Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Общая клиническая характеристика псориаза и атеросклероза 8
1.2. Медиаторы воспаления в развитии атеросклероза и псориаза 14
1.3. Матриксные металлопротеиназы 21
1.3.1 Характеристика матриксных металлопротеиназ 21
1.3.2 Члены семейства матриксных металлопротеиназ 22
1.3.3 Патофизиология металлопротеиназ и их роль в патогенезе псориаза и атеросклероза 25
1.4. Интерлейкины в патогенезе псориаза и атеросклероза 29
1.5. Статины в терапии атеросклероза и псориаза 31
ГЛАВА 2. Клиническая характеристика больных и методы исследования 37
2.1. Общая характеристика обследованных пациентов 37
2.2. Препарат, применяемый для лечения 42
2.3. Биоинформационный анализ и базы данных 44
2.4.Мето дика гомогенизации и приготовления образцов 45
2.5. Приготовление серии стандартов для проведения RT-PCR 48
2.6. Подбор праймеров и оптимизация условий ПНР 49
2.7. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 49
2.8. Иммуногистохимическое исследование сосудов, пораженных атеросклеротическим процессом, и кожи пациентов, страдающих псориазом 51
2.9. Иммуноферментный анализ 54
2.10. Статистическая обработка данных 57
ГЛАВА 3. Результаты исследования 58
3.1. Результаты обследования пациентов, страдающих псориатическим поражением кожи, и пациентов, страдающих атеросклеротическим поражением сосудов, до начала лечения аторвастатином 58
3.2. Результаты биоинформационного анализа 62
3.3. Анализ уровней экспрессии генов, кодирующих интерлейкин IL-17A и матриксные металлопротеиназы ММР-2, ММР-9, ММР-12 71
3.4. Результаты исследования исходного уровня IL-17A и ММР-12 в сыворотке крови обследованных пациентов 81
3.5. Динамика лабораторных показателей при контрольном обследовании 82
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 93
Выводы 98
Обозначения и сокращения 100
Список литературы 102
- Патофизиология металлопротеиназ и их роль в патогенезе псориаза и атеросклероза
- Приготовление серии стандартов для проведения RT-PCR
- Результаты обследования пациентов, страдающих псориатическим поражением кожи, и пациентов, страдающих атеросклеротическим поражением сосудов, до начала лечения аторвастатином
- Динамика лабораторных показателей при контрольном обследовании
Введение к работе
Актуальность исследования. Псориаз – эритематозно-сквамозный дерматоз,
мультифакторной природы с доминирующим значением генетических факторов в развитии. Характеризуется гиперпролиферацией эпидермальных клеток, нарушением кератинизации, воспалительной реакцией в дерме, изменением в различных органах и системах. Больные псориазом составляют 12-15% от всех пациентов, страдающих дерматологическими заболеваниями.
Несмотря на наличие множества теорий, касающихся возникновения, развития, прогрессирования данного заболевания, вопрос его лечения остается открытым. В настоящее время исследование патогенеза псориаза и разработка методов его лечения направлены на создание препаратов, предназначенных для коррекции молекулярных и генетических нарушений, возникающих при этом заболевании. Существующие сегодня схемы терапии направлены скорее на достижение ремиссии заболевания, чем на его полное излечение.
Данные различных исследований свидетельствуют о возможной связи псориаза и атеросклероза. В частности, появилось большое количество исследований, свидетельствующих о том, что псориаз может являться одним из предрасполагающих факторов развития атеросклероза (Gonzalez-Juanatey C., 2009)
Атеросклероз – это хроническое, прогрессирующее, воспалительное заболевание стенок сосудов мышечного и мышечно-эластического типов с длительным бессимптомным течением. В развитых странах атеросклероз является одной из основных причин смерти. По данным литературы, ведущая роль в развитии как атеросклеротического поражения стенок сосудов (Libby, et al., 2009), так и псориатического процесса, принадлежит воспалению (Davidovici, et al., 2010).
