Содержание к диссертации
СОДЕРЖАНИЕ.
Список сокращений 4
1. ВВЕДЕНИЕ 6
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Характеристика ДК , 11
2.2. Происхождение и развитие ДК 15
2.3. Методы получения ДК 18
2.4. Применение ДК в медицинской практике. Современное положение и перспективы 26
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 35
3.1. Реагенты и лабораторные животные 35
3.2. Получение ДК человека и мыши 37
3.3. Анализ фенотипа ДК 38
3.4. Исследование влияния ганглиозида GM1 на фенотип ДК человека и мыши 38
3.5. Исследование влияния на дифференцировку ДК человека ИЛ-452 при разных концентрациях ГМ-КСФ 38
3.6. Исследование воздействия ИЛ-452 на активацию транскрипционного
фактора STAT6 39
3.7. Обработка ДК человека и мыши препаратами ЛПС и белковыми антигенами Y.pestis Сап и LcrV 41
3.8. Определение концентрации ИЛ-1 и ФНОа методом ИФА 42
3.9. Статистическая обработка данных 42
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 43
4.1. Получение ДК человека из разных источников 43
4.2. Получение ДК мыши 49
4.3. Воздействие на фенотип ДК человека и мыши ганглиозида GM1 ,. 50 4.4. Исследование воздействия альтернативной формы ИЛ-4 на экспрессию молекул антигенного представления и костимуляции на поверхности ДК при
различных концентрациях ГМ-КСФ 54
4.5. Исследование воздействия альтернативной формы ИЛ-4 на активность транскрипционного фактора STAT6 62
4.6. Созревание ДК под воздействием ЛПС различных видов патогенных и условно патогенных бактерий 64
4.7. Воздействие на фенотип ДК человека антигенов Y.pestis Cafl и LcrV.73
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 80
ВЫВОДЫ 84
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 85
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
Исследование свойств дендритных клеток (ДК) представляет собой одно из наиболее интересных и перспективных направлений современной иммунологии. Это обусловлено тем, что ДК играют ключевую роль в инициации и регулировке реакций врожденного и приобретенного иммунитета [66, 67,182,192].
Функциональная активность ДК зависит от различных факторов. Так, в зависимости от состава среды, условий культивирования клеток-предшественников, факторов созревания и др. можно получить ДК с различными свойствами. Одни из них будут индуцировать иммунный ответ по Тх1/Тх2 типу, другие, наоборот, активировать регуляторные Т-клетки (Трег) и приводить к иммуносупрессии (толерогенные ДК). Известно, что факторы созревания, прибавляемые к ДК при инкубации с антигеном, существенным образом влияют на их способность к миграции в лимфатические узлы и представлению антигена Т-лимфоцитам [54, 192].
Как было показано в недавних работах, ЛПС различных видов бактерий и даже ЛПС одного и того же штамма, культивируемого в различных условиях, по-разному действуют на иммунную систему хозяина [57]. Это обусловлено тем, что тонкие модификации структуры ЛПС вызывают существенные изменения в связывании данного бактериального продукта со сложной системой рецепторов многоклеточных хозяев [57]. Несмотря на то, что ЛПС традиционно используют в лабораторной практике в качестве индуктора созревания ДК, отсутствуют данные о сравнительном действии на ДК ЛПС различных видов бактерий. Отсутствуют также данные о действии на ДК ряда белковых факторов вирулентности бактерий. Исследование действия на ДК различных бактериальных антигенов могло бы способствовать уточнению особенностей патогенеза инфекционного процесса и разработке новых подходов к получению вакцин. Наряду с факторами, повышающими функциональные свойства ДК, существуют соединения, способные ингибировать их активность. Например, ИЛ-10 снижает способность ДК созревать в ответ на провоспалительные факторы, что приводит к развитию толерогенных ДК, которые не только не стимулируют иммунные реакции, а даже подавляют их [182, 231]. ДК играют важную роль в индукции и поддержании иммунных реакций на аллергены при астме [121]. Один из естественных механизмов предотвращения развития гиперчувствительности к аллергенам, предположительно, заключается в подавлении экспрессии молекул антигенной презентации главного комплекса гистосовместимости ЇЇ-го типа (ГКГ-ІІ) на поверхности ДК легких под влиянием аутокринного ИЛ-10 [121]. Анализ данных литературы свидетельствует от том, что ИЛ-452 - естественный антагонист ИЛ-4 не активирует последующий сигнальный каскад и конкурирует с ИЛ-4 за общую для них цепь рецептора ИЛ-4Ра. Соотношение этих двух форм ИЛ-4 в организме, по мнению некоторых авторов, играет важную роль в патогенезе атопической астмы [77, 194]. Действие ИЛ-452 на ДК до сих пор не было исследовано.
