Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Фармакология антигипоксантов и вибропротекторов 18
Глава 2. Материалы и методы исследования 64
Глава 3. Динамика показателей функциональной активности митохондрий тканей экспериментальных животных (кролики, крысы) при воздействии общей и локальной вибрации 88
Заключение . 201
Выводы . 212
Научно-практические рекомендации 215
Литература . 216
- Фармакология антигипоксантов и вибропротекторов
- Материалы и методы исследования
- Динамика показателей функциональной активности митохондрий тканей экспериментальных животных (кролики, крысы) при воздействии общей и локальной вибрации
Введение к работе
Актуальность проблемы
Сохранение здоровья и работоспособности людей в условиях воздействия экстремальных факторов является одним из актуальных направлений авиационной, космической и морской медицины, а также медицины труда и катастроф (Измеров Н.Ф., 2008; Боченков А.А., Загородников Г.Г., 2010; Ко-невских Л.А. и др., 2013).
Комплекс экстремальных воздействий включает широкий спектр антропогенных влияний (общая и локальная вибрация, шумовое и электромагнитное воздействие, статическое напряжение), предъявляющих высокие требования к организму людей ряда профессиональных групп. В частности, у лиц, длительно работающих в виброопасных условиях, частота сердечно-сосудистой патологии в 1,5–2 раза выше, чем в среднем по популяции (Войтович Т.В., 2004; Афанасьева О.Е. и др., 2010). Производственными исследованиями подтверждено, что повреждающее влияние вибрации на организм усугубляет охлаждение, чрезмерная физическая активность, что быстрее ведет к срыву адаптации, ускоряет развитие вибрационной болезни, при этом увеличиваются показатели общей смертности, в том числе лиц трудоспособного возраста (Измеров Н.Ф., 1999, 2008).
Активное развитие и внедрение химических технологий в производство, оборонную промышленность, быт поставило проблему разработки лечебно-профилактических мер по охране здоровья людей при возможном контакте с вредными и опасными токсикантами. В структуре общей смертности в Российской Федерации увеличилась смертность от несчастных случаев вследствие отравлений. Ее влияние на ожидаемую продолжительность жизни становится настолько значимым, что данный показатель почти сравнялся с показателем смертности от заболеваний сердечно-сосудистой системы (Мамедов М.Н., Деев А.Д., 2008; Хальфин Р.А., 2008).
Установлено, что среди ведущих этиологических факторов смертельных острых отравлений в бытовых условиях от 3 до 5% составляют суррогаты алкоголя (технические спирты, органические растворители и другие непищевые спиртосодержащие жидкости). В состав этих жидкостей входят этиленгликоль и дихлорэтан, обладающие не только нейротоксичностью, но повреждающие паренхиматозные органы (Куценко С.А., 2004).
Средний возраст отравившихся колеблется от 29 до 40 лет, что приводит к социально-экономическому ущербу и ухудшает демографическую ситуацию (Власов В.Н., 2009; Остапенко Ю.Н. и др., 2010). Кроме этого, важную составляющую бытовых и промышленных (в ходе уничтожения запасов химического оружия) отравлений представляют отравления фосфороргани-ческими соединениями (ФОС). В отличие от дихлорэтана и этиленгликоля, ФОС имеют антидоты, применение которых эффективно лишь на ранних этапах отравления, но не снимает необходимости ликвидации так называе-
мых отдаленных последствий интоксикации (Прозоровский В.Б., 2007; Чепур С.В., 2010). Отдаленные (отставленные последствия) острых интоксикаций ФОС разнообразны и формируют неблагоприятный фон для возникновения и прогрессирования различных хронических заболеваний.
