Введение к работе
Актуальность проблемы. Анализ клеточного цикла кроветворных клеток в норме, при гематологических заболеваниях, в условиях воздействия ионизирующей радиации и цитостатических препаратов длительное время находится в сфере внимания ученых, работающих в этой области в нашей стране и за рубежом. Параметры пролиферации исследовали различными методами, включая морфологический, радионуклидный (авторадиография и сцинтилляционный счет), цитохимические, иммунологические способы и их комбинации.
Показатели клеточного цикла нормальных и злокачественных клеток могут иметь решающее значение в оценке прогноза и в выборе метода лечения ряда гематологических и онкологических заболеваний. Эти параметры в определенных случаях позволяют контролировать эффективность терапии и существенно помогают в диагностике. Действие лучевой и химиотерапии приводит к нарушениям кинетики «критических» тканей, к которым относится в первую очередь гемопоэтическая ткань, что дает возможность использовать показатели пролиферации для оценки степени воздействия цитотоксических агентов на Организм по конечному биологическому эффекту. До настоящего времени применение этих подходов было недостаточно эффективным, на наш взгляд, из-за высокой трудоемкости классических методов анализа клеточного цикла, что требовало больших затрат времени и позволяло проводить только ретроспективную оценку.
В последние годы большие успехи были достигнуты благодаря использованию проточной цитометрии, которая возникнув как метод автоматизации в цитологии выделилась в самостоятельное направление. Однако, при больших возможностях этого методического подхода (высокая точность и быстрота анализа), полученные научные результаты имеют фрагментарный характер и в большинстве работ посвящены решению частных проблем. Много нерешенных вопросов имеется в методических подходах к изучению пролиферации клеток при помощи проточной цитометрии.
Целью работы явилась оценка параметров клеточного цикла кроветворных клеток при помощи проточной цитометрии у гематологических больных, в экспериментах на животных и на культурах клеток до и после воздействия цитостатических факторов, а также анализ возможности применения полученных данных в клинико-лабораторной диагностике.
Основные задачи исследования
-
Разработать подход к изучению пролиферации гемопоэтических клеток на базе современных методов проточной цитометрии.
-
При помощи ДНК-цитометрии получить параметры клеточного цикла клеток костного мозга здоровых людей и оценить их взаимосвязь с показателями миелограммы.
-
Исследовать кинетику гемопоэтических клеток у больных острыми лейкозами и анемиями различной этиологии (железодефицитные, пернициозные, аутоиммунные гемолитические и апластические анемии).
-
Изучить в экспериментах на животных изменения клеточного цикла миелокариоцитов при действии цитостатических факторов (ионизирующей радиации и 5-фторурацила).
-
Оценить в клинических наблюдениях параметры пролиферации клеток костного мозга после радиационного облучения организма и разработать критерии для индикации лучевого поражения.
-
Провести анализ пролиферативной активности лимфоцитов в культуре с фитогемагглютинином в норме и при заболеваниях, сопровождающихся нарушениями иммунного статуса.
Научная новизна. В работе использован новый комплексный подход для изучения клеточного цикла кроветворных клеток на основе современных проточно-цитометрических методов. Показано, что метод дает воспроизводимые и достоверные оценки.
Изучены костномозговые пунктаты практически здоровых людей, пациентов, получавших химиотерапию и больных острыми лейкозами в состоянии гематологической ремиссии для характеристики распределения гемопоэтических клеток по стадиям клеточного цикла в норме. Проведена оценка степени влияния на точность и устойчивость цитометрических показателей клеточного состава аспиратов при сопоставлении результатов ДНК-цитометрии с данными гемоцитологического анализа (миелограмма). Впервые установлено, что параметры клеточного цикла клеток костного мозга в норме характеризуются стабильностью, что отражает постоянство гемопоэза. При острых лейкозах и, в меньшей степени, при анемиях наблюдается неустойчивость показателей пролиферации, что связано с нестабильностью кроветворения и неэффективным кроветворением. Высокая вариабельность параметров клеточного цикла лейкозных клеток свидетельствует об их гетерогенности в пределах определенных нозологических групп.
Установлены закономерности нарушеїшя клеточного цикла миелокариоцитов при облучении организма. Выявлено, что эффекты ионизирующей радиации проявляются в снижении доли клеток в S-фазе и в блоке на стадии G2+M. Получено, что зависимость содержания клеток, синтезирующих ДНК от дозы излучения у экспериментальных животных имеет логарифмический характер в диапазоне 0,5 - 6 Гр через 1 сутки после воздействия. Действие цитостатического агента 5-фторурацила приводило к снижению пролиферативпого пула клеток и не сопровождалось блоком в стадии G2+-M. Период восстановления пролиферации клеток после действия цитостатика и в следствии облучения имел сходную динамику, которая характеризовалась повышением содержания миелокариоцитов в стадиях S и G2+M.