Ряд исследователей продемонстрировали негативное влияние некоторых ганглиозидов на ДК и другие антигенпредставляющие клетки (АПК) [33, 162, 196, 197, 233]. Ганглиозиды - мембранные гликосфинголипиды, содержащие сиаловую (нейраминовую) кислоту. Они представлены в мембранах абсолютно всех клеток и выполняют многообразные биологические функции, включая регуляцию роста, дифференцировки и гибели клеток [206]. Качественный состав ганглиозидов изменен в опухолевых клетках [165, 224]. Известно, что ганглиозиды способны отщепляться с поверхности опухолевых клеток в окружающую их среду [24, 166], что вносит значительный вклад в вызываемую раковыми клетками иммуносупрессию [51, 86, 112, 117, 132]. Исследование влияния различных ганглиозидов на ДК представляет собой новое и перспективное направление в иммунологии, существенное для клинической практики при лечении опухолевых заболеваний. Несмотря на большое количество исследований, посвященных ДК и все возрастающий интерес к ним, многие аспекты их развития (пути диффе-ренцировки, созревания, факторы, влияющие на их способность к представлению антигена и т.д.) изучены не достаточно полно. Все изложенное выше и определило цель настоящего исследования
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Изучение особенностей дифференцировки и созревания дендритных клеток под действием факторов бактериального (ЛПС, белковые факторы) и эукариотического происхождения (ганглиозиды, цитокины).
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Определить морфологические и иммунофенотипические характеристики ДК при использовании в качестве индукторов созревания ЛПС условно патогенных и патогенных бактерий {Escherichia coli, Shigella sonnet, Salmonella typhi, Yersiniapestis, Francisella tularensis).
2. Провести сравнительное исследование действия белковых антигенов Y. pestis (фактора вирулентности LcrV и капсульного белка Cafl) на иммунофенотип ДК.
3. Исследовать секрецию ДК ФНО-а и ИЛ 1 в присутствии антигенов Y.pestis LcrV и Cafl.
4. Определить иммунофенотип ДК при их дифференцировке в присутствии ганглиозида GM1.
5. Изучить особенности иммунофенотшта ДК, дифференцирующихся из моноцитов периферической крови человека в присутствии альтернативного сплайс-варианта ИЛ-4 (ИЛ-452).
6. Исследовать влияние ИЛ-452 на активацию транскрипционного фактора STAT6.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые проведено сравнительное изучение особенностей дифференцировки и созревания ДК под действием факторов бактериального (ЛПС, белковые факторы) и эукариотического происхождения (ганглиозиды, цито-кины).
Препараты бактериальных ЛПС значительно различаются по способности индуцировать созревание ДК. Наиболее эффективным индуктором созревания дендритных клеток является ЛПС Е.соН. ЛПС возбудителя чумы Y. pestis характеризуется менее выраженной способностью индуцировать созревание ДК, а ЛПС возбудителя туляремии F. tularensis вообще не способен индуцировать созревание ДК.
Впервые показано, что белковые факторы вирулентности LcrV и Cafl Y.pestis оказывают неоднозначное действие на иммунофенотип ДК человека. Секретируемый фактор вирулентности LcrV подавляет экспрессию маркера зрелости ДК CD83, но стимулирует экспрессию молекул костимуляции CD80. Капсульный антиген Cafl является мощным индуктором секреции ФНО-а и созревания ДК.
Установлено, что ганглиозид GM1 из бычьего мозга угнетает нормальную дифференцировку ДК мыши, приводя к уменьшению экспрессии молекул костимуляции.
Впервые исследовано действие альтернативной формы ИЛ-4 (ИЛ-452) на диффренцировку ДК. Показано, что ИЛ-452, в отличие от ИЛ-4, не поддерживает экспрессию молекул костимуляции CD86 и антигенной презентации ГКГ-ІІHLA-DR на поверхности ДК, ИЛ-452 слабо подавляет экспрессию HLA-DR, индуцируемую ИЛ-4 и оказывает супрессивное действие на активацию транскрипционного фактора STAT6, индуцируемую ИЛ-4. НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Результаты, полученные при исследовании влияния факторов бактериального и эукариотического происхождения на дифференцировку и созревание ДК, могут быть использованы для оптимизации методов получения вакцин на основе ДК.
Полученные данные об особенностях действия ЛПС возбудителей особо опасных заболеваний {Y.pestis и F.tularensis) и белковых антигенов Y.pestis на ДК могут иметь существенное значение для выяснения механизмов взаимодействия патогенных микроорганизмов с иммунной системой хозяина, а также для отбора антигенных компонентов с целью конструирования противо-инфекционных профилактических и терапевтических вакцин.
Присутствие иммуносупрессивных ганглиозидов в опухолевых лизатах при нагрузке ими препаратов ДК может существенным образом повлиять на эффективность таких противоопухолевых препаратов. В работе было показано, что ганглиозид GM1 не влияет на иммунофенотип полностью развившихся незрелых ДК человека при кратковременной культивации с ним (3 суток). Таким образом, он, по-видимому, не способен негативно повлиять на способность ДК, нагруженных опухолевым лизатом, представлять опухолевые антигены.
Толерогенные ДК могут быть использованы для подавления иммунных реакций при аутоиммунных заболеваниях и трансплантации органов. Настоящая работа позволяет предположить, что подобного типа ДК могут быть получены в присутствии ИЛ-452.
Результаты исследований используются в циклах лекций курса «Вакци-нопрофилактика» и курса по иммуноонкологии ММА им. И. М. Сеченова.