Степень разработанности темы исследования
Состояние вибрации приводит к дисфункции многих органов и систем, в основе которой лежат, прежде всего, нарушения в энергетическом обмене (Воробьева В.В., Шабанов П.Д., 2008, 2013). Следует констатировать, что целостное представление о механизмах перестройки энергетического обмена различных органов под действием общей и локальной вибрации до сих пор отсутствует, не определены также роль и закономерности развития дисфункций митохондрий тканей, вовлеченных в патогенез вибрационной болезни. Применение общепринятых для лечения вибрационной болезни лекарственных средств не дает значимого клинического эффекта, вероятно, в силу ограниченности точек приложения или неправильного их понимания. Возможно, это связано и с тем, что их действие не может полностью реализоваться на уровне систем энергообеспечения гомеостатических функций, наиболее уязвимого звена при вибрационном воздействии (Потеряева Е.Л. и др., 2004; Артамонова В.Г., 2010; Кирьяков В.А. и др., 2013). Это же и объясняет резистентность данной патологии к медикаментозной терапии, особенно когда к повреждающему действию вибрации присоединяется холодовое воздействие, повышенные физические нагрузки и действие токсикантов (Измеров Н.Ф., 2008). Как показано в последние годы (Зарубина И.В., 2011), отдаленные последствия в действии токсикантов также связаны с дисфункцией систем энергопродукции и энергопотребления. Поэтому поиск средств восстановительно-реабилитационной направленности, обладающих защитными энерго-протективными эффектами, как в токсикогенной фазе острого отравления, так и в отдаленные сроки после отравлений, представляется весьма актуальным.
Цель и задачи исследования Цель исследования: разработка методов фармакологической коррекции последствий воздействия факторов физической и химической природы, а также факторов их осложняющих (чрезмерные физические нагрузки, переохлаждение, иммобилизация).
Задачи исследования:
-
Разработка модели гипоксического состояния клеточного метаболизма вследствие воздействия общей вибрации для оценки энергопротектив-ного действия фармакологических средств защиты от вибрации (вибропротекторов).
-
Изучить особенности энергетического обмена в печени и почке экспериментальных животных (кролики, крысы) при действии локальной и общей вибрации по показателям функциональной активности митохондрий, активности ферментов крови (сукцинатдегидрогеназа, каталаза) и морфологической картине органов (кролики).
-
Провести сравнительный фармакологический анализ энергопротек-тивного действия субстратных антигипоксантов (янтарная и глутаминовая кислоты), блокаторов кальциевых каналов (фенигидин), пиридин-3-карбоновой кислоты и их комбинаций при действии общей вибрации у кроликов.
-
Провести сравнительный фармакологический анализ энергопротек-тивного действия субстратных антигипоксантов (янтарная и глутаминовая кислоты) при сочетанном действии вибрации с предельной физической нагрузкой, переохлаждением и иммобилизацией у крыс.
-
Изучить антигипоксантные, актопротекторные и органопротектив-ные эффекты антигипоксантов 2-этилтиобензимидазола гидробромида и 5-этокси-2-этилтиобензимидазола в моделях интоксикации карбофосом, эти-ленгликолем, дихлорэтаном у крыс, уточнить их молекулярные механизмы действия.
Научная новизна
Разработана оригинальная модель гипоксического состояния клеточно
го метаболизма вследствие воздействия общей вибрации для оценки энерго-
протективного действия фармакологических средств защиты от вибрации
(вибропротекторов). В основе данной модели лежат два характерологических
критерия – частота и длительность вибрации. С увеличением частоты с 8 до
44 Гц повреждающие действие вибрации на энергетический метаболизм на
растает. Также оно нарастает с увеличением длительности сеансов вибрации,
особенно в интервале с 21 до 56 сеансов. Качественная характеристика моде
ли заключается в переключении доминирования НАД-зависимого звена ды
хательной цепи в ФАД-зависимый (принцип фазности). Доказано вибропро-
тективное действие субстратных антигипоксантов (янтарная и глутаминовая
кислоты) в моделях общей вибрации у кроликов. Оно состоит в активизации
энергетического обмена тканей через повышение активности НАД-
зависимого звена дыхательной цепи и регуляторного сдерживания активно
сти сукцинатзависимой биоэнергетики. Аналогичным действием обладают и
блокаторы кальциевых каналов (фенигидин). В противоположность этому,
пиридин-3-карбоновая кислота усугубляет нарушения энергетического мета
болизма при воздействии общей вибрации. Комбинирование субстратных ан-
тигипоксантов (янтарная и глутаминовая кислоты) и блокаторов кальциевых
каналов (фенигидин) повышает эффективность защиты об общей вибрации в
сравнении с действием отдельных компонентов. Факторы охлаждения, чрез
мерной физической нагрузки и иммобилизации усугубляют действие вибра
ции. Бытовые токсиканты (карбофос, этиленгликоль, дихлорэтан) также ока
зывают отрицательное действие на энергетический метаболизм. При отрав
лении данными токсикантами резко снижается физическая выносливость,
нарушаются функции печени, накапливаются продукты распада белков, по
вышается активность перекисного окисления липидов мембран. Антигипок-
санты 2-этилтиобензимидазола гидробромид и 5-этокси-2-
этилтиобензимидазол приблизительно в равной степени восстанавливают на
рушенные показатели. Механизм защитного действия антигипоксантов при
отравлении карбофосом, этиленгликолем и дихлорэтаном состоит в сохране
нии эффективности работы дыхательной цепи, мембраностабилизирующем и
органопротективном действии. Полученные результаты позволяют рекомен
довать субстратные антигипоксанты (янтарная и глутаминовая кислоты) от
дельно или в сочетании с блокаторами кальциевых каналов (фенигидин) для
профилактики и лечения структурно-метаболических нарушений в тканях
при длительном воздействии вибрации (вибрационной болезни). Также ре
комендовано использование прямых антигипоксантов (2-
этилтиобензимидазола гидробромид и 5-этокси-2-этилтиобензимидазол) для
коррекции последствий действия бытовых токсикантов (карбофос, этиленг-
ликоль, дихлорэтан) на нервную систему и внутренние органы. Работа отно
сится к исследованиям в области фундаментальной, профессиональной, во
енной и экстремальной медицины.