Исследованы параметры распределения клеток костного мозга по стадиям клеточного цикла после облучения организма человека и проведено сопоставление показателей миелограммы с данными проточной цитометрии. Для этого была использована разработанная нами компьютерная программа на основе рекуррентного алгоритма классификации Дж.Х.Фридмана. При проведении такого анализа в отношении пациентов, получавших лучевую терапию органов средостенья, получено, что наибольшей информативностью обладают два цитометрических показателя - доля клеток в стадии синтеза ДНК и отношение S/(G2+M). В пространстве этих двух признаков можно проводить разделение со 100% достоверностью. Также получено логическое правило, позволяющее отделять лиц, получивших облучение при аварии от здоровых людей, то есть диагностировать факт облучения организма низкими дозами радиации (0,2 - 0,4 Гр).
Показано, что анализ пролиферативной активности лимфоцитов в культуре с фитогемагглютинином по параметрам клеточного цикла оптимизирует оценку бластной трансформации (РБТЛ). Применение субоптимальных доз митогена (доза, при которой ответ ниже максимального на 37%) повышает информативность метода и делает его значимым лабораторным тестом, отражающим состояние клеточного иммунитета.
Теоретическое и практическое значение работы. Установленные клинические и экспериментальные данные значительно расширяют современные представления о клеточном цикле гемопоэтических клеток в норме, при гематологических заболеваниях и при воздействии на организм цитостатических факторов. Получетгые сведения можно использовать для оценки состояния гемопоэза при различных заболеваниях и токсико-радиационных поражениях организма, решения вопросов патогенеза, классификации и разработки схем химиотерапии острых лейкозов.
Реализация результатов исследования. Внедрение полученных результатов в практику осуществляется следующими путями:
-
Разработанные автором методики применяются при проведеіши клинико-лабораторных и научных исследований в Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения, Главном военном клиническом госпитале им. Н.Н.Бурденко и в Гематологическом научном центре РАМН.
-
В процессе выполнения данной работы был разработан метод изучения биологически-активных факторов на культурах клеток, который апробирован и защищен авторским свидетельством на изобретение № 289321.
-
Результаты опубликованы в 34 печатных работах, докладывались на научных и научно-практических конференциях.
-
Полученный подход для оценки облучения организма по параметрам клеточного цикла в сочетании с показателями миелограммы при помощи логических правил, на основе реккурентного алгоритма классификации Дж.Х.Фридмана можно рекомендовать для разработки методик биологической дозиметрии.
5. Результаты работы используются при обучении аспирантов и научных сотрудников на рабочих местах методам анализа параметров пролиферации клеток. Положения, выносимые на защиту.
-
Параметры клеточного цикла клеток костного мозга характеризуются стабильностью, что отражает постоянство кроветворения.
-
При острых лейкозах и при анемиях отмечается высокая вариабельность показателей пролиферации клеток костного мозга, что связано с гетерогенностью лейкозных клеток, нестабильностью кроветворения и неэффективным гемопоэзом.
-
Эффекты. ионизирующего облучения организма проявляются главным образом в снижении доли миелокариоцитов в S-фазе и в блоке в стадии G2+M. Оценка степени лучевого воздействия по этим цитометрическим показателям в сочетании с данными миелограммы при помощи логических правил на основе рекуррентного алгоритма классификации Дж.Х.Фридмана информативна и может использоваться для разработки методик биологической дозиметрии.
-
Изучение пролиферативной активности лимфоцитов в культуре с субоптимальными дозами фитогемагглютинина по параметрам клеточного цикла объективизирует оценку бластной трансформации (РБТЛ), повышает достоверность метода и делает его информативным клинико-лабораторным тестом, отражающим состояние иммунитета.
Апробация диссертации. Материалы работы докладывались и обсуждались на: Симпозиуме «Цитофотометрия гемопоэтических клеток» (Москва, 1983); YII Научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинского обеспечения войск» (Москва, 1985); Научной конференции «Проблемы интенсивной терапии в клинике» (Москва, 1985); Ш Всесоюзном совещании но проточной цитометрии и сортировке клеток (Гатчина, 1986); Научной конференции «Специализированная медицинская помощь и современные проблемы ее интеграции» (Москва, 1986); IY Всесоюзном симпозиуме по проточной цитометрии (Пущино-на-Оке, 1988; П Всесоюзном симпозиуме «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии» (Самарканд, 1991); Международном симпозиуме «Новые направления в развитии гематологии (Гамбург- Санкт-Петербург, 1992, 1994); Y Российском съезде специалистов по лабораторной диагностике (Москва, 1995); Гематологической секции Московского научного общества терапевтов (Москва, 1996); Научно-практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика - состояіше и перспективы»(Санкт-Петербург, 1996); Семинаре пользователей «Roche» (Санкт-Петербург - Валаам, 1996); I Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы» (Москва, 1996); Конференции «Анализ изображения клеток системы крови: настоящее и
будущее» (Москва, 1996); Симпозиуме «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 1997).
Выступления с лекциями и подготовка специалистов лечебных и научных учреждений гематологического профиля на рабочих местах. Публикации. По теме диссертации опубликовано 34 научных работы. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы и приложения. Изложена на 234 страницах, содержит 10 таблиц, иллюстрирована 60 рисунками. Список литературы включает 230 наименований. В приложении приведены 10 таблиц статистической обработки данных.
