Содержание к диссертации
Введение
Окислительный стресс и основные подходы к его коррекции (литературный обзор) .14
1.1. Активные формы кислорода и окислительный стресс .14
1.1.1. Характеристика активных форм кислорода 14
1.1.2. Окислительный стресс при разных патологических состояниях .17
1.1.3. Окислительный стресс при алкоголизме и осложнениях, обусловленных алкогольной интоксикацией 21
1.2. Коррекция окислительного стресса 27
1.2.1. Характеристика антиоксидантов .27
1.2.2. Использование антиоксидантов при разных патологических состояниях 32
1.2.3. Использование антиоксидантов при лечении больных с алкогольной зависимостью. 35
1.3. Характеристика карнозина и его применение в экспериментальных исследованиях и клинической практике 38
1.3.1. Характеристика и основные свойства карнозина 38
1.3.2. Использование карнозина в экспериментальных исследованиях и клинической практике
Глава 2. Материал и методы исследования 52
2.1. Характеристика участников исследования 52
2.1.2. Характеристика БАД Севитин 55
2.2. Методы исследования 57
2.3. Методы статистической обработки данных 63
Глава 3. Результаты собственных исследований .64
3.1. Влияние карнозина на выраженность окислительного стресса у больных с алкогольной зависимостью на этапе формирования ремиссии 64
3.1.1. Влияние карнозина на уровень карбонилированных белков и ТБК-реактивных продуктов в плазме крови больных алкоголизмом на этапе формирования ремиссии 64
3.1.2. Влияние карнозина на активность антиоксидантных ферментов плазмы крови у больных алкоголизмом на этапе формирования ремиссии 67
3.1.3. Влияние карнозина на клинические и биохимические показатели крови больных алкоголизмом на этапе формирования ремиссии 70
3.2. Защита карнозином белков и липидов плазмы крови от окислительной модификации, вызванной действием этанола или ацетальдегида in vitro .74
3.2.1. Влияние карнозина на окислительную модификацию белков и липидов плазмы крови в присутствии этанола in vitro 74
3.2.2. Влияние карнозина на окислительную модификацию белков и липидов плазмы крови в присутствии ацетальдегида in vitro 77
3.2.3. Влияние карнозина на белковый спектр плазмы крови после инкубации крови с этанолом и ацетальдегидом .81
Глава 4. Обсуждение результатов 85
Выводы .106
Список литературы
- Окислительный стресс при разных патологических состояниях
- Характеристика карнозина и его применение в экспериментальных исследованиях и клинической практике
- Влияние карнозина на уровень карбонилированных белков и ТБК-реактивных продуктов в плазме крови больных алкоголизмом на этапе формирования ремиссии
- Влияние карнозина на окислительную модификацию белков и липидов плазмы крови в присутствии ацетальдегида in vitro
Окислительный стресс при разных патологических состояниях
Характеристика активных форм кислорода При окислительном метаболизме в организме образуются различные соединения реактивного кислорода, так называемые активные формы кислорода (АФК). К ним относятся как радикальные (супероксидный анион (OB2PB-P), алкоксильный (ROP.P) и пероксильный (ROOP.P) радикалы, гидроксид-радикал (ОНP.P), гидропероксильный радикал (НО2), так и не радикальные соединения (пероксид водорода (НB2BОB2B) и синглетный кислород (P1PОB2B) и др. (Владимиров Ю.А., 2000; Болдырев А.А., 2001).
