Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1.1. Факторы риска развития хронических воспалительных заболеваний органов дыхания 11
1.2 Гены, вовлеченные в патогенез бронхиальной астмы .12
1.2.1 Полиморфизмы генов Toll-подобных рецепторов (TLR) 17
1.2.2 Протективные и ассоциированные с БА HLADRB1специфичности.21
1.2.3 Роль провоспалительных цитокинов в патогенезе БА... 25 1.2.4. Влияние полиморфизмов генов на продукцию цитокинов 37
Глава II. Материалы и методы .39
2.1. Реактивы, тест-системы и материалы .39
2.2 Экспериментальные методы 40
2.3. Статистическая обработка данных .46
2.4. Общая характеристика обследованных доноров и больных 46
Глава III. Результаты исследований 49
3.1 SNP TLR, вовлеченные в патогенез БА у жителей РА 49
3.2. Типирование протективных и ассоциированных с БА специфичностей HLADR B1 у жителей РА .57
3.3 Полиморфизмы генов провоспалительных цитокинов, ассоциированные с БА в этнических группах населения РА .64
3.3.1 G197A аллельные варианты гена IL-17A 64
3.3.2. Роль G308A SNP гена TNF- в патогенезе БА у жителей РА 77
3.3.3 С17 4G полиморфизмы гена IL-6 при ХВЗЛ .89
Глава IV. Обсуждение .100
Выводы .108
Практические рекоменации 109
Список литературы
- Гены, вовлеченные в патогенез бронхиальной астмы
- Статистическая обработка данных
- Полиморфизмы генов провоспалительных цитокинов, ассоциированные с БА в этнических группах населения РА
- 4G полиморфизмы гена IL-6 при ХВЗЛ
Введение к работе
Актуальность исследования. Международная программа GINA (2006, 2011) относит бронхиальную астму к распространенным заболеваниям бронхо-лёгочной системы и к 2020 г., по прогнозам комиссии экспертов ВОЗ, ожидается дальнейший рост заболеваемости и перевод БА в группу наиболее часто регистрируемых нозологий (Masoli M. et al., 2004; Yan D.C. et al., 2005; Vincent S.D. et al., 2006). В Республике Адыгея, по данным МИАЦ, за последние три года (2010-2013гг.) заболеваемость БА возросла на 12%. Высокая смертность и социально-экономический ущерб от БА в РФ обуславливает необходимость выявления молекулярно-генетических маркеров, вовлеченных в патогенез БА.
В развитии мультифакторной БА наследственный компонент составляет от 30 до 70%, однако специфические гены предрасположенности к этой нозологии не установлены (ВОЗ, 2000г., GINA, 2011). Данные по полиморфизмам генов, ассоциированным с БА, фрагментарны и противоречивы (Hanchard N.A. et al., 2010; Chen J., 2010; Tsai C.H. et al., 2011; Wang M. et al., 2012; Trajkov D. et al., 2012).
Согласно современной классификации, бронхиальную астму относят к хроническим воспалительным заболеваниям органов дыхания (GINA, 2011), механизм развития которых включает несколько основных этапов: распознавание «образов патогенности» Toll-подобными рецепторами, презентацию антигенов молекулами HLA II класса, активацию продукции основных медиаторов воспаления – цитокинов (Симбирцев А.С., 2005; Смирнова О.В., 2011 и др.). Поэтому представляется актуальнымым исследование SNP промоторных и структурных регионов некоторых генов, обеспечивающих многоуровневую регуляцию воспалительных процессов: специфичностей HLA II класса, генов TLR и провоспалительных цитокинов.
Ряд полиморфизмов TLR, повышающих восприимчивость к паттернам микроорганизмов, могут приводить к развитию хронической воспалительной реакции и таким образом участвовать в патогенезе бронхиальной астмы. Запуск воспалительной реакции, опосредованный TLR и завершающийся стимуляцией экспрессии генов цитокинов, непосредственно связан с активацией HLA II класса, специфичности которых используются в качестве генетических маркеров резистентности или предрасположенности ко многим заболеваниям, в том числе и БА (Яковлева К.П., 2002; Di Somma C. et al., 2003; Donfack J. et al., 2003; Torio, A., et al., 2003; Juhn Y.J. et al., 2007; Munthe-Kaas M.C. et al., 2007; Hanchard N.A. et al., 2010; Knutsen A.P. et al., 2010; Martyn M.B. et al., 2010; Убайдуллаев С. А., 2010; Андреева Е.Е., 2011). Однако, МНС-II является высокополиморфной структурой, имеющей этно-генетические различия, что требует региональных исследований для определения протективных и ассоциированных с БА специфичностей HLA II.
Иммуно-воспалительные реакции запускаются провоспалительными цитокинами «первой волны», к которым относятся IL-17А, TNF-, IL-6. SNP промоторных регионов этих генов могут влиять на уровни экспрессии цитокинов и приводить к медиаторному дисбалансу, инициирующему развитие хронических воспалительных заболеваний (Кубышева Н.И., 2002; Демьянов А.В., 2003; Щеглова М.Ю., 2005; Зенкина Л.В., 2008; Макарова В.И., 2008; Борисова Т.В., 2013; Ковальчук Л.В., 2012).