Для коррекции нарушений липидного обмена, являющихся одним из ключевых факторов развития атеросклеротического процесса, широко применяются препараты из группы статинов (Miyata, et al., 2013; Шевченко А. О., 2003). Статины обладают противовоспалительной активностью и оказывают ингибирующее действие на продукцию ряда провоспалительных цитокинов (Rajpara, et al., 2010). В связи с этим большой интерес представляет возможность применения этой группы препаратов в терапии хронических воспалительных заболеваний.
Хронические воспалительные заболевания, к которым относятся и псориаз, и атеросклероз, хотя и различаются по патофизиологии, тем не менее, обладают важными общими чертами, такими как хронический характер и структурная перестройка пораженных органов и тканей. По данным многочисленных независимых исследований, области генетического сцепления псориаза и атеросклероза часто перекрываются.
Учитывая общие черты, присущие псориазу и атеросклерозу, представляется
целесообразным изучить молекулярно-генетические нарушения, лежащие в основе развития этих заболеваний.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось обоснование эффективности фармакотерапии аторвастатином больных псориазом и больных атеросклерозом с применением общих молекулярных маркеров.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
Изучить особенности течения псориаза в исследуемых группах больных.
-
Выявить с помощью биоинформационных методов сигнальные пути, общие для псориаза и атеросклероза, и определить уровень экспрессии и локализацию накопления белковых продуктов ключевых генов.
-
Изучить изменение клинического статуса больных псориазом и больных атеросклерозом на фоне применения аторвастатина.
-
Изучить изменение уровней IL-17A и MMP-12 у больных псориазом и больных атеросклерозом на фоне лечения аторвастатином.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Впервые рассмотрено влияние аторвастатина на изменение уровней интерлекина-17А (IL-17A) и матриксной металлопротеиназы-12 (MMP-12) в сыворотке крови больных псориазом и атеросклерозом. Показаны возможности лечения при сочетании псориатического и атеросклеротического процессов с применением аторвастатина. Разработан алгоритм обследования больных псориазом на наличие атеросклеротического поражения стенок сосудов. Показана необходимость более тщательного обследования больных псориазом, на предмет выявления поражения сердечно-сосудистой системы. Выявлены общие для этих заболеваний гены-мишени. Полученные результаты могут быть использованы в практическом здравоохранении для оптимизации существующих схем терапии и ранней диагностики поражений сердечно-сосудистой системы у больных псориазом.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Аторвастатин эффективен в качестве препарата для лечения пациентов, страдающих псориатическим поражением кожных покровов и пациентов, страдающих атеросклеротическим поражением сосудов.
-
Интерлейкин IL-17А и матриксные металлопротеиназы MMP-2,9,12, являются факторами, влияющими на развитие как псориаза, так и атеросклероза.
-
Накопление белков IL-17A и MMP-12 в коже больных псориазом и интиме стенок сосудов при атеросклерозе свидетельствует об их роли в развитии этих патологий.
4. Уровень экспрессии генов IL-17A, MMP-12 в коже, пораженной псориатическим процессом, и интиме пораженных атеросклерозом сосудов, во много раз превышает данные показатели в непораженных участках.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты работы внедрены в практику ГКБ №14 им. В.Г.Короленко и филиала
«Вешняковский» Московского научно-практического центра дерматовенерологии и
косметологии ДЗ г. Москвы.
Апробация результатов работы. Материалы работы были доложены и обсуждены на: 17
Конгрессе Европейской академии дерматологии и венерологии (Париж, 2008), Всероссийской
научно-практической конференции «Артериальная гипертония: новые аспекты патогенеза.
Возрастные и гендерные особенности» (Иваново, 2008 г.), II Всероссийском научно-
образовательном форуме «Кардиология 2009» (Москва, 2009 г), VI Съезде общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010 г.), Международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» (Минск, 2012 г.), II Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы медицины» (Баку, 2013 г.).
Конкурсная поддержка работы. Диссертационная работа выполнена в Центре
теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН. Часть экспериментальной
работы проводилась на базе Лаборатории функциональной геномики Института общей
генетики им. Н.И. Вавилова РАН в соответствии с планами научно-исследовательских работ
института в рамках Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», ФЦП
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-
технологического комплекса России» ГК 16.512.11.2049 и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» ГК П1309.
Публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 14 печатных работах, в том числе в 7 статьях в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией РФ для опубликования результатов кандидатских и докторских диссертаций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 121 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Включает 15 таблиц, 24 рисунка. Список цитируемых источников литературы включает 162 наименования.
Патофизиология металлопротеиназ и их роль в патогенезе псориаза и атеросклероза
Участие ММР в широком спектре биологических процессов, связанных в основном, с деградацией компонентов внеклеточного матрикса, предполагает существование баланса между ММР и их естественными ингибиторами (TIMP). Нарушение баланса между ними приводит к возникновению патологий, в частности, к развитию различных сосудистых заболеваний, таких как аневризма аорты, варикозное расширение вен, атеросклероз и гипертония [121]. Например, при атеросклерозе показано, что ММР активно участвуют на различных стадиях его развития. Активация ММР приводит к изменению структуры атеросклеротической бляшки и может привести к ее разрыву. Разрушение атеросклеротической бляшки происходит при воздействии протеиназ на ее фиброзную покрышку, обращенную в просвет сосуда, что может привести к развитию острого инфаркта миокарда и внезапной сердечной смерти [140]. Экстрацеллюлярный матрикс, продуцирующийся в основном гладкомышечными клетками синтетического типа, расположенными в интиме артерий, включает в себя коллаген I, III, IV, V, VIII типов и ламинин. Коллаген I и III типов синтезируется и локализуется в интиме и фиброзных бляшках, в то время как краевые участки бляшки содержат большое количество проколлаген-коллаген синтезирующх клеток I типа [11; 94; 163].
Металлопротеиназы принимают участие в ремоделировании миокарда при инфаркте, что может привести к дилатационной кардиомиопатии. Процесс ремоделирования желудочка после инфаркта миокарда или вирусного повреждения также происходит под воздействием ММР, которые разрушают каркас из коллагена и эластина, приводя к гипертрофии и дилатации желудочка. По мере того как тяжесть и спектр сердечно-сосудистых заболеваний меняется от острых состояний, таких как инфаркт миокарда, внезапная сердечная смерть, к хроническим заболеваниям (атеросклероз сосудов), ремоделирование миокарда и воспаление выходят на первое место. Ремоделирование ткани - двустадийный процесс: клеточный компонент изменения структуры и изменение в структуре матрикса. Внеклеточный матрикс в настоящее время рассматривается как непосредственный участник функции органа и изменения его структуры, а матриксные металлопротеиназы - как медиаторы его ремоделирования.
Последние исследования указывают на роль ММР в этом процессе и на потенциальные возможности их использования в диагностических и терапевтических целях. В настоящее время матриксные металлопротеиназы рассматриваются как потенциальные биомаркеры развития кардиологических осложнений при разрушении атеросклеротических бляшек. Металлопротеиназы рассматривают как точку воздействия для коррекции изменений при атеросклеротическом поражении коронарных сосудов. Так, при увеличении экспрессии ММР-12 происходит моноцитарная инфильтрация сосудистой стенки, приводящая к разрыву внутренней стенки эластического слоя и ускорению атеросклеретического процесса [84; 102].
В свою очередь, структурная целостность бляшек также зависит от баланса между процессами синтеза и разрушения внеклеточного матрикса, который, в основном, регулируется через взаимодействие ММР и с их ингибиторами (TIMP). Так, было показано, что в бляшках, целостность которых была нарушена в комплексе MMP-9/TIMP- 1, нарушался баланс уровня экспрессии в сторону увеличения экспрессии ММР-9, по сравнению с бляшками, которые не подверглись разрушению. При этом наблюдалось снижение уровня TFPI-2 (Tissue factor pathway ingibitor) [63]. Таким образом, чрезвычайно высокая экспрессия ММР приводит к разрушению артериального внеклеточного матрикса, что является причиной отрыва бляшки, приводящей в большинстве случаев к инфаркту миокарда [78].