АФК образуются при нормальном течении метаболизма в результате окислительно-восстановительных реакций. В физиологических условиях эти соединения не накапливаются в клетке и выступают в роли вторичных сигнальных молекул (вторичных мессенджеров) (Скулачев В.П., 1996, 2001; Marnett L.J., 2002; Болдырев А.А., 2003; Poli G. et al., 2004; Меньщикова Е.Б. и др., 2006; Halliwel B., Gutteridge J.M., 2007). Одним из основных источников АФК в клетках многих типов являются митохондрии. Эти органеллы концентрируют в себе большую часть окислительных метаболических путей и поэтому содержат многочисленные редокс-переносчики и центры, потенциально способные к одноэлектронному восстановлению кислорода до радикала (Cadenas E. et al., 2000; Андреев А.Ю. и др., 2005; Зоров Д.Б. и др., 2005; Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007). В генерации АФК участвуют NADPH-оксидазы, 5-липоксигеназа, ксантиноксидаза, цитохром Р-450 (Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007). В настоящее время не вызывает сомнения уникальная роль АФК в жизнедеятельности организмов. Ярким примером положительной роли этих соединений является клеточная система иммунитета (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989; Скулачев В.П., 1996). На 15 ряду с другими свободными радикалами, АФК участвуют в синтезе простаг-ландинов, лейкотриенов, тромбоксанов, в регуляции проницаемости плазматической мембраны клеток, функционировании транспортеров и рецептор-ной передачи сигнала и др. (Владимиров Ю.А., 1972, 2000; Болдырев А.А., 2001; Балаболкин М.И., 2002; Marnett L.J., 2002; Poli G. et al., 2004; Halliwel B., Gutteridge J.M., 2007). При физиологических условиях окислительные процессы находятся под строгим контролем специализированной системы клетки, так называемой эндогенной антиоксидантной системы (АОС), которая обеспечивает сохранение общего равновесия, гомеостаза и стационарного уровня АФК в организме (Pippenger C.E., 1998; Mates J.M., 1999; Владимиров Ю.А., 2000; Болдырев А.А., 2003; Хавинсон В.Х. и др., 2003).
Однако при воздействии внешних неблагоприятных факторов, таких как влияние химических канцерогенов, тяжелых металлов, радиации, ультрафиолетового и лазерного облучения, ксенобиотиков, стресса и др. образование АФК существенно увеличивается (Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И., 1985; Владимиров А.Ю., 2000; Октябрьский О.Н., 2007; Жаркова Л.П., 2010). При определенных условиях свободнорадикальные процессы могут активизироваться настолько, что эндогенная АОС перестает справляться, что приводит к накоплению АФК в клетках. В дальнейшем эти АФК могут взаимодействовать между собой, образуя высокореакционные радикалы, которые также способны окислять клеточные структуры и истощать АОС. При таком развитии событий в организме возникают условия для формирования окислительного стресса, характеризующегося стойким увеличением стационарного уровня АФК. При этом их сигнальная функция сменяется повреждающим действием, направленным на окисление макромолекул клетки (Болдырев А.А., 2003).
В условиях окислительного стресса происходит интенсивное аутоокис-лении ненасыщенных жирных кислот (линоленовой, арахидоновой и др.) фосфолипидов биологических мембран, так называемое перекисное окисле 16 ние липидов (ПОЛ). В норме образование липидных перекисей необходимо, так как через стадию образования перекисей липидов в клетках осуществляется синтез простагландинов, стероидных гормонов, образование желчных кислот из холестерола и т.д. Процесс ПОЛ также необходим для нормальной работы цепи переноса электронов при микросомальном окислении (Суханова Г.А., Серебров В.Ю., 2000). Однако в условиях интенсификации ПОЛ жирные кислоты фосфолипидов окисляются до гидроперекисей, в результате нарушается упаковка мембранных липидов, что ведет к повреждению структуры и проницаемости клеточных мембран. Образование липоперекисей, которые легко подвергаются дальнейшим превращениям, приводит к образованию и накоплению целого ряда более устойчивых вторичных продуктов окисления: альдегидов, кетонов, ряда низкомолекулярных кислот (муравьиной, уксусной, масляной), эпоксисоединений и др. Эти вещества являются токсичными для клетки, приводят к нарушению функций мембран и метаболизма в целом. Перекиси полиненасыщенных жирных кислот, диальдегиды и ряд вторичных продуктов ПОЛ, взаимодействуя с N-концевыми группами аминокислот, входящих в состав белков, образуют основания Шиффа, которые далее приводят к межмолекулярным «сшивкам» (Суханова Г. А., Сереб-ров В.Ю., 2000).