Научно-практическая значимость
Теоретическая значимость работы определяется разработкой оригиналь
ной модели гипоксического состояния клеточного метаболизма вследствие
воздействия общей вибрации для оценки энергопротективного действия
фармакологических средств защиты от вибрации (вибропротекторов). Опи
саны характеристики модели, возможности ее использования в эксперимен
тальной фармакологии. С помощью данной модели оценено действие суб
стратных антигипоксантов (янтарная и глутаминовая кислоты), блокаторов
кальциевых каналов (фенигидин) и пиридин-3-карбоновой кислоты на энер
гетический метаболизм при воздействии локальной и общей вибрации. Прак
тическое значение определяется доказательством вибропротективного дейст
вия субстратных антигипоксантов (янтарная и глутаминовая кислоты), воз
растающего при комбинировании с блокаторами кальциевых каналов (фени-
гидин) и уменьшающегося при добавлении пиридин-3-карбоновой кислоты.
В основе положительного вибропротективного действия лежат биоэнергети
ческие феномены, связанные с оптимизацией энергопродукции и энергопо
требления, нарастающего при суммационном действии вибрации. Кроме то
го, доказано защитное действие антигипоксантов 2-этилтиобензимидазола
гидробромида и 5-этокси-2-этилтиобензимидазола при отравлении карбофо
сом, этиленгликолем и дихлорэтаном. Основу положительного действия ан-
тигипоксантов также составляет оптимизация энергетического обмена при
действии токсикантов. Результаты исследования расширяют современные
представления о биоэнергетическом звене патологических изменений в тка
нях, вызванных длительным воздействием общей и локальной вибрации, а
также возможностях фармакологической коррекции данных расстройств с
помощью энергопротективных (эрготропных) веществ, к которым относятся
антигипоксанты. Изучение механизмов защитного действия 2-
этилтиобензимидазола гидробромида и 5-этокси-2-этилтиобензимидазола в моделях интоксикации бытовыми ядами (карбофосом, этиленгликолем и дихлорэтаном) также позволяет оптимизировать схемы лечения больных за счет включения в них веществ эрготропного действия.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Факторы физической природы (общая и локальная вибрация) вызывают в тканях внутренних органов изменения по типу гипоксических (биоэнергетическая гипоксия), основным проявлением которых является переключение с доминирования НАД-зависимого звена дыхательной цепи на ФАД-зависимый тип (фазности). Это создает основу для использования данного механизма в качестве мишени действия разных антигипоксантов (суб-странтных, прямых или с вторичным антигипоксическим действием).
-
Биоэнергетические механизмы защитного действия препаратов субстратных антигипоксантов (препаратов, содержащих митохондриальные субстраты янтарную и глутаминовую кислоты) и блокаторов кальциевых каналов реализуются через восстановление активности НАД-зависимого звена дыхательной цепи и регуляцию сукцинатзависимой энергетики в предложенных режимах воздействия локальной и общей вибрации.
-
Дополнительным методом оценки действия антигипоксантов является изучение энергетического статуса лимфоцитов крови при экспериментальной общей и локальной вибрации, которое позволяет выявить последствия действия данного экстремального фактора и адекватно оценить эффективность фармакологической защиты от вибрации.