Уровень экспрессии мРНК ММР-1,3,9 и TIMP-1 значительно апрегулирован в материале бляшек сонной артерии, тогда как уровень экспрессии TFPI-2 был уменьшен. Частичное апрегулирование ММР-9 и разбалансировка экспрессии MMP9/TIMP-1 могут играть кардинальную роль в разрушении бляшки.
В процессе развития многих заболеваний был выявлен повышенный уровень экспрессии некоторых ММР. Наиболее исследованными в этом отношении оказались онкологические заболевания, сосудистые заболевания и артриты. При различных видах онкологических заболеваний были оверэкспрессированы ММР-1, 2, 3, 7, 9, 10, 11, 13 и 14 [71]. ММР могут способствовать росту опухоли не только путем деградации внеклеточного матрикса, но и благодаря выходу изолированных ростовых факторов [108]. Так, ММР-9 мобилизует VEGF из внеклеточного матрикса и расщепляет коллаген IV типа, образуя ангиогенный ингибитор - тамстатин [63].
В биологии кожи ММР вовлечены в ремоделирование воспаленного матрикса, образование новых сосудов, заживление ран и злокачественное перерождение [139]. Псориаз гистологически характеризуется гиперпролиферацией кератиноцитов, инфильтрацией воспалительными клетками, неоангиогенезом, дилятациеи сосудов кожи и продукцией цитокинов, таких как TNF-a, IL-lb, TGF-a и INF-g так же регуляцией транскрипции ММР. Многие из этих факторов так же принимают участие в заживлении ран кожи путем четкой регуляции деятельности ММР [22; 36]. Многие цитокины или факторы роста, гиперпродукция которых отмечается при псориазе (TNF-a, IL-1, INF-g, IL-6, IL-8, VEGF, TGF-a) также могут регулировать продукцию ММР.
Стромелизин-1 (ММР-3) и 2 (ММР-10), матрилизин (ММР-7) и металлоэластаза (ММР-12) часто объединяют в подгруппу стромелизина по их структуре и субстратспецифичности. ММР-3 и ММР-10 могут экспрессироваться эпителиальными клетками. ММР-3 разрушает фибронектин и тенасцин, уровень которых значительно повышен в коже больных псориазом [23].
Элемент подгруппы стромелизинов - ММР-12, наиболее активная ММР против эластина [131; 162]. Она также может нарушать структуру фибронектина, коллагена 4 типа, ламинина-1, а так же активировать TNF-a [27; 56]. Предыдущие исследования показали, что макрофаги - основной источник ММР-12.
Нейтрофилы и макрофаги являются одними из важнейших клеток, принимающих участие в образовании псориатического инфильтрата. Активированные нейтрофилы способны влиять не только на рост и дифференцировку кератиноцитов, но и активировать Т-клетки [144]. Экспрессия матриксных металлопротеиназ в основном регулируется на уровне транскрипции, поэтому уровни ММР хорошо коррелируют с уровнем матриксной РНК [101; 143]. Согласно одному из исследований mRNAMMP-3 была однаружена в 19% образцов кожи с проявлениями атеросклероза [139], amRNAMMP-12 - в 77% случаев. Достоверное увеличение уровня экспрессии данной металлопротииназы отмечено во всех сайтах воспаления. В данном исследовании показано, что ММР-12 позитивными клетками в данном случае являются макрофаги. Отмечалось, что ММР-3 и ММР-12 не экспрессируются в здоровой коже [29; 66].
Экспрессия TIMP-1 отмечена в воспалительных инфильтратах и эндотелиальных клетках в 75% случаев. Наиболее четкие данные получены у пациентов, которые местно принимают кортикостероиды. Изменение уровня экспрессии TIMP-3 отмечено в 50% образцов, при этом также наблюдалось изменение уровня экспрессии в образцах здоровой кожи, периваскулярной строме сосудов и волосяных фолликулах [13]. TIMP-1 экспрессируется в здоровой коже отдельными фибробластами [45].