Исследования по частотам и ассоциированности единичных нуклеотидных полиморфизмов генов TLR (TLR4; TLR9), специфичностей HLA DRB1, генов провоспалительных цитокинов с бронхиальной астмой в регионах Российской Федерации немногочисленны, а для населения Республики Адыгея не представлены в международных электронных базах данных (HuGenet, PubMed, Ensembl, OMIM).
Цель исследования: типирование полиморфных вариантов генов TLR, специфичностей HLA DRB1 и SNP основных провоспалительных цитокинов, ассоциированных с риском развития бронхиальной астмы у жителей Республики Адыгея.
Задачи:
-
Исследовать распределение частот и ассоциированность SNP генов TLR4 (Asp299Gly, Thr399Ile) и TLR9 (A2848G) с риском развития бронхиальной астмы у жителей РА.
-
Идентифицировать аллели генов основных провоспалительных цитокинов (IL-17A G197А, TNF- G308А, IL-6 С174G), вовлеченных в патогенез бронхиальной астмы.
-
Исследовать влияние полиморфизмов генов цитокинов IL-17A, TNF-a, IL-6 на уровни спонтанной и стимулированной in vitro продукции медиаторов иммунной системы в культуре мононуклеарных клеток доноров и больных БА.
-
Выявить протективные и маркерные для БА специфичности, генотипы HLA DRB1. Провести анализ сочетанного носительства генотипов HLA DRB1 с SNP генов цитокинов G197А (IL-17A), G308А (TNF-a), С174G (IL-6) в норме и при бронхиальной астме.
Научная новизна:
Впервые для жителей РА исследовано частотное распределение аллелей и генотипов полиморфизмов генов TLR4 (Asp299Gly, Thr399Ile), TLR9 (A2848G), IL-17А (G197A), TNF- (G308A), IL-6 (С174G) и специфичностей гена HLA DRB1 в обследованных группах населения РА в зависимости от гендерных различий и наследственной отягощенности по БА.
Определены сывороточные концентрации, уровни спонтанной, стимулированной in vitro ФГА продукции цитокинов МНК доноров и больных БА. Установлены особенности влияния полиморфных вариантов генов на продукцию медиаторов у доноров и больных.
Получены новые данные о роли полиморфизмов генов IL-17А (G197A), TNF- (G308A) в развитии БА на примере жителей РА.
Впервые проанализировано сочетанное носительство SNP генов TLR, HLA DRB1 и основных провоспалительных цитокинов в норме и при БА.
Научно-практическая значимость:
На основании экспериментальных данных впервые:
- показано, что в патогенез БА вовлечены преимущественно медиаторы иммунной системы, провоспалительные цитокины «первой волны» IL-17А, TNF-a;
- установлены маркерные SNP, ассоциированные у жителей РА с БА: 197А аллель и А197А генотип гена IL-17А; G308A генотип TNF-a;
- доказано влияние 197А аллели промоторного региона и А197А генотипа гена IL-17А на спонтанную продукцию медиатора (IL-17А).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Полиморфизмы генов TLR4 (Asp299/299Gly, rs4986790), Thr399/399Ile (rs4986791), TLR9 (A2848/2848G, rs352140) и специфичности генов HLA DRB1 не ассоциированы у жителей Республики с бронхиальной астмой.
-
В патогенез бронхиальной астмы вовлечены полиморфизмы генов основных провоспалительных цитокинов IL-17А (G197А), TNF-a (G308A) – медиаторов «первой волны».
-
У больных бронхиальной астмой SNP промоторных регионов генов IL-17A (G197A) и IL-6 (C174G) разнонаправленн влияют на продукцию интерлейкинов МНК, что может привести к медиаторному дисбалансу: мутантный 197А аллель и А197А гомозиготный патологический генотип основного провоспалительного IL-17А снижают спонтанную продукцию, а патологический G174G генотип IL-6 повышает стимулированную in vitro ФГА продукцию провоспалительных цитокинов МНК.
-
G308A полиморфизмы гена TNF- не влияют на сывороточные уровни, спонтанную продукцию TNF- МНК доноров и больных БА.
Внедрение результатов работы в практику
Работа выполнена в рамках аналитической ведомственной целевой программы, проводимой по заданию Минобрнауки РФ в 2012-2014 гг. (ЕЗН, код ГРНТИ 34.2341, 34.23.53, 34.13.37, № проекта 4.1334.2011, № гос. контракта 01201276009) на базе иммуногенетической лаборатории Адыгейского государственного университета.
Материалы диссертационного исследования внедрены в учебный процесс Адыгейского государственного университета в рамках биологических дисциплин (нормальная физиология, генетика, иммунология) и Майкопского государственного технологического университета в рамках медико-биологических дисциплин (клиническая иммунология, медицинская генетика, нормальная физиология, патологическая физиология).
Личный вклад автора
Автором выполнены все экспериментальные исследования, проведен анализ и статистическая обработка полученных результатов, подготовлены публикации по теме диссертации.