-
Субстратные антигипоксанты (препараты на основе митохондриаль-ных субстратов) способствуют сохранению гомеостатических параметров организма в условиях воздействия многофакторного стресса (вибрация в сочетании с предельной физической нагрузкой, переохлаждением и иммобилизацией). Антигипоксанты препятствуют формированию низкоэнергетического сдвига на уровне систем энергопродукции тканей, нормализуют клеточные и популяционные характеристики сукцинатдегидрогеназного статуса лимфоцитов, восстанавливают активность антиокислительных систем.
-
Факторы химической природы (острое отравление карбофосом, дихлорэтаном или этиленгликолем) снижают переносимость физической нагрузки, повышают активность печеночных ферментов, показатели азотистого обмена, перекисного окисления липидов и снижают активность антиокислительных систем в крови, нарушают микроциркуляцию, реологические свойства крови и газообмен тканей.
-
Прямые антигипоксанты (2-этилтиобензимидазола гидробромид и 5-этокси-2-этилтиобензимидазол) при курсовом применении (10 дней) восстанавливают переносимость физической нагрузки и нарушенные биохимические показатели в крови, оказывая антитоксическое действие.
Методология и методы исследования
Методология исследования состояла в изучении энергетического обмена внутренних органов (печень, почка) грызунов (кролик, крыса) методами биохимии, молекулярной биологии, фармакологии и морфологии при воздействии общей и локальной вибрации (разные режимы и продолжительность), сочетании вибрации с предельной физической нагрузкой, переохлаждением и иммобилизацией, воздействии бытовых токсикантов (карбофос, этиленгли-коль и дихлорэтан) и фармакологической коррекции последствий этих воз-
действий с помощью субстратных антигипоксантов (янтарная и глутаминовая кислоты), антигипоксантов с вторичным действием (блокаторы кальциевых каналов) и прямых антигипоксантов (2-этилтиобензимидазола гидробромид и 5-этокси-2-этилтиобензимидазол). Исследования выполнены с соблюдением всех принципов доказательной биологии и медицины и одобрены локальным комитетом по этике при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ.
Степень достоверности и апробация материалов исследования Статистическая обработка результатов. Выборка для каждой группы животных составила не менее 10-12 кроликов и крыс. Результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента, непараметрического критерия U Вилкоксона-Манна-Уитни, дисперсионного анализа по методу ANOVA на персональном компьютере.
Реализация результатов работы. Полученные результаты используются в учебном процессе кафедры фармакологии ФБГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ, кафедры специализированной терапии Института медицинского образования ФГБОУ ВПО «Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого» Минобрнауки РФ, ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия» МЗ РФ (г. Киров). Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ. Материал диссертации вошел в грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований при РАН (РФФИ №10-04-00473, №13-04-00186).
Апробация и публикация материалов исследования. Результаты и основные положения диссертации доложены и обсуждены на второй научно-практической конференции «Достижения клинической фармакологии в России» (Москва, 2009), VII Всероссийской конференции, посвященной 160-летию И.П. Павлова « Механизмы функционирования висцеральных систем» (СПб., 2009), 3-ей международной научной конференции «Экспериментальная и клиническая фармакология» (Минск, 2009), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 40-летию фармацевтического факультета Самарского государственного медицинского университета «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты» (Самара, 2011), научно – практической конференции «Современные проблемы военной медицины, обитаемости и профессионального отбора», посвященной 90-летию проф. И.Д. Кудрина (СПб., 2011), Российской научной конференции «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (СПб., 2011), Всероссийской научной конференции «Фармакологическая нейропро-текция» (Санкт-Петербург, 2013).
Апробация диссертации состоялась на совместном заседании кафедр
фармакологии, глазных болезней, отдела обитаемости Научно-
исследовательского центра ФБГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ и отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова
ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН.
По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, из них 17 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и 1 монография.
Личный вклад автора. Личный вклад автора осуществлялся на всех
этапах работы и состоял в планировании экспериментов, их
непосредственном выполнении, обработке полученных результатов,
обсуждении результатов, написании статей и тезисов, написании диссертации и автореферета. Участие автора в выполнении, сборе и анализе – 95%, статистической обработке – 100%, В написании статей и тезисов – 90%, написании диссертации и автореферата – 95%.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, научно-практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация изложена на 288 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц, 38 рисунков. Библиографический указатель содержит 609 наименований, в том числе 469 отечественных и 140 иностранных.