Приготовление серии стандартов для проведения RT-PCR
Лигирование в Т-вектор pALA плазмидной ДНК. Для приготовления стандартов Real Time PCR продукты амплификации лигировали в Т-вектор pAL-ТА (Евроген) (рисунокб). Лигирование Т-вектора проводили с продуктом полимеразной цепной реакции. Лигирование проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл следующего состава: 0,5 мкл Т-вектор; ПЦР-продукт 10 мкл; буфер 2 мкл; 1 мкл Т4 ДНК лигаза; 6,5 мкл ddH20. В контрольную пробу вместо ПЦР-продукта добавляли то же количество бидистиллированной воды. Далее полученную смесь инкубировали при ікомн в течение 1 часа.
Получение компетентных клеток E.coli. Ночную культуру клеток 50 мкл. E.coli (бактериальный штамм XLl-Blue ("Stratagene", США): recAl endAl gyrA96 thi-l hsdRll supE44 relAl lac [F proAB lacPZ&M\5 TnlO(TetR)]) обновляли в 5мл свежей LB-среды (1:100) с 5 мкл Tet (тетрациклин), выращивали при 37С около 1,5часа. Переносили на 10 мин на лед, далее разливали в стерильные пробирки Eppendorf ( 1,5мл), центрифугировали 30 сек при 13400 об/мин, надосадочную жидкость сливали, добавляли 350 мкл 0,1 М MgCb, переносили на 15мин на лед, центрифугировали 30 сек при 13400 об/мин, убирали супернатант. Далее добавляли 350 мкл 0,1 М СаСЬ., держали 40 мин на льду и затем центрифугировали 30 сек при 13400 об/мин, тщательно отбирали супернатант, добавляли 200 мкл 0,1 М СаСЬ, перемешивали встряхиванием. Все вышеперечисленные процедуры проводили в стерильных условиях.
Трансформация клеток E.coli. К полученным компетентным клеткам E.coli добавляли 10 мкл плазмидной ДНК, перемешивали, переносили на 30 мин на лед, далее инкубировали 2 мин при 42С, снова оставляли на 5 мин на льду. Затем добавляли 1мл свежей LB-среды, инкубировали в термостате 1 час при 37С, при этом встряхивали каждые 15 мин. Далее центрифугировали 45 сек при 13400 rpm, сливали надосадочную жидкость и ресуспендировали осадок. Полученную взвесь рассевали на чашки Петри с селективной средой (твердая LB-среда: Юг бактотриптон, 5г дрожжевого экстракта, 5г NaCl, 15г бактоагар на 1000мл; 4мкл IPTG; 40мкл X-Gal; 25мкл Amp; 25мкл Tet) и оставляли в термостате при 37С. Далее методом бело-синей селекции отбирали колонии со вставкой (белые колонии) и наращивали их при 37С.
Выделение плазмидной ДНК. Культуру клеток E.coli разливали по пробиркам Eppendorf (1,5мл), центрифугировали 30 мин, супернатант сливали и добавляли 200мкл буфера I (50тМ глюкоза, 25тМ Tris НС1, 20тМ EDTA) и Юмкл RNAse А, тщательно перемешивали (Vortex). Далее вносили 400мкл буфера II (1% SDS, 0,2М NaOH, Н20), держали 5 мин на льду, после чего добавляли ЗбОмкл АсКНЦ и снова переносили на 10 мин на лед. Добавляли 150мкл хлороформа, центрифугировали 2 мин при 13000 rpm, далее отбирали водную (верхнюю) фазу и переносили в свежую пробирку. ДНК переосаждали изопропанолом бООмкл (0,6 V), центрифугировали 6 мин при 13000 rpm. Осадок промывали в 500мкл 70% С2Н5ОН (3 раза; ц/ф по 5 мин), просушили в течение 2 мин и растворяли в 50 мкл ddE O.
Концентрацию плазмиды измеряли на спектрофотометре Eppendorf. В качестве стандартов использовали серию из шести десятикратных разбавлений (10, 10"3, 10"4, 10"5, 10"6, 10"7).
Праймеры к мРНК генов подобраны нами с помощью программ "Beacon Designer 7", "Oligo 6" и "Vector NTI Advance 10". Температуру отжига для каждой пары праймеров, использованной в работе, подбирали опытным путем, принимая за исходную - температуру, рассчитанную с использованием программы "OligoCalculator". При отработке условий ПЦР в качестве матрицы использовалась геномная ДНК человека и тотальная кДНК человека.