Апробация диссертации
Основные результаты диссертационной работы доложены на II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012), региональной конференции «Фестиваль Недели науки Юга России» (Ростов-на-Дону, 2012, диплом за 1-е место), международной конференции «Достижения науки за последние годы. Новые наработки» (Варшава, Польша, 2012), XXV и XXVI международных конференциях «Неделя науки МГТУ» (Майкоп, 2012, 2013), VII международной научной конференции молодых ученых медиков (Курск, 2013), X международной научной конференции молодых ученых «Наука. Образование. Молодежь» (Майкоп, 2013), Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2013), девятой ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (Ростов, 2013), Международной научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Перспектива-2013» (КБР, пос. Эльбрус, 2013), 17 и 18-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2013, 2014), XXII Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Казань, 2013).
Публикации
Основные результаты работы изложены в 16 печатных работах; 5 статей опубликованы в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, 11 публикаций - в материалах российских и международных конгрессов.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 133 страницах печатного текста и состоит из разделов: введения, обзора научной литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Работа содержит 8 рисунков и 60 таблиц. Библиографический указатель включает 252 литературных источника, в том числе 84 отечественных и 168 зарубежных.
Гены, вовлеченные в патогенез бронхиальной астмы
В условиях нарастающих депопуляционных процессов в РФ и РА, преимущественно среди трудоспособного контингента населения, выявление причинно-следственных связей в развитии БА на индивидуальном и популяционном уровне приобретает особую актуальность. По данным ВОЗ, бронхиальная астма относится к заболеваниям мультифакторной природы, в развитии которой наследственность не уступает по значимости суммарному влиянию среды обитания и образу жизни: курению, употреблению алкоголя и др. В 90% случаев активное и пассивное табакокурение ВОЗ (2012г.) признает основным фактором развития хронических воспалительных заболеваний легких (ХВЗЛ), ЗНО и др. нозологий. Однако, лишь у 15-30% курящих развивается бронхиальная обструкция, далеко не у всех курильщиков диагностируется рак легкого. Более того, известно, что хронические воспалительные заболевания и злокачественные новообразования легких развиваются у людей не курящих и постоянно не подвергающихся негативному воздействию пассивного курения в семье и на работе (Коненков В. И., 2003; Чучалин А.Г., 2004, 2011; GINA, 2006).
В развитии бронхиальной астмы GINA (2006, 2011) выделяет внутренние (обусловливающие развитие заболевания, в первую очередь генетические) и внешние факторы (провоцирующие появление симптомов) (Busse W.W. et al., 2001). Выраженные расовые и этнические различия в распространенности БА подтверждают ведущую роль генетических факторов в развитии ХВЗЛ. Наследственная предрасположенность, вероятно всего, реализуется сложным механизмом взаимодействия генов между собой и с внешними факторами. Важным параметром, определяющим развитие БА у генетически предрасположенных лиц являются возраст контакта с сенсибилизаторами и состояние системы иммунного ответа (Holgate S.T. et al., 2009; Ober C. et al., 2005; GINA, 2006).
Одним из основных этиологических факторов развития БА ряд авторов рассматривает воспалительный компонент (Булатова П.К. с соавт., 1975; Новиков Д.К. с соавт., 1997; Платонов А.В. с соавт., 2004; Федосеев Г.Б. с соавт., 2006; Смирнова О.В. с соавт., 2011; Карунас А.С. с соавт., 2011). В отличии от классификации БА GINA, Г.Б. Федосеев, 2006 описал восемь основных вариантов патогенетических механизмов БА: 1) атопический; 2) инфекционно-зависимый; 3) аутоиммунный; 4) дисгормональный; 5) нервно-психический; 6) адренергический дисбаланс; 7) первично измененная реактивность бронхов; 8) холинергический. Эта классификация патогенетических механизмов БА сохраняет актуальность и в настоящее время (Новиков Д.К. с соавт., 1997; Смирнова О.В. с соавт., 2011). Однако, несмотря на многообразие этиологических факторов и начальных этапов механизма развития астмы конечные его звенья реализуются через одни и те же системы лейкоцитарных, нейрогенных и эпителиальных медиаторов. Изучение данных бронхоскопических биопсий легкого, показателей бронхоальвеолярного лаважа и бронхопровокационных исследований у пациентов с аллергической и неаллергической астмой показали идентичные характеристики воспалительного ответа независимо от этиологии бронхиальной астмы. Полагают, что БА прогрессирует за счет персистенции воспаления и нарушения репарационных механизмов. Важную роль в этих процессах играют клетки систем врожденного и приобретенного иммунитета (Смирнова О.В. с соавт., 2011).
Гены, вовлеченные в патогенез БА Согласно современным представлениям, развитие БА обусловлено сложным взаимодействием факторов среды и выраженной наследственной предрасположенностью, выявленой у 46,3% больных БА. В 33,3% случаев тип наследования БА аутосомно-рецессивный, в 11,1% — аутосомно-доминантный, в 43,1% — аутосомно-доминантный с неполной пенетрантностью, в 18,5% — мультифакториальный (Булатова П.К., 1975; Федосеев Г.Б. с соавт., 2006; Асанов А.А. с соавт., 2008). Значение наследственных факторов в происхождении БА было продемонстрировано в серии работ по оценке повторного риска заболевания в отягощенных семьях. Если один их родителей страдает БА, вероятность развития заболевания у ребенка составляет 20–30%, а если больны оба родителя — 75% (Чучалин Л.Г., 2001).