Белки, как и липиды, в условиях окислительного стресса подвержены окислительной модификации. Один из основных типов окислительной модификации белков (ОМБ) – их карбонилирование (Halliwell D.B., Gutteridge J.M.C.,1999). Карбонильные группы могут образовываться при окислительном повреждении аминокислотных остатков, имеющих свободные карбоксильные группы, остатки цистеина, содержащие SH-группы. Но преимущественно подвергаются окислению -аминогруппы и є-аминогруппы лизина, гуанидиновые группы (аргинин), имидазольные (гистидин) и индольные (триптофан). При взаимодействии карбонильных групп (=С=О) с нуклео-фильными аминогруппами (-NHB2B) аминокислот наблюдаются поперечные сшивки (кросс-линкинг) белков, что приводит к образованию высокомолекулярных белковых агрегатов и к повреждению функционирования белков и клеток в целом (Halliwell D.B., Gutteridge J.M.C., 1999; Griffiths H.R., 2000). Другим типом ОМБ является гликозилирование (гликирование) белков – неферментативное взаимодействие глюкозы со свободными аминогруппами белков (Halliwell D.B., Gutteridge J.M.C., 1999). В условиях гипергликемии (в частности, при сахарном диабете) процесс гликирования ускоряется, в результате образуются глиоксаль, метилглиоксаль и 3-дезоксиглюкозон, запускающие процесс окислительного гликозилирования белков с образованием АФК (Phillips S., Thornalley P., 1993; Занозина О.В. и др., 2010).
Таким образом, окислительный стресс, возникающий в организме при повышении стационарного уровня активных форм кислорода, является причиной окислительной модификации белков и липидов. Это неизбежно приводит к нарушению функционирования биомолекул и формированию различных патологических состояний.
Характеристика карнозина и его применение в экспериментальных исследованиях и клинической практике
Этиловый спирт (этанол) не является чужеродным веществом для организма человека, так как в процессе метаболизма ежесуточно в кишечнике человека синтезируется от 1,0 до 1,5 грамм эндогенного алкоголя, его содержание в крови равно приблизительно 0,034 промилле (Неделчева К., 1981, Скакун Н.П. и др., 1985). Известно, что этанол быстро всасывается в кровь через слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта и разносится по всему организму пропорционально содержанию воды. Этанол способен хорошо растворяться как в гидрофильной, так и в гидрофобной средах. Он обладает мембранотропным эффектом в отношении различных мембран нейронов, эритроцитов, миелиновых и митохондриальных мембран, синаптосом, а также искусственных мембран (Goldstein D., Chin J., 1981; Фаращук Н.Ф., 2008). Растворяясь в воде и частично в липидном бислое мембран, молекула этилового спирта внедряется в поверхностную область между полярными группами фосфолипидов. В результате уменьшается плотность упаковки фосфолипидов, увеличивается текучесть мембраны, что облегчает доступ кислорода к двойным связям ненасыщенных жирных кислот, способствуя активации процессов перекисного окисления липидов (Нужный В.П., Огурцов П.П., 2011). По данным литературы длительная интоксикация алкоголем оказывает весьма существенное влияние на процессы мембранного транспорта, на системы трансмембранной передачи информации, на активность мем-бранносвязанных ферментов (Сторожок С.А. и др., 2001).
Этанол в организме человека окисляется тремя путями до ацетальдеги 22 да (Буров Ю.В., Ведерникова Н.Н., 1985; Бабаян Э.А., Гонопольский М.Х., 1987).
Первый путь – под действием алкогольдегидрогеназы (АДГ) при участии кофактора NADP+ P(окисляется 75-90% поступившего этанола). Локализуется АДГ в клетках почти всех органов – почек, эндокринных желез, мозга (Buhler R. et al., 1983), печени (Buhler R. еt al., 1982), желудочно-кишечного тракта (Pestalozzi D.M. et al., 1982) и др. Результаты экспериментальных исследований и клинических наблюдений показали участие АДГ слизистой желудка в метаболизме и детоксикации алкоголя (DiPadova C. еt al., 1987; Seitz H.K., 1997; Lee S.L. et al., 2006; Рожанец В.В., Нужный В.П., 2007). Однако большая часть (95%) этого фермента находится в цитозоле и митохондриях печени. При алкоголизме количество АДГ не увеличивается, то есть АДГ не является индуцируемым ферментом (Андрианова Л.Е., Силуянова С.Н., 2006). При полном блокировании активности АДГ с помощью пиразола метаболизм этанола тормозится на 80-100% (Goldberg L., Rudberg U., 1969).