Realime PCR или ПЦР-РВ - метод, который дает возможность выполнять подсчет продуктов амплификации в процессе исследования и выполнять отслеживание хода получения копий исходного материала. Определение результатов амплификации выполнялось в растворе за счет гибридизации продукта специфичным олигонуклеотидным зондом, содержащим флуоресцентную метку.
Типы ПЦР-РВ отличаются способами создания флуоресценции. Два основных принципа основаны на:
- применении интеркалирующих флуоресцентных агентов, флуоресценция которых усиливается при связывании с двухцепочечной ДНК,
- использовании олигонуклеотидных проб комплементарных участку PCR-продукта, которые содержат флуоресцентныеметки.
В работе применялись меченые олигонуклеотидные пробы, в частности TaqMan. Для реакции использовали референсный краситель ROX (Синтол) (2,5-х реакционная смесь). Пробы и прайм еры произведены компанией «ДНК-Синтез» (Таблица 5).
Результаты обследования пациентов, страдающих псориатическим поражением кожи, и пациентов, страдающих атеросклеротическим поражением сосудов, до начала лечения аторвастатином
На первом этапе исследований пациенты прошли комплексное обследование, которое включало в себя сбор жалоб, анамнеза, оценку биохимических показателей крови пациентов, определение индекса PASI, определение показателей липидного спектра сыворотки крови, определение показателей уровня цитокинов.
Результаты общего анализа крови и общего анализа мочи пациентов.
У пациентов всех групп на первом этапе исследований проводили определение показателей общего анализа крови. Полученные результаты, свидетельствуют об отсутствии статистически значительных изменений показателей (таблица 6).
Обращает на себя внимание незначительное увеличение количества лейкоцитов и повышение СОЭ как у пациентов с псориатическим поражением кожных покровов, так и при атеросклеротическом поражении стенок сосудов. Эти показатели находятся на верхней границе нормы, что может свидетельствовать о наличии у пациентов текущего воспалительного процесса и не противоречит данным литературы об изменениях, происходящих в крови при данных заболеваниях.
В ходе обследования у пациентов проводили определение показателей общего анализа мочи. Патологических изменений в моче обнаружено не было, что свидетельствовало об отсутствии у пациентов нарушений со стороны почек.
Как видно из представленных результатов лабораторного обследования, до лечения во всех группах обследуемых пациентов не выявлено значительных отклонений показателей.
Результаты исследования исходного биохимического профиля пациентов.
Руководствуясь данными многочисленных исследований об изменении липидного обмена как при псориазе [149], так и при атеросклерозе [6; 125], в каждой группе у пациентов определяли основные показатели обмена липидов сыворотки крови. Результаты исходного исследования липидного спектра пациентов представлены в таблице 7.
Анализ липидного профиля сыворотки крови, полученной от пациентов, страдающих псориатическим поражением кожных покровов (группа I), показал повышение уровня общего холестерина до 7,4±0,3 ммоль/л, триглицеридов до 2,8±0,1 ммоль/л, ЛПВП до 0,5±0,2 ммоль/л. В группе II уровни общего холестерина, триглицеридов, ЛПВП составили 7,5±0,3 ммоль/л, 2,9±0,1 ммоль/л, 0,7±0,2 ммоль/л, соответственно. Полученные данные свидетельствуют об изменении липидного профиля у больных псориазом.
В группе пациентов с тяжелым атеросклеротическим поражением стенок артерий (группа III) уровень общего холестерина (7,9±0,3 ммоль/л) и триглицеридов (3,4±0,1 ммоль/л) превысил верхнюю границу нормы, а уровень ЛПВП (0,4±0,1 ммоль/л) был ниже референсного значения.
Полученные результаты не противоречат выводам ранее опубликованных исследований, свидетельствующим о нарушении липидного обмена при атеросклерозе. При обследовании условно здоровых доноров (группа IV) отклонений в значениях показателей липидного профиля не выявлено, равно как и не обнаружено визуальных элементов, свидетельствующих о поражении кожных покровов.