Семейно-популяционные и близнецовые исследования подтверждают вклад генетических и средовых компонентов в этиологию и патогенез БА. В исследованиях, проведенных на больших выборках в ряде стран, конкордантность БА у монозиготных близнецов в 1,5–2 раза превышала таковую у дизиготных, а показатель наследуемости составлял от 36 до 75% (Булатова П.К., 1975; Федосеев Г.Б. с соавт., 2006).
Высокая фенотипическая вариабельность клинической картины БА указывает на существование эффекта взаимодействия многих генов, что предполагает наличие определенных комбинаций генетических вариантов у заболевших, а также влияние внешних факторов на формирование особенностей клинической картины. Генетический компонент предрасположенности к БА формируется несколькими основными, возможно, кодоминантными генами, эффекты которых в свою очередь ассоциированы с большим количеством генов-модификаторов. (Асанов А.А. с соавт., 2008)
Это подтверждает большую значимость генетически детерминированных задатков, определяющих в конечном итоге вероятность неблагоприятного воздействия контролируемых факторов: образа жизни, состояния окружающей среды обитания и т.д. (Диел Ф., 2001; GINA, 2006).
В новой редакции рабочей группы GINA (2011) упоминается о многочисленных генах, участвующих в развитии БА и отличающихся для разных этнических групп, однако, как и в издании 2006г. поиск генов, связанных с развитием БА, сосредоточен на четырех крупных областях: выработке аллерген-специфических антител класса IgE (атопия); проявление бронхиальной гиперреактивности; образование медиаторов воспаления, например цитокинов, хемокинов и факторов роста; определение соотношения между Th1 и Th2 опосредованными типами иммунного ответа (согласно гигиенической гипотезе развития БА) (Postma D.S. et al., 1995; In K.H. et al., 1997; Holloway J.W. et al., 1999; Wiesch D.G. et al., 1999; Louis R. et al., 2000; Nanavaty U. et al., 2001; Drazen J.M. et al., 2002; Buckova D. et al., 2002; Tattersfield A.E. et al., 2004; Shin H.D. et al., 2004; Israel E. et al., 2004; Ito K. et al., 2006; Sharma S. et al., 2006; GINA, 2006).
С развитием методов молекулярной биологии и расшифровки генома человека идентифицированы гены, расположенные в разных хромосомах и ассоциированные с наиболее распространенными системными патологическими процессами, обуславливающими высокую заболеваемость, инвалидизацию и смертность населения от БА и др. заболеваний во многих странах мира (Sandford A.J. et al., 2004; Trajkov D. et al., 2012).
Статистическая обработка данных
Запуск воспалительной реакции, опосредованный TLR и завершающийся стимуляцией экспрессии генов цитокинов, непосредственно связан с активацией HLA II класса. Поэтому специфичности HLA используются в качестве генетических маркеров резистентности или предрасположенности ко многим заболеваниям, в том числе и к БА (Зарецкая Ю.М., 1983; Смольникова М.В. с соавт., 2001; Шапорова, Н.Л., 2003; Хаитов М.Р. с соавт., 2004; Михайленко А.А. с соавт., 2005; Болдырева М. Н., 2007; Андреева Е.Е. с соавт., 2010-11; Федорова Ю.Ю. с соавт., 2010; Руденко, 2012). Межрасовые и внутриэтнические различия HLA, определяющие физиологическую устойчивость и ассоциированность с некоторыми заболеваниям на популяционном уровне обусловлены высоким «экстремальным» полиморфизмом HLA, который по мнению Алексеева Л.П. (2001), обеспечивает выживание человечества в условиях эндогенной и экзогенной агрессии генетически разнообразного и эволюционирующего микробного окружения, является мощным механизмом вариабельности, естественного отбора человека как вида. Взаимосвязь HLA и заболеваний проявляется в различной степени ассоциации. Один и тот же ген может иметь сильную связь с одним заболеванием и слабую связь с другим. Продукты МНС – мембранно-ассоциированные пептиды, обеспечивающие согласованное взаимодействие всех иммунокомпетентных клеток в реализации иммунных реакций организма. Молекулярно-генетическими методами выявлено большее количество аллельных вариантов генов МНС, которые получили название специфичностей. Однонуклеотидные замены в структуре генов МНС могут обладать более высокой степенью ассоциации определенных специфичностей HLA с заболеваниями. С внедрением ПЦР типированы новые аллельные варианты и экспрессиирующие гены, ассоциированные с заболеваниями в зависимости от этнических особенностей (Хаитов Р. М. с соавт., 2001; Семин Е.В. с соавт., 2012). Характер ассоциативных связей между специфичностями HLA и болезнями может зависеть не только от однородности исследуемых групп по конкретной нозологической форме или клиническому варианту полиэтиологического заболевания, но и от популяционных характеристик анализируемой выборки: этнической принадлежности пациентов, их пола, возраста в дебюте заболевания и т.д. (Баранов А.А. с соавт., 2003; Левитан Б.Н. с соавт., 2004; Андреева Е.Е. с соавт., 2011).