Второй путь окисления этанола – с помощью цитохром-P450-зависимой микросомальной этанолокисляющей системы (МЭОС) при участии NADPH и ОB2 B(окисляется около 10% этанола) (Lieber C.S., 1994, 1999; French S.W., 1996). МЭОС локализуется на мембранах гладкого цитоплазма-тического ретикулума гепатоцитов. Эта система является универсальной и обеспечивает метаболизм не только этанола, но и, главным образом, лекарственных веществ и других ксенобиотиков. Под воздействием этанола происходит индукция особой изоформы цитохрома-Р450 (Р450-2E1) (Teshke R. еt al., 1977; Thurman R.G., Brentzel H.J., 1977; Lieber C.S., 1988, 1997). Кроме основной реакции, цитохром-Р450 катализирует образование активных форм кислорода, перекиси водорода и супероксидных анионов (Asai H. еt al., 1996), что способствует формированию и поддержанию окислительного стресса.
Третий путь – под действием каталазы в присутствии перекиси водорода (окисляется около 2% этанола). Этот путь является второстепенным. Ката 23 лаза находится в пероксисомах цитоплазмы и митохондрий клеток печени, где и проявляет свою максимальную активность. Каталаза также присутствует и в эритроцитах, меньшая активность ее определяется в ткани мозга, сердце, сыворотке крови (Marklund S.L., 1982). При введении крысам ингибитора каталазы аминотриазола, уровень метаболизма этанола не изменяется, даже если торможение каталазы достигает 90% (Smith M.E., 1961). Считается, что окисление этанола с помощью каталазы не имеет существенного значения, так как лимитируется количеством перекиси водорода (Lieber C.S., DeCarli L.M., 1972). Однако, роль каталазы в окислении этанола до конца не ясна. Микросомальный и каталазный пути окисления являются минорными и включаются в метаболизм этанола при высоких его концентрациях или в условиях подавления активности алкогольдегидрогеназы.
Все пути окисления этанола в организме приводят к образованию одного и того же метаболита – высокотоксичного, высокоактивного ацетальде-гида. Печень является основным органом, где образуется и окисляется аце-тальдегид. Окисляется он двумя ферментами: FAD-зависимой альдегидокси-дазой и NAD+-зависимой ацетальдегиддегидрогеназой (АлДГ) до уксусной кислоты и далее до СОB2 Bи НB2BО. В условиях повышения концентрации аце-тальдегида индуцируется альдегидоксидаза, при этом в ходе реакции помимо уксусной кислоты образуется пероксид водорода и другие АФК, что является еще одним фактором, способствующим окислительному стрессу при хроническом поступлении алкоголя в организм.