Обследование пациентов, страдающих псориатическим поражением кожных покровов из группы I и II, показало значительное изменение индекса PASI (значения составили 15,5±0,9 и 15,8±1,2, соответственно). Дерматологическое обследование групп пациентов III и IV не выявило изменений. Данные приведены в таблице 8.
Отсутствие у пациентов с псориатическим поражением кожных покровов отклонений со стороны печеночных ферментов свидетельствует об отсутствии у них патологических изменений со стороны печени, следовательно, применение аторвастатина у этой группы пациентов не противопоказано.
Сходные данные получены при обследовании пациентов, страдающих аторосклеротическим поражением стенок сосудов. Обследуемые группы сопоставимы по результатам лабораторного обследования.
В группе IV, сформированной из условно здоровых доноров, значительных отклонений в анализах, выполненных до начала лечения, не выявлено. Данные дерматологического обследования не показали нарушений со стороны кожных покровов.
Учитывая описанную раннее воспалительную природу заболеваний, а так же возможную патогенетическую связь псориатического поражения кожных покровов и атеросклеротического поражения стенок сосудов, следующим этапом наших исследований стал поиск маркеров для оценки влияния аторвастатина на течение воспалительного процесса при этих заболеваниях.
В своем биоинформационном исследовании мы использовали программу PathwayStudio и реферативную базу данных ResNet компании AriadneGenomics (США). Объектами базы данных ResNet являются аннотации биологических объектов (в частности, белков, клеточных процессов и болезней), а также аннотации функциональных связей между ними, сформированные в результате обработки текстового массива полнотекстовых статей и абстрактов, индексированных в Medline.
Значимость, объединенных общей функцией генов, оценивалась по тому, насколько пересечение множества генов, приписанных к данной категории, превышало ожидаемый размер. Гипергеометрическое распределение использовали в качестве модели случайного пересечения множеств, р-значение, оценка значимости ассоциации данной карты с входным списком генов, вычисляется для гипергеометрического распределения как все данные биологического микрочипа, которые являются подмножеством генеральной совокупности); п - выборка из генеральной совокупности (конкретный процесс из списка процессов - размер входного списка генов); г -количество, «помеченных» объектов для этой выборки (число генов из входного списка, относящихся к данной карте).
При помощи программы производится расклад процессов по приоритетам, исходя из того, что чем меньше р-значение, тем больше вероятность того, что гены, попавшие в конкретный процесс, включены туда не случайно. Изначально порог значимости для р-значения равнялся 0,01. р-значение убывает с ростом N, то есть увеличивается вероятность того, что в нашей произвольной выборке п количество «помеченных» объектов г не случайно.
Динамика лабораторных показателей при контрольном обследовании
Ранее Ye S. получены данные о связи повышения уровня ММР-12 при атеросклерозе с полиморфизмом гена ММР-12 и восприимчивостью к сердечнососудистым заболеваниям: атеросклерозу артерий, инфаркту миокарда, аневризме аорты [157]. Активация ММР-12 наступает при изменении соотношения в системе протеазы-антипротеазы, влияющего на течение и прогрессирование атеросклероза.
После проведения необходимых обследований, в качестве терапевтического лечения пациенты, составившие группы II и III, получали препарат - аторвастатин в дозировке от 5 мг до 20 мг 1 раз сутки в зависимости от индивидуальной восприимчивости к терапии под контролем биохимического анализа крови, проводимого 1 раз в 2 недели. Побочные явления (токсическое влияние на клетки печени и мышечную ткань) определяли по уровню ACT, АЛТ и КФК, соответственно.
Через 3 месяца с момента начала применения аторвастатина для оценки клинической эффективности лечения проведено контрольное обследование.
Проведенные клинические, инструментальные и лабораторные исследования не выявили токсических и других нежелательных эффектов при применении аторвастатина.
Динамика лабораторных показателей при контрольном обследовании через 3 месяца после начала лечения аторвастатином
Через 3 месяца от начала применения аторвастатина в группах пациентов, страдающих псориазом, и пациентов с атеросклеротическим поражением артерий, для оценки клинической эффективности лечения нами проведено контрольное обследование.