Проводимые ранее исследования ассоциации специфичностей HLA II класса с БА в ряде стран по трем сцепленным локусам, преимущественно сведены к одному HLA DRB1. Для разных этнических групп определено 10 из 14 специфичности HLA DRB1 как повышающие риск и 4 обуславливающие протекцию к развитию БА (Табл. 2, 3). Donfack J. et al., 2003 установили взаимосвязь аллелей DRB1 01 с сенсибилизацией к аллергенам ведущую к развитию астмы в двух независимых популяциях – афроамериканцев и гуттеритов, проживающих в Америке. Аналогичные закономерности установлены Torio, A., et al., 2003 для испанских больных БА.
В четырех независимых исследованиях, проведенных в США (Juhn Y.J. et al., 2007; Hanchard N.A. et al., 2010; Knutsen A.P. et al., 2010; Martyn M.B. et al., 2010) а так же в Италии (Di Somma C. et al., 2003), Норвегии (Munthe-Kaas M.C. et al., 2007) и Узбекистане (Убайдуллаев С. А. с соавт., 2010) установлено, что риск БА ассоциирован с DRB1 03.
Y.K. Kim et al. (2002) показали, что частота DRB1 07 в исследуемой группе значительно выше, а аллель DRB1 04 достоверно чаще обнаруживался у здоровых людей. На основании полученных данных сделан вывод о том, что аллель DRB1 07 определяет развитие повышенной чувствительности, а DRB1 04 имеет протективный эффект в отношении БА, сенсибилизированной к клещам домашней пыли в корейской популяции. Были получены и другие данные о связи аллелей HLA II класса с различными проявлениями атопии. Для Кореи так же характерна ассоциация БА с DRB1 15 специфичности гена HLA (Choi J.H. et al., 2009; Palikhe N. S. et al., 2011). Кроме выше перечисленных аллелей HLA DRB1, значительно реже с БА ассоциируют DRB1 11, 12, 13. Специфичность DRB1 13 так же как и DRB1 04 в некоторых популяциях рассматривается как протективная (табл. 2).
Специфичности HLA II класса DRB1 и DQB1 локусов в РФ исследованы для популяций русских, проживающих в трех географически удаленных областях: астраханской, московской, кировской (табл. 2, 3). Несмотря на принадлежность обследованных лиц к одной этнической группе, у астраханских и московских пробандов были выявлены разные специфичности HLA DRB1 локуса, связанные с БА. Так, для астраханской популяции русских маркерами повышенного риска развития БА является HLA DRB1 08 аллель (Андреева Е.Е. с соавт., 2011). В московском регионе в отличие от астраханского, с астмой ассоциирована HLA DRB1 07 специфичность (Яковлева К.П. с соавт., 2002). Для больных Кировской области не установлено маркеров HLA DRB1, ассоциированных с БА (Иллек Я.Ю. с соавт., 2009). Протективные антигены в DRB1 локусе, для обследованных популяций русских идентифицированы только для Астраханского региона -DRB1 13 (табл. 3). Для узбекской популяции DRB1 13 специфичность являются протективной. Одна из наиболее распространенных в мире DRB1 03 специфичностей ассоциирована с атопической БА, а DRB1 12 – с неатопической формой БА (Убайдуллаева С. А. с соавт., 2010).
Таким образом, результаты большого числа исследований, целью которых было изучение взаимосвязи между БА или сенсибилизацией к конкретным аллергенам и определенными аллелями или антигенами HLA II класса в различных популяциях, свидетельствуют о наличии множества положительных и отрицательных обратных связей (Семин Е.В., 2012).
Роль провоспалительных цитокинов в патогенезе БА Интерлейкины – медиаторы иммунной системы, определяющие силу, продолжительность иммунно-воспалительного ответа, обеспечивают межклеточные взаимодействия, позитивную, негативную иммунорегуляцию. Цитокиновая сеть представляют собой систему, которая формирует и регулирует весь комплекс физиологических процессов и патофизиологических сдвигов при внедрении патогенов (Щеглова М.Ю., 2005). Клинический исход многих воспалительных заболеваний зависит от баланса продукции провоспатильных и противоваспалительных цитокинов.
Одной из причин дисбаланса цитокинов могут быть полиморфизмы генов (SNP), влияющих на уровень экспрессии и, следовательно, на иммунный ответ. В зависимости от типа полиморфизмов генов могут формироваться как низкие, так и высокие уровни иммунного ответа к различным антигенным детерминантам, а на популяционном уровне формируется различная степень иммунного ответ на однотипные антигенные воздействия (Смольникова М.В. с соавт., 2001; Коненков В.И. с соавт., 2003).
