшш были сделана дя# людей, либо шшшдех заболевания, либо у них проявлялись каше-то нарушения чдоровщ требующие определения наличия диепшжриозл, ж отпоешіи К группам риска по дисбиозу. По результатам анализа всех датшш (п 3408} было шявлена, что толшо у 4,8% лиц имелся нормобиоя, у 19,2% - яисбактериоз І степени, характеризующийся снижением ижцттртшъ индигашой микрофлоры, а у 76,0% - в равной етепеш тсЬшщиоч 2 и 3 степеш.
На ртут 4.2. представлены речулишы кишстсрнога анштаза данных количественного состава микрофлоры толстого кишечника лиц 4-х возрастных групп. В анализируемом массиве данных выделяли дшголвдтсльна по сравнению с групнаш условно здоровых лип младшую возрастную группу - дети в возрасте до 1,3 лет, что регламентировало ОСТом У1500Л UHI04-20003 МЗ РФ. Видно что иов«м возрастным группам среди кишечной микробиоты выделяются два основных кластера, один из которых объединяет представителей индигенной микрофлоры; E.coli типичная, Bifidobaierium sp., Lactobacillus sp., Enterococcus sp.7 а второй -УТІМ.
Наиболее тесные связи как среди представителей индигенной микрофлоры, так и УПМ, а также суммарно между двумя выделяемыми кластерами, определены в возрастной группе от 7 до 17 лет. Наименее тесные связи между представителями микрофлоры кишечника, особенно такими как Е. coli типичная, лакгозонегативная и гемолизирующая, а также Klebsiella sp., отмечены в возрастной группе до 1,5 лет, что указывает на замедление процессов формирования сим биотических отношений в микробиоценозе кишечника у детей грудного и раннего возрастов из группы риска.
В таблице 4.3. представлены данные о частоте встречаемости дисбактериоза разной степени среди лиц групп риска в общем и в зависимости от сезона года. Сезон года был рассмотрен нами как фактор, изменяющий, с одной стороны, рацион питания, а с другой стороны -состояние напряжения регуляторных и гомеостатических систем организма человека, особенно среди населения сибирских регионов.
Видно, что в младшей возрастной группе (1 группа) практические отсутствует нормобиоз; 1 степень дисбактериоза встречается в 2 - 3 раза реже, чем в других возрастных группах, 2 степень дисбактериоза встречается с одинаковой частотой, а 3 степень определяется в 2 - 2,5 раза чаще, чем в остальных группах,