Курс лечения оказал положительное влияние на клиническую картину заболеваний и привел к улучшению клинических показателей пациентов в группе больных псориазом, дополнительно получающих аторвастатин.
Согласно результатам контрольного дерматологического обследования лечение аторвастатином привело не только к стабилизации, но и к определенной регрессии псориатического процесса. У больных, прошедших курс лечения, не наблюдалось свежих папулезных высыпаний, а также шелушения уже имевшихся до начала применения аторвастатина псориатических бляшек, что свидетельствовало о достижении стационарной стадии заболевания. Общая оценка состояния больных в обследуемых группах представлена в таблице 11. Общая оценка состояния больных в Группе II также свидетельствовала о статистически достоверном снижении индекса PASI на 38,6% (среднее значение PASI до лечения 15,8±1,2, через 3 месяца после начала терапии - 9,7±1,3) (Рисунок 19).
В группе I (пациенты, не принимавшие аторвастатин) индекс PASI значительно не изменялся, в течение Зх месяцев ремиссия достигнута не была (рисунок 20). Среднее значение PASI составило до лечения 15,5±0,9, через 3 месяца после начала терапии - 13,1 ±1,1.
Проведенные клинические, инструментальные и лабораторные исследования не выявили токсических и других нежелательных эффектов на фоне применения аторвастатина. Уровень ACT и АЛТ находился в пределах референсных значений. Все группы пациентов прошли контрольное обследование, включающее определение показателей липидного профиля пациентов.
Динамика изменения биохимических показателей сыворотки крови в группе I представлена в таблице 12.
У пациентов, не принимающих аторвастатин, отмечено некоторое улучшение показателей липидного обмена. На рисунке 21 представлены данные, полученные до и после курса лечения в сравнении с референсными значениями.
Ниже представлены данные липидного профиля пациентов, принимавших аторвастатин (группа II). Отмечено значительное улучшение показателей липидного обмена (таблица 13).
На фоне приема аторвастатина отмечена положительная динамика показателей липидного обмена: уровень общего холестерина в данной группе пациентов, уменьшился через 3 месяца после начала терапии до 6,1 ±0,2 ммоль/л; триглицеридов - до 2,14±0,2 ммоль/л; значение холестерина ЛПВП увеличилось до 0,85±0,1 ммоль/л (рисунок 22).
Таким образом, применение аторвастатина у больных псориазом, позволяет достичь более ранней стабилизации и регрессии псориатического процесса, что свидетельствует о достижении ремиссии заболевания (снижение индекса PASI на 38,6%), по сравнению с группой больных псориазом, не получавших аторвастатин. Во всех исследуемых группах отмечена положительная динамика изменения показателей липидного обмена.
При исследовании липидного состава крови пациентов, страдающих атеросклеротическим поражением артерий, отмечена нормализация контрольных показателей на фоне применения аторвастатина. Их значения приблизились к референсным, являющимися условными целевыми значениями (таблица 14).
У пациентов, страдающих атеросклеротическим поражением сосудов, значения основных показателей липидного обмена через 3 месяца после начала терапии аторвастатином приблизились к референсным, принятым в качестве условных целевых значений при измерениях на данной модели прибора и для данного метода. Уровень общего холестерина, исходно составлявший 7,9±0,3 ммоль/л, уменьшился до 6,3±0,3 ммоль/л; уровень триглицеридов от 3,4±0,1 ммоль/л до 2,6±0,2 ммоль/л; значение холестерина ЛПВП, исходно составлявшее 0,4±0,1 ммоль/л, увеличилось до 0,7±0,2 ммоль/л. (рисунок 23).
Во II и III группах пациентов отмечено значительное улучшение показателей липидного обмена. В группе I так же наблюдалось незначительное изменение уровней общего холестерина, триглицеридов и ЛПВП. В группе условно здоровых доноров (группа IV) значительной динамики показателей отмечено не было.
В эти же сроки определяли уровень IL-17A и ММР-12 в сыворотке крови всех групп больных.
Динамика основных показателей цитокинового статуса сыворотки крови пациентов до и через 3 месяца после начала терапии отражена в таблице 15.