Таким образом, формирование окислительного стресса в организме больных алкоголизмом обусловлено многими факторами, в том числе окислительным метаболизмом этанола и ацетальдегида, а также токсическими эффектами побочных продуктов их метаболизма, которые стойко поддерживают состояние ОС при длительной алкоголизации (Bondy S.C., 1992; Cederbaum A.I., 2001; Wu D., Cederbaum A.I., 2003; Бохан Н.А., Прокопьева В.Д., 2004). Хроническая алкогольная интоксикация сопровождается выра 24 женными метаболическими нарушениями, которые становятся причиной поражения всех органов и систем. Согласно многочисленным исследованиям, токсическое действие алкоголя сопровождается широким спектром соматической патологии: алкогольной болезнью печени (Сухарева Г.В., 2003; Сиволап Ю.П., 2012; Панченко Л.Ф. и др., 2013), патологией сердечно-сосудистой системы (Индутный А.В., 2010; Кульбицкий Б.Н. и др., 2011; Аксельрод А.С. и др., 2012; Корякин А.М. и др., 2012; Разводовский Ю.Е., 2013), патологией почек (Тарасова Н.С., 2001), органов дыхания (Найденова Н.Г., Гордеев М.Н., 2002; Joshi P.C., Guidot D.M., 2007), эндокринной системы (Индутный А.В. и др., 2004; Михайлов В.И. и др., 2009; Pietraszek A. еt al., 2010), алкогольной энцефалопатией и полиневропатией (Малев А.Л., 2009; Ангельчева И.О., 2006), нарушением функции иммунной системы (Kronfol Z. et al., 1993; Leevy C.B., Elbeshbeshy H.A., 2005; Ульянова Л.И. и др., 2011). Одной из главных мишеней прямого токсического действия алкоголя и его метаболитов является печень (Levitsky J., Mailliardё M.E., 2004; Абдурахманов Д.Т., 2007; Дашинамжилов Ж.Б., 2011; Сиволап Ю.П., 2012; Панченко Л.Ф. и др., 2013). Поэтому механизмы окислительного повреждения липидов и белков при алкоголизме наиболее подробно изучены на примере токсического алкогольного поражения печени. В патогенезе алкоголь-индуцируемых поражений печени ведущая роль принадлежит усилению свободнорадикального окисления липидов с накоплением продуктов ПОЛ, развитию некрозов печеночных клеток и ослаблению антиоксидантной системы (Caro A.A., Cererbum A.I., 2004; Albano E., 2008). В образование свободных радикалов в печени под воздействием этанола вовлечен не один механизм и не один тип клеток (Панченко Л.Ф. и др., 2013).
Влияние карнозина на уровень карбонилированных белков и ТБК-реактивных продуктов в плазме крови больных алкоголизмом на этапе формирования ремиссии
Большое количество экспериментальных работ посвящено применению карнозина в условиях окислительного стресса различного генеза в модельных экспериментах на животных. Антиоксидантные свойства карнозина были исследованы на модели ПОЛ, индуцированного FeP2+-аскорбатом, в мембранах саркоплазматического ретикулума скелетных мышц лягушки (Дупин А.М. и др., 1984). В этом исследовании было показано, что фрагменты саркоплазма-тического ретикулума теряют свою активность при индукции перекисного окисления, а карнозин препятствует развитию ПОЛ, тем самым сохраняя активность ретикулума. Этот эффект имел прямую концентрационную зависимость в диапазоне 10–50 мМ дипептида.
Известно, что ионизирующая радиация является мощным повреждающим фактором, провоцирующим образование липоперекисных продуктов, которые приводят к нарушению мембранных липидов и белок-липидных взаимодействий. Севериным С.Е. с соавт. было показано, что карнозин способен эффективно повышать выживаемость и среднюю продолжительность жизни животных, подвергавшихся -облучению в сублетальных дозах. Было показано, что смертность крыс снижалась почти втрое, а средняя продолжительность жизни увеличивалась вдвое при приеме карнозина накануне облучения (100 мг/кг) и после облучения (50 мг/кг) в течение 30 суток (Северин С.Е. и др., 1990). Известно, что облучение может вызывать рост опухоли. Немецкими учеными было показано, что карнозин (1 мг/мл в питьевой воде) способен ингибировать пролиферацию опухолевых клеток у крыс (Horii Y. et al., 2012), подавлять выработку АТФ в злокачественной глиоме (Renner C. et al., 2010).