Фармакология антигипоксантов и вибропротекторов
Вибрация – это механические колебания твердых, жидких, упругих тел. Будучи техногенным физическим фактором, ее действие определяется передачей человеку механической энергии от источника колебаний. Изменения в организме, возникающие на фоне вибрационного воздействия, связаны с энергией колебания, Величина колебательной энергии, поглощенной телом человека (Q) прямо пропорционально площади контакта (S), времени воздействия (T) и интенсивности раздражителя (Измеров Н.Ф.и соавт., 1999; Суворов Г.А. и соавт., 2002; Ando H. еt al., 2002; Griffin M.J., Bovenzi M., 2003). По способу передачи механических колебаний человеку выделяют общую и локальную вибрации (Суворов Г., Прокопенко Л., 2001). Известно, что вибрация, при определенных сочетаниях амплитуды, частоты и длительности, может оказывать лечебное действие (Лытаев С.А., Шангин А.Б., 1999). Это воздействие имеет саногенетическую направленность и активизирует энергетический обмен, улучшает оксигенацию тканей, повышает адаптивный резерв организма (Лытаев С.А., Дячук А.В. и соавт., 1997; Лытаев С.А., Шангин А.Б., 1999). Однако, интенсивное, длительное воздействие вибрации, локальной или общей (Olsen N., 1990), неблагоприятно влияет на организм, вызывая, у лиц, контактирующих с вибрацией, как профессиональным фактором, вибрационную болезнь (Чудинова О.А., Борзунова Ю.М. и соавт., 2010). В ходе многолетних исследований была установлена связь физических параметров вибрации с особенностями ее биологического действия (Лытаев С.А., Шангин А.Б., 1999; Суворов Г.А. и соавт., 2002). Известно, что вибрация оказывает прямое действие на биологические структуры (Лытаев С.А., Шангин А.Б., 1999; Кирьяков В.А. и соавт., 2010), связанное с нарушением структурной организации тканей и клеток, в том числе мышц и миокарда, и отражаемое тканевыми биомаркерами (Saxton I.M., 2000). Клеточные и субклеточные структуры тканей, находясь в собственном электромеханическом ритме функционирования, взаимодействуют с периодически изменяющимися, механодеформирующими силами вибрации. Результирующие векторы оказывают независимое повреждающее воздействие на клетки, мембраны, органеллы (Изаков В.Я. и соавт., 1981; Рощупкин Д.И. и соавт., 2000). При этом максимально негативным эффектом обладает частота, резонансная к частоте данной ткани или органа. Материальной основой резонанса в биологических объектах являются масса и ее упругие свойства. Диапазон резонансных частот для тканей и органов теплокровных животных и человека находится в диапазоне от 1 до 200 Гц (Лытаев С.А., Шангин А.Б., 1999), но максимальный ответ на вибрационный стресс у кроликов реализуется на частоте 63 Гц (Ishitake T., 1990).
Ультраструктурными мишенями для воздействия вибрации являются все органеллы клетки, но наиболее чувствительны мембраны клетки и митохондрии (Артамонова В.Г. и соавт., 1999). Вибрационное воздействие вызывает набухание, просветление матрикса, реакцию крист, разрушение наружных и внутренних мембран, изменение формы и появление большого количества мелких митохондрий (Сарбаева Н.Н., 1987). Нарушение состояния клеток и мембран, вследствие вибрационного воздействия, оценивается как вибрационно-опосредованные цитопатии и мембранопатии, и играют важную роль в патогенезе гипоксии вибрационной болезни (Сухаревская Т.М. и соавт., 2000).