Наибольшее количество аллельных вариантов генов цитокинов установлено именно для их промоторов – участков, ответственных за связывание РНК-полимеразы с ДНК; наличие различных аллелей в промоторных регионах отличает их носителей друг от друга в основном интенсивностью экспрессии генов, не изменяя кодируемых геном продуктов (Коненков В.И. с соавт., 2003).
Полиморфизмы генов провоспалительных цитокинов, ассоциированные с БА в этнических группах населения РА
Так как роль HLA II класса в реализации иммунных реакций организма не ограничивается презентацией антигена соответствующим эффекторным клеткам, а связана с вовлечением каскада реакций, завершающихся активацией генов цитокинов, определенный научный интерес представляет сочетание HLADR B1 04 15 генотипа с исследованными SNP генов провоспалительных цитокинов. Для генотипа HLADR B1 04 15 проведен анализ сочетанного носительства аллельных вариантов и генотипов основных провоспалительных цитокинов (IL-17A G197A, TNF- G308A, IL-6 С174G) и TLR9 A2848 (табл. 21).
Экспериментально установлено, что у доноров и больных генотип DR B1 04 15 сочетается с определенными SNP генов двух провоспалительных цитокинов IL-17A и IL-6. Так, у доноров DR B1 04 15 генотип чаще типируется с «нормальными» аллельными вариантами G197 (IL-17A) и С174 (IL-6). У больных БА, в отличие от доноров, HLADR B1 04 15 генотип связан с «мутантными» аллельными вариантами 197А (IL-17A) и 174G (IL-6), которые in vitro оказывают ингибирующее действие на продукцию самого медиатора (Osiri M. et al., 1999; Jordanides N. et al., 2000). По аллельным вариантам TNF- и TLR-9 каких-либо закономерностей в группах доноров и больных не выявлено. Сочетание DR B1 04 15 генотипа с SNP генов цитокинов G197 (IL-17A), G308 (TNFa), С174 (IL-6), у доноров может обуславливать синергизм ключевых факторов воспаления в рамках физиологических потребностей организма.
G197A аллельные варианты гена IL-17A Исследование роли полиморфизмов генов основного провоспалительного цитокина IL-17A в патогенезе БА обусловлено широким спектром его биологических эффектов: запуском базовой воспалительной реакции, активацией продукции других медиаторов иммунной системы IL-6, G-CSF, GM-CSF, IL-1, TGF-, TNF-, простагландинов, хемокинов, привлечением в очаг воспаления моноцитов, нейтрофилов и т.д. Патофизиологические механизмы хронической воспалительной реакции, обусловленные SNP IL-17A, приводят к повреждению тканей, перестройке дыхательных путей, провоцирующих развитие БА (Bullens D. et al., 2006; Кетлинский С.А., 2006; Будчанов Ю.И., 2010).
Для идентификации протективных и ассоциированных с БА полиморфизмов гена IL-17A, у больных с тяжелой формой БА (n=47) и здоровых жителей РА (n=34) исследованы частоты наиболее распространенные в мире G197/197A аллельных вариантов промоторного региона гена в зависимости от этнической принадлежности, наследственной отягощенности, гендерных различий, возраста манифестации заболевания.
В мировых исследованиях последних 4-х лет, направленных на поиск SNP гена IL-17А, ассоциированного с риском развития бронхиальной астмы, в качестве маркера предложен только G197/197A полиморфизм (rs2275913) гена IL-17А, типированный и для жителей Республики Адыгея (табл.22).
У доноров и больных хроническими воспалительными заболеваниями легких выявлены достоверные различия по частотному распределению G197/197A аллелей и генотипов IL-17A. В группе больных БА по сравнению с донорами статистически значимо (р 0,008) повышена частота A197 аллели и патологического гомозиготного АА генотипа (р 0,01), следовательно 197А полиморфизм и АА генотип ассоциированы у жителей РА с хроническими воспалительными заболеваниями легких. Носительство патологической аллели и гомозиготного генотипа повышают риск развития БА соответственно в 2,51 и 12,62 раза (табл. 22). Полученные данные по ассоциации 197А полиморфизма и АА генотипа гена IL-17А с БА у жителей РА подтверждены исследованиями Chen J et al, 2010 для китайцев.
Аллельные варианты и генотипы G197A гена IL-17A типированы в группах обследованных мужчин и женщин с целью выявления гендерных различий в распределении частот и ассоциации с риском развития БА (табл. 23; 24) Таблица 23. Частоты G197A SNP и генотипов IL- 17A в гендерных группах больных и доноров
Достоверные гендерные различия по распределению G197А полиморфизмов генов IL- 17A выявлены преимущественно у больных, но не в группах здоровых мужчины и женщин (табл. 24). С бронхиальной астмой у мужчин статистически значимо ассоциирована «мутантная» аллель и АА генотип IL- 17A (табл. 23). 3.3.1.3 Частоты G197/197A аллелей и генотипов IL-17A в этнических группах населения РА Этнические различия по распределению и возможной ассоциации G197/197A аллелей и генотипов гена IL-17A с БА прослежены у русских и адыгов (европеоидная раса), резидентов Республики Адыгея в трех поколениях. Данные по распределению SNP для разных этнических групп, адаптированных к одинаковым климато-географическим условиям РА, представлены в табл. 25-27.