Карнозин оказался эффективным и при защите организма от старения. Содержание мышей линии SAMP1 (быстростареющие) на диете, обогащенной карнозином, замедляет развитие старческих изменений, повышает на 20% среднюю продолжительность жизни животных, снижает уровень продуктов ПОЛ, повышает активность СОД, то есть усиливает антиоксидантную защиту организма. Наряду с этим отмечается хорошее физиологическое состояние слизистой глаз и волосяного покрова животных, более спокойное их поведение по сравнению с контрольными мышами, что свидетельствует о более высоких показателях их жизнеспособности (Юнева М.О., 2001; Ство-линский С.Л., 2006). Полученные результаты указывают на способность кар-нозина оказывать геропротекторное действие за счет повышения антиоксидантного статуса организма, способствующего восстановлению окислительного гомеостаза. Омолаживающий эффект карнозина показан в другой работе на культуре клеток. Добавление карнозина в концентрациях 20 - 50 мМ в среду, где культивировали фибробласты человека, приводит к замедлению клеточного старения, а добавление карнозина в среду к стареющим клеткам приводит к омолаживающему эффекту (Hipkiss A.R., Brownson C., 2000; Hipkiss A.R. et al., 2001, 2002, 2009; Boldyrev A.A. et al., 2010).
Гепатопротекторное действие карнозина (10 мг/кг в течение 3-х дней после и за день до опыта) было исследовано в отношении острого токсического поражения печени у мышей, индуцированного кадмием (Fouad A.A. et al., 2009), а также при воздействии ацетаминофена (Yan S.L. et al., 2009), где карнозин добавляли в питьевую воду 1 или 2 г/л в течение 4 недель. Было отмечено, что карнозин значительно понижает повышенный уровень ами-нотрансфераз сыворотки крови, подавляет перекисное окисление липидов, снижает содержание АФК, восстанавливает дефицит глутатионпероксидазы, каталазы и СОД в ткани печени. Аналогичный защитный эффект карнозина (250 мг/кг за 30 мин до эпизода) был показан при повреждении печени у крыс ишемией в течение 60 минут с последующей реперфузией в течение 2 часов (Fouad A.A. et al., 2007). Эти результаты были подтверждены свето- и электронно-микроскопическими исследованиями ткани печени.
На модели острого токсического гепатита, вызванного многократным подкожным введением CCIB4B, показано, что у крыс, получавших карнозин (100 мг/кг ежедневно, внутрибрюшинно, параллельно с инъекциями CCIB4B и после их прекращения), достоверно уменьшается число очагов некроза и снижается интенсивность дистрофических изменений, усиливаются регене-рационные процессы печени (Nagai K. et al., 1990a).
Окислительный стресс губителен для всех клеток, но наиболее опасен для нервной ткани, особенно чувствительной к повреждающему воздействию свободных радикалов вследствие высокой интенсивности обменных процессов, отсутствием в ней избыточных запасов энергии и высокого содержания субстратов перекисного окисления (полиненасыщенных жирных кислот) (Федорова Т.Н., 2004). Эти обстоятельства обусловили интенсивное изучение способности карнозина защищать клетки мозга от окислительного стресса.
Было проведено изучение действия карнозина при его введении перед и после ишемии, вызванной окклюзией магистральных артерий головы у крыс и монгольских песчанок (Федорова Т.Н. и др., 2002; Stvolinskii S.L. et al., 2003; Федорова Т.Н., 2004; Dobrota D. et al., 2005; Стволинский С.Л., 2006). Оказалось, что во всех случаях введение карнозина перед ишемией, независимо от длительности (за 20 или 30 мин до операции), дозы (100 мг/кг, 170 мг/кг, 200 мг/кг, 250 мг/кг) и способа введения (перорально или внутрибрю-шинно), обеспечивает до 83% выживаемости у животных, тогда как, в контрольной группе без карнозина 45%. У тех животных, у которых проявляется неврологическая симптоматика, введение карнозина вдвое снижает смертность. У животных с предварительным введением карнозина, через 24 часа наблюдается восстановление мозгового кровотока до 85-120% от исходной величины, при этом полное восстановление отмечается у крыс без неврологической симптоматики (Стволинский С.Л., 2006). Карнозин эффективно препятствует накоплению лактата в очаге ишемического повреждения, который является существенным патогенетическим фактором ишемии. В других экспериментах у животных в условиях ишемии наблюдается отчетливое подавление активности Na/K-АТФазы мозга и гибель животных до 67%, но при введении карнозина гибель животных снижается до 30%, а снижения активности Na/K-АТФазы не происходит (Стволинский С.Л., 2006). О способности карнозина защищать Na/K-АТФазу от воздействия кислородных радикалов в условиях in vitro сообщалось ранее в другой работе (Boldyrev A.A., 1998). В экспериментах с ишемическим повреждением мозга у животных были получены данные, которые доказали, что для обеспечения эффективной антиок-сидантной защиты мозга с помощью карнозина необходимо начинать его применение в ранние сроки постишемического периода и продолжать курсовую терапию до стабилизации перекисных процессов (Fedorova T.N. et al., 2004; Dobrota D. еt al., 2005; Стволинский С.Л., 2006).