Как известно, константные уровни реакций перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты является обязательным условием поддержания целостности клеточных и субклеточных структур (Кондрашова М.Н., 1990; Сухаревская Т.М. и соавт., 2000; Лакомкин В.Л. и соавт., 2004). В нарушении состояния мембран и клеток решающее значение отводится активизации перекисного окисления липидов. Изучению состояния антиоксидантной системы (Allesio H.M., 1988) при вибрационной болезни посвящено немалое количество работ (Сухаревская Т.М. и соавт., 2000; Лакомкин В.Л. и соавт., 2004). В обобщающей работе Т.М. Сухаревской и соавт. (2000) установлено, что инициированная перекисью водорода хемилюминесценция сыворотки крови больных вибрационной болезнью в 3,5 раза превышала уровень контрольной группы, причем этот показатель не отличался в группах больных с локальной и общей вибрацией. Вибрационное воздействие ведет к целому ряду биохимических нарушений, негативно влияющих на систему гомеостаза (Гоголева О.И., Малютина Н.Н., 2000). Во время вибрации под влиянием катехоламинов стимулируется - и - рецептор-аденилазный комплекс, активизируются ключевые ферменты гликолиза, гликогенолиза, липолиза. Нарушается углеводно-энергетический обмен миокарда, накапливаются промежуточные недоокисленные продукты обмена: пировиноградная, молочная, альфа-кетоглутаровая кислоты. Наблюдаются сдвиги и в азотистом метаболизме тканей миокарда: отмечаются изменения общего и остаточного азота, креатина, креатинина (Сухаревская Т.М. и соавт., 2000). Исключительный интерес представляет работа, посвященная изучению влияния общей вибрации на гистохимическую активность окислительно-восстановительных ферментов нейронов мозжечка крыс, подвергнутых вибрации с частотой 8 Гц по 18 часов в сутки на протяжении от 1 до 30 суток (Ильин И.И. и соавт., 1991). Изменения морфологической картины, наблюдаемые авторами, соотносятся с изменением активности ферментов и согласуются с этапами развития общего адаптационного синдрома.
Помимо прямого повреждающего действия и опосредованного, через активизацию прооксидантной системы, в основе вибрационно-опосредованных изменений лежат нейрогуморальные (Балан Г.М., Кушелевский С.Г., 1987; Сухаревская Т.М. и соавт., 2000) и нейрорефлекторные нарушения (Швалев О.В., 1986; Артамонова В.Г. и соавт, 1999), ведущие к развитию гипоксии (Сухаревская Т.М. и соавт., 1991). Фазная реакция нейроэндокринной системы на вибрационное воздействие, согласуется со стадиями развертывания общего адаптационного синдрома.
Гормональное опосредование общего адаптационного синдрома на фоне вибрации осуществляется гипоталямо-гипофизарно-адренокортикальной, гипоталямо-гипофизарно-гонадной и гипоталямо-гипофизарно-тиреоидной системами. Действие вибрации различной амплитуды и продолжительности ведет к морфофункциональным изменениям в гипофизе, надпочечниках, щитовидной железе, семенниках у экспериментальных животных. Выраженность этих изменений может доходить до степени деструктуризации и паранекроза на фоне выраженных расстройств кровообращения (Рахимов Я.А. и соавт., 1979). Немаловажную роль в этом процессе играют и нарушения нервной трофики, обусловленные вовлечением в процесс центральной и периферической нервной системы.
Материалы и методы исследования
Действие общей вертикальной вибрации на кроликов с амплитудой 0,5мм осуществляли с помощью промышленной установки УВ 70/200. Ежедневные сеансы вибрации с частотой 8 Гц и 44 Гц по 60 мин проводили в одно и то же время – в утренние часы с 9.00 до 11.00 в осенне-зимний период во избежание влияния на результаты исследований суточных и сезонных колебаний энергетического обмена.
Воздействие общей вертикальной вибрации в сочетании с предельной физической нагрузкой моделировали в тесте принудительного плавания у крыс с грузом, составляющим 10% от массы крыс, при температуре воды 180С (Волчегорский И.А. и соавт., 2000). Перед проведением теста животных подвергали ежедневному воздействию общей вертикальной вибрации на протяжении 7сеансов по 30 мин с амплитудой 0,5мм и частотой 44 Гц. Изучение воздействия общей вертикальной вибрации в сочетании с острым охлаждением и иммобилизацией крыс проводили после процедуры вибрации в течение 90 мин с частотой 44 Гц в течение 7 дней. На 7- й день, после окончания всех сеансов вибрации, крыс фиксировали в специальных контейнерах (рис. 2), обеспечивающих неподвижность, тем самым устраняя роль скелетной мускулатуры в реакции срочной адаптации к холоду и поддержании температурного гомеостаза организма (Иванов К.П., 1990; Ковальчук Л.А., Ястребов А.П., 2003). Далее иммобилизованных животных помещали в морозильную камеру с температурой - 220С на 60 мин. До охлаждения и после него измеряли ректальную температуру электротермометром ТПЭМ-1.