Инверсия в соотношении G197 и 197A аллелей IL-17A между донорами и больными в группе мужчин, более выражена для этнической русских (табл. 25). «Мутантная» 197А аллель и АА генотип, достоверно чаще выявляемые у русских мужчин с верифицированным диагнозом БА (2=13,64; OR=17,50; 2=11,63; OR=17,50) и ассоциированные с хроническими воспалительными заболеваниями легких, у здоровых русских мужчин не обнаруживаются. У этнических адыгов «мутантный» 197А полиморфизм и А197А генотип также повышает риск развития БА (2=3,33; OR=6,00; 2=4,13; OR=16,00). Нормальная G197 аллель, в 7
Статистически значимых гендерных различий по распределению аллельных вариантов G197A и генотипов гена IL-17A в обследованных группах с наследственно-отягощенной и приобретенной БА не выявлено.
У женщин с наследственно-отягощенной формой БА частота «мутантного» А197А генотипа по сравнению с донорами повышена, что подтверждает его ассоциированность с БА (Табл. 29). Патологический А197/197А генотип у мужчин в отличие от женщин ассоциирован с риском развития как наследственно-отягощенной, так и приобретенной БА, однако для ненаследственно-отягощенной формы БА этот риск значительно выше (OR=26,67) чем у лиц с наследственной отягощенностью (OR=16,00). Примечания: - статистически значимые отличия по 2 (при р 0,05) и OR (95% СІ) для групп: (2)1 и OR1 (95% СІ) больные БА с насл-ю и больны БА без насл-и женщины (русс); (2)2 и OR2 (95% СІ) больные БА с насл-ю и доноры женщины (русс); (2)3 и OR3 (95% СІ) больны БА без насл-и и доноры женщины (русс); (У и OR4 (95% СІ) больные БА с насл-ю и больны БА без насл-и женщины (адыг.) ; (2)5 и OR5 (95% СІ) больные БА с насл-ю и доноры женщины (адыг.); (2)6 и OR6 (95% СІ) больны БА без насл-и и доноры женщины (адыг.).
4G полиморфизмы гена IL-6 при ХВЗЛ
Выбор цели и основных объектов диссертационного исследования SNP генов TLR4 (Asp299Gly, Thr399Ile), TLR9 (A2848G), IL-17А (G197A), TNF- (G308A), IL-6 (С174G) и специфичностей гена HLA DRB1 обусловлен многоуровневой генетической регуляцией иммунной системы, связанной с набором аллельных вариантов генов главного комплекса гистосовместимости, цитокинов и паттерн-распознающих рецепторов. Сочетание аллельных вариантов этих больших и высоко полиморфных генетических систем в конечном итоге и определяет интенсивность иммунного ответа к эндо- и экзогенным антигенным детерминантам, а также резистентность или предрасположенность индивида к различным мультифакторным заболеваниям, в том числе и бронхиальной астме (Коненков В.И. с соавт., 2003; Баранов А.А. с соавт., 2003; Хаитов М.Р. с соавт., 2004; Асанов А.Ю. с соавт., 2008; Будчанов Ю.И. с соавт., 2010). TLR первыми распознающие паттерны бактерий и вирусов, находятся на внешних и внутренних мембранах и обуславливают дальнейший ход воспалительной реакции т.к. оказывают непосредственное влияние на продукцию цитокинов и экспрессию HLA II класса. Основную роль в распознавании как вирусных, так и бактериальных агентов играют TLR4, расположенный на внешней цитоплазматической мембране и TLR9, входящий в состав внутриклеточных мембранных структур. Исследования по влиянию полиморфизмов генов TLR4 и TLR9 на риск развития БА в России и за рубежом немногочисленны, фрагментарны и не учитывают этногенетических аспектов ассоциированности с БА (Меджитов Р. М. с соавт., 2004; Симбирцев А.С. с соавт., 2005; Корытина Г.Ф. с соавт., 2008).
В распределение аллельных вариантов и генотипов TLR4 (Asp299/299Gly), TLR4 (Thr399/399Ile) и TLR9 (A2848/2848G) у жителей РА прослеживаются сходные с мировыми популяциями (по данным базы Ensembl) закономерности. Частоты редких «мутантных» 299Gly и 399Ile аллелей генов мембранных TLR4 у 101 жителей РА незначительно повышены (11,5% и 9,3%.), а по соотношению A2848/2848G полиморфизмов гена внутриклеточного TLR9 не отличаются от мировых. При сравнении доноров и больных с тяжелой формой БА без учета наследственной отягощенности, гендерных различий и др. параметров, у жителей РА не выявлено достоверных различий по частотам исследованных полиморфных вариантов, что согласуется с данными Chen S., 2012. Установленная ассоциация 299Gly «мутантного» аллеля гена мембранного TLR4 с тяжелым течением БА у русских жителей Московской области, не нашла экспериментального подтверждения для этнических русских, проживающих в Республике Адыгея (Воронько О.Е. с соавт., 2011).