Влияние карнозина на окислительную модификацию белков и липидов плазмы крови в присутствии ацетальдегида in vitro
При оценке влияния ацетальдегида на липиды плазмы крови здоровых лиц оказалось, что АА в концентрации 0,01% в 0 часов инкубации вызывает существенное окисление липидов, о чем говорят высокие показатели ТБК-реактивных продуктов (Таблица 9). Однако, в отличие от эффекта этанола на окислительный процесс липидов, в пробах с ацетальдегидом уровень ТБК-РП через час инкубации достоверно снижается и дальнейшая инкубация этой пробы до 3-х часов не приводит к существенному изменению уровня ТБК-РП (Таблица 9).
Из литературы известно, что основной продукт ПОЛ – малоновый ди-альдегид. Он очень легко взаимодействует с окисленными белками с образованием гибридных аддуктов, которые могут состоять из различных комбинаций малонового диальдегида, ацетальдегида и белковых комплексов (Setshedi M. et al., 2010; Mabuchi R. et al., 2012). Можно предположить, что в наших экспериментах при добавлении ацетальдегида к крови образуются такие гибридные аддукты. Эти аддукты, вероятно, не определяются с помощью используемой нами методики определения продуктов ПОЛ, поэтому мы наблюдаем снижение ТБК-реактивных продуктов через час инкубации крови с ацетальдегидом (Таблица 9). Процесс образования гибридных аддуктов происходит довольно быстро, а далее наступает стабилизация, так как известно, что гибридные аддукты являются довольно стабильными соединениями (Mabuchi R. et al., 2012). Это обстоятельство позволяет объяснить наши результаты, которые показали, что через 3 часа инкубации крови в присутствии ацетальдегида уровень ТБК-реактивных продуктов в пробах остается практически на том же уровне, что и через 1 час инкубации.
Неожиданные результаты были получены при определении ТБК-реактивных продуктов после добавления 5 мМ карнозина в пробы с ацеталь-дегидом (Таблица 9). Сразу после добавления карнозина в нулевой временной точке существенных изменений в содержание ТБК-реактивных продуктах не произошло. Далее, через 1 час инкубации с карнозином, наметилась тенденция к снижению уровня ТБК-реактивных продуктов, однако это снижение не было достоверным. В то же время, при сравнении показателей ТБК-реактивных продуктов через 1 час с ацетальдегидом в присутствии карнозина и без него, оказалось, что в пробах с карнозином уровень ТБК-реактивных продуктов был достоверно выше. Вероятно, карнозин в это время препятствовал образованию гибридных аддуктов, то есть «маскировка» продуктов ПОЛ в присутствии карнозина не была столь выраженной, как без него, что и приводило к увеличению определяемых нами ТБК-реактивных продуктов в пробах с карнозином. Через 3 часа инкубации в пробах с карнозином произошло достоверное снижение ТБК-РП относительно 3-х часовой пробы с ацетальдегидом без карнозина (Таблица 9). Эти результаты подтверждают защиту липидов от окисления под действием ацетальдегида карнозином.
Экспериментальные исследования in vitro показали способность как этанола, так и ацетальдегида индуцировать окислительную модификацию как белков, так и липидов плазмы крови человека. При этом, если окисление белков происходило сразу после добавления этанола, а затем уровень карбони-лов не изменялся, то процесс модификации липидов после добавления этанола продолжался на протяжении всего эксперимента (в нашем случае в течение 3-х часов). Ацетальдегид проявлял более сильный окислительный эф 102 фект, чем этанол, как на белки, так и на липиды. Карнозин эффективно защищал белки и липиды от окисления, индуцированного как этанолом, так и ацетальдегидом.