Локальное вибрационное воздействие на крыс с частотой 30 Гц амплитудой 2,5 мм по 90 мин на протяжении ежедневных 7 сеансов моделировали с помощью локального электродинамического генератора. Устройство устанавливали в правом подреберье абдоминальной области (электрод площадью 1,5 х 1,5 см) иммобилизованного на спине животного. Рис. 3. Структурная схема устройства для изучения влияния локальной вибрации на организм 1 – якорь; 2 – генератор; 3 – рабочий орган; 4 – объект исследования; 5 – окуляр-микрометр
Устройство содержит электромагнитный привод с подвижным якорем, регулируемый генератор переменного тока (с изменением частоты от 5 до 100 Гц), рабочий орган (с изменяемой площадью контактной поверхности от 1 до 100 мм2), жестко связанный с подвижным якорем, посредством которого осуществляется механическое воздействие на объект исследования. Все основные параметры устройства задаются генератором колебаний (частота и амплитуда), при этом амплитуда колебаний контролируется при помощи оптического окуляра - микрометра с 20-и кратным увеличением. Перед началом работы устанавливают необходимую частоту и начальную амплитуду колебаний генератора. Переменный ток, проходя через катушку электромагнитного преобразователя, вызывает механические перемещения подвижного якоря и связанного с ним рабочего органа, площадь контактной поверхности которого выбирается исходя из условий эксперимента. После контакта с объектом исследования соответствующей регулировкой генератора устанавливают необходимую рабочую амплитуду вибрации. В ходе эксперимента должен осуществляться периодический контроль амплитуды вибрации оператором через окуляр-микрометр.
Всем животным предварительно внутрибрюшинно вводили диазепам в дозе 0,15 мг/кг для предотвращения избыточных эмоциональных реакций. Контрольных животных помещали под выключенный электродинамический генератор на то же время.
В моделировании интоксикации карбофосом, дихлорэтаном, этиленгликолем было использовано 180 беспородных белых крыс-самцов массой 180–200 г. За 24 ч до опытов кормление животных, находившихся на свободном режиме, прекращали. Изучаемые токсические агенты вводили однократно внутрижелудочно в дозе 1,0 ЛД50. В качестве основного показателя токсичности использовали среднесмертельные дозы яда (ЛД50), равные для карбофоса 256,4 ± 8,7 мг/кг, дихлорэтана ЛД50 - 736,9 ± 9,4мг/кг, этиленгликоля - 692,8 ± 35,2мг/кг. Расчет 1,0 ЛД50 производили методом наименьших квадратов пробит-анализа кривых летальности по В.Б. Прозоровскому (Куценко С.А., 2004) и табличными методами определения средней эффективности дозы или среднего времени выживания. Забор крови осуществляли у наркотизированных гексеналом (125 мг/кг) животных из брюшной аорты или нижней полой вены. Оценку физической выносливости при интоксикации (Заугольников С.Д. и соавт., 1974) и на фоне защиты антигипоксантами осуществляли по плавательной пробе с отягощением (Волчегорский И.А. и соавт., 2000), оценивая время удержания на плаву (ВУП). Результаты пробы выражали в процентах от уровня показателя у интактных крыс. Тестирование проводили на 1-е, 3-и, 5-е, 7-е и 10-е сут после отравления. Биохимические исследования выполняли на автоанализаторе фирмы Texnicon Instruments Corporation (США). В крови контрольных и животных, подвергнутых интоксикации, изучали активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотранферазы (АлАТ), общего белка, креатинина, азота мочевины, калия и натрия сыворотки на 1-е, 3-и и 7-е сут после отравления.
Активность процессов свободнорадикального окисления оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА); функцию антиоксидантной системы – по концентрации восстановленного глутатиона (ВГ). Интегративную оценку эндогенной интоксикации осуществляли, вычисляя лейкоцитарный индекс интоксикации по Островскому и Кальф-Калифу (Кальф-Калиф Я.Я., 1941; Островский О.В. и соавт., 1994).
Динамика показателей функциональной активности митохондрий тканей экспериментальных животных (кролики, крысы) при воздействии общей и локальной вибрации
Интегративный параметр скорости эндогенного дыхания гомогената ткани свидетельствует об оснащенности ДЦ эндогенными метаболитами, накопленными в процессе ее функционирования, и изменяется под действием внешних факторов, направленных на целостный организм (Никольс Д., 1985; Кондрашова М.Н., 1987). В нашем исследовании динамика показателя эндогенного дыхания зависела от режимов (частоты и длительности) вибрационного воздействия (рис. 6).