У мужчин и женщин РА с хроническими воспалительными заболеваниями легких не установлены статистически значимые гендерные различия в соотношении частот Asp299 и 299Gly TLR4 (соответственно 0,909:0,091, 2=0,35; OR=0,57 и 0,971:0,029, 2=1,20; OR=0,29). Наши данные не согласуется с утверждениями Adjers K. et all. (2005) об ассоциации «мутантной» 299Gly аллели гена TLR4 и определенного генотипа «высокого риска» развития БА для женщин Финляндии, что может быть обусловлено этническими особенностями. Следует отметить, что у мужчин и женщин РА по другим исследуемым SNP генов TLR4 (Thr399/399Ile), TLR9 (A2848/2848G) экспериментально также не выявлено ассоциации с хроническими воспалительными заболеваниями легких.
При SNP-типировании аллельных вариантов генов TLR4 (Asp299/299Gly), TLR4 (Thr399/399Ile), TLR9 (A2848/2848G) у больных с БА наследственная отягощенность, как правило, не учитывается. Поэтому нами исследовано частотное распределение и возможная ассоциация TLR4 (Asp299/299Gly), TLR4 (Thr399/399Ile), TLR9 (A2848/2848G) с риском развития БА в зависимости от наличия или отсутствия у близких родственников обследуемых больных хронических воспалительных заболеваний легких в двух предшествующих поколениях. Согласно полученным экспериментальным данным, с наследственно-отягощенной БА у обследованных жителей РА не ассоциирован ни один из трех 102 SNP TLR4 и TLR9 (rs4986790, rs4986790, rs352140). Различия по частотам патологического гомозиготного G2848/2848G генотипа для A2848/2848G полиморфизмов гена внутриклеточного TLR9, участвующего в распознавании как вирусных, так и бактериальных паттернов у больных с приобретенной формой БА и доноров статистически не значимы (2 =3,62, OR =3,03, р 0,05)
Для определения возможной ассоциации полиморфных вариантов TLR4 (Asp299/299Gly), TLR4 (Thr399/399Ile), TLR9 (A2848/2848G) с возрастом манифестации БА, проанализировано их распределение в группах больных с первыми клиническими проявлениями болезни в детском или зрелом возрасте (1 гр.), однако статистически значимые различия установлены только по гену внутриклеточного TLR9. У больных с манифестацией БА в зрелом возрасте, по сравнению с 1 группой, достоверно повышена частота «мутантной» 2848G аллели (2=5,52; OR=6,67) и G2848/2848G генотипа (2=4,46; OR=8,68) гена TLR9, что позволяет рассматривать их как маркеры более поздних клинических проявлений бронхиальной астмы.
Способность TLR к распознаванию вирусных и бактериальных паттернов предполагает необходимость анализа сочетания их аллельных вариантов и генотипов, обуславливающих предрасположенность или устойчивость к БА, что может иметь значение в процессах взаимодействия неспецифического и специфического иммунитета. Из возможных сочетаний исследованных SNP TLR4 и TLR9, в обследованных группах населения РА наиболее часто обнаруживаются две комбинации аллельных вариантов (Asp/Thr/G; Asp/Thr/А) и три генотипа (AspAsр/ThrThr/AA; AspAsр/ThrThr/AG; AspAsр/ThrThr/GG). У носителей AspAsр/ThrThr/GG генотипа риск развития БА повышается почти в семь раз (2 =3,49; OR=6,92). Полученные экспериментальные результаты не имеют аналогов в мире.
Развитие воспалительной реакции, опосредованной TLR, связано не только со стимуляцией экспрессии генов цитокинов, но и активацией HLA II класса. Исследования системы тканевых антигенов HLA свидетельствуют о тесной связи продуктов HLA с рядом заболеваний и возможностью их использования в 103 качестве генетических маркеров предрасположенности или резистентности к БА (Михайленко А.А. с соавт., 2005; Андреева Е.Е. с соавт., 2011). Экспериментальные данные по частотному распределение специфичностей HLA DRB1 в этнических группах русских, проживающих на территории РА и в других областях РФ, а так же у славянских народов (белорусов и украинцев), подтверждает многочисленные литературные данные об этногеографических различиях в распределении аллельных вариантов HLA II класса. Одни и те же специфичности HLA II класса могут выступать в роли протективных или ассоциированных с мультифакторными заболеваниями (БА и др.), в зависимости от этнической принадлежности или территориальной удаленности обследованных этногрупп.
Повышение частоты DRB1 08 специфичности HLA (p=0,063) при БА у русских, проживающих в РА, сопоставимо с данными для этнических русских Астраханской области, где статистически значимо установлена ассоциированность DRB1 08 специфичности с БА (Андреева Е.Е., и др., 2011). Наиболее распространенная среди русских доноров РА HLA DRB1 15 специфичность не является строго протективной к БА (p=0,082), что подтверждается данными мировых исследований (Cho S.H. et al., 2000; Kim Y.K. et al., 2002; Zhao J. et al., 2009; Шамгунова Б.А. с соавт., 2011; Убайдуллаев С. А. и др., 2010; Андреева Е.Е. с соавт., 2011).