А. Хипкисом и его коллегами был предложен молекулярный механизм защиты карнозином белков от окислительной модифицикации, индуцированной альдегидами (Hipkiss A.R., Chana H., 1998; Hipkiss A.R., 2000). Защиту карнозином липидов от окисления изучали другие авторы. Они доказали, что этот дипептид способен воздействовать на различные стадии процесса перекисного окисления липидов – от нейтрализации АФК, до взаимодействия с молекулярными продуктами свободнорадикального окисления (Boldyrev A.A. et al., 1988; Швачко А.Г. и др., 1990; Chan K.M. et al., 1994).
Учитывая приведенные данные литературы и полученные нами результаты, мы предложили гипотетическую схему, отражающую защиту карнози-ном белков и липидов плазмы крови от окисления, индуцированного этанолом или ацетальдегидом (Рисунок 4). За основу мы взяли схему защиты кар-нозином белков от окисления их под действием альдегидов, опубликованную Хипкисом А. в интернете (file://localhost).
Исходя из результатов экспериментов, в которых овальбумин обрабатывали метилглиоксалем (для индукции образования карбонильных групп в молекулах белка) с последующей инкубацией модифицированного белка с карнозином, был сделан вывод, что аминогруппа карнозина способна взаимодействовать с карбонильной группой белка с образованием протеин-карбонил-карнозинового аддукта. Исследователи назвали этот процесс «кар-нозинилированием» (присоединение карнозина к карбонильной группе белка). В дальнейшем такие белки могут восстанавливаться при взаимодействии со второй молекулой карнозина, либо подвергаться протеолизу (Hipkiss A.R., Chana H., 1998; Hipkiss A.R., 2000). Было также доказано, что обработка ме-тилглиоксалем, малоновым диальдегидом или гипохлоритом разных белков: овальбумина, кристаллина и бычьего сывороточного альбумина - вызывала образование не только карбонильных групп в белках, но и приводила к появлению белковых агрегатов (процессу кросс-линкинга, «сшивке» белков). Карнозин в этих исследованиях эффективно ингибировал как карбонилиро-вание, так и кросс-линкинг белков (Hipkiss A.R., Chana H., 1998; Hipkiss A.R. et al., 1998). Авторы подтвердили, что карнозин способен реагировать с низкомолекулярными альдегидами и кетонами (малоновым диальдегидом, ме-тилглиоксалем, 4-гидрокси-2-ноненалем, ацетальдегидом и др.) в результате взаимодействия его аминогруппы с карбонильными группами. Позже и другие авторы подтвердили способность дипептида карнозина проявлять анти-оксидантные, антигликирующие и антикросслинкинговые свойства (Liu Y. et al., 2003; Laura J. Hobart et al., 2004; Reddy V.P. et al., 2005; Tyulina O.V. et al., 2006; Guiotto A. et al., 2007; Zhu X. et al., 2009; Cheng J. et al., 2011).
Полученные нами данные о защите карнозином белков плазмы крови, подвергшихся окислительной модификации ацетальдегидом, хорошо согласуются с приведенными литературными данными. Более того, результаты наших исследований позволяют сделать заключение, что механизм защиты карнозином липидов от окисления, индуцированного ацетальдегидом, может быть аналогичен механизму защиты белков. Это предположение основано на том, что при перекисном окислении липидов липопротеинов плазмы крови основным субстратом окисления являются полиненасыщенные жирные кислоты (Меньщикова Е.Б. и др., 2008). Их окисление приводит к значительному повышению целого ряда как неустойчивых, так и устойчивых токсических продуктов – гидроперекисей, альдегидов, кетонов и т.д. (Суханова Г.А., Серебров В.Ю., 2000). Карнозин, благодаря своим свойствам, способен нейтрализовать эти продукты, взаимодействуя с ними с образованием «карнозилированных» производных – нетоксичных аддуктов.