Ингибиторный анализ показал, что коэффициент приращения малонатчувствительности (КПмал.ч.) на фоне воздействия вибрации 8 Гц снизившись на 40% от показателей контрольных животных, сохранялся на этом уровне до завершения вибрации. Через 7 сеансов вибрации 44 Гц коэффициент приращения чувствительности к малонату увеличивался на 20% по отношению к показателям интактной группы, свидетельствуя о накоплении эндогенной ЯК и увеличении ее вклада в процессы окисления в ткани печени. После 56 сеансов вибрации 44 Гц данный показатель становился на 40% (р 0,01) ниже уровня контроля, отражая начавшиеся процессы повреждения в ФАД-зависимом звене ДЦ и истощение механизмов адаптивных перестроек, реализуемых, прежде всего, через изменение активности сукцинатзависимой биоэнергетики (Маевский Е.И и соавт., 2001; Мазина Н.К. и соавт., 2001; Vorobieva V.V., Shabanov P.D., 2009). После 56 сеансов вибрации 44 Гц данный показатель становился на 40% (р 0,01) ниже уровня контроля, отражая начавшиеся процессы повреждения в ФАД-зависимом звене ДЦ и истощение механизмов адаптивных перестроек, реализуемых, прежде всего, через изменение активности сукцинатзависимой биоэнергетики (Маевский Е.И и соавт., 2001; Мазина Н.К. и соавт., 2001; Vorobieva V.V., Shabanov P.D., 2009). Окисление экзогенных НАД-зависимых субстратов в состоянии «покоя» угнетаются как при низко - так и высокочастотной вибрации (рис. 7А). Окисление экзогенных НАД-зависимых субстратов в состоянии «покоя» угнетаются как при низко - так и высокочастотной вибрации (рис. 7А). Скорость окисления экзогенной ЯК возрастает на 44% (р 0,05) после 21 сеанса вибрации 44 Гц. Однако более продолжительная вибрация вызывает угнетающий эффект на данный кинетический параметр (рис. 7Б). После 7 и 21 сеанса вибрации 8 Гц показатель Vяк-р, не отклонявшийся от интактного контроля, начинает увеличиваться к завершению вибрационного воздействия (рис.7Г). Темпы окисления ЯК на фоне вибрации 44 Гц в состоянии активности превосходят темпы окисления данного субстрата на фоне вибрации 8 Гц в два раза (р 0,01) после 21 сеанса вибрации. Примечание. Коэффициенты КПэ, КПп, КПр даны в относительных единицах измерения. Однако к 56 сеансу вибрации 44 Гц показатель Vяк-р начинает снижаться, свидетельствуя о том, что гиперактивность сукцинатзависимой биоэнергетики привела к феномену «разрыхления» ДЦ (Кондрашова М.Н., 1987 1989), нарушению ее электронтранспортной функции и началу II фазы биоэнергетической гипоксии.
Динамика соотношений парциальных реакций эндогенного дыхания, характеризующих изменчивость основных потоков электронов при окислении ФАД- и НАД-зависимых субстратов в ферментных комплексах соответствующих фракций ДЦ, как отклик на воздействие неблагоприятного фактора, отражена в табл. 2.
Если ДЦ работает в оптимальном режиме, то добавление экзогенного субстрата к тканевому препарату в состоянии эндогенного дыхания оказывает активизирующее воздействие. Количественной мерой «энергизации» в нашем исследовании стал коэффициент стимуляции дыхания (КСглу+мал, КСяк). Подобно этому, стимуляция субстратного дыхания разобщителем окислительного фосфорилирования протонофором 2,4-ДНФ косвенно отражает уровень сопряженности окисления и фосфорилирования в ДЦ и эффективность ее работы (КРглу+мал, КР як).
Коэффициенты КСглу+мал и КРглу+мал в ответ на вибрационное воздействие угнетаются (рис. 8А,В). Исчезает стимулирующее действие разобщителя (КРглу+мал 1,0). После завершения 56 сеансов вибрации 8 Гц коэффициент КРглу+мал 1,0, что свидетельствует о нарушении энергетической регуляции процессов окисления и фосфорилирования в зоне основного НАД-зависимого пути ДЦ, свидетельствуя о снижении его активности и уменьшении вклада в энергообеспечение. Это, вероятно, происходит вследствие «разрыхления» структурно-функциональной организации ДЦ на данном участке и нарушения процессов переноса электронов.
