Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные взгляды на роль в эпидемическом процессе и особенности иммунного статуса медицинских работников, контактирующих с вирусом гепатита С 13
1.1. Эпидемиология ВГС-инфекции и формы инфекционного процесса 13
1.2. Вирус гепатита С, его структура и иммунотропные свойства 19
1.3. Иммунофенотипы и особенности развития острой и хронической ВГС-инфекции 24
1.4. Медицинские работники и проблема носительства вируса гепатита С с иммунологических позиций 31
Резюме к главе 1 37
Глава 2. Материал и методы исследования 39
2.1. Общая характеристика исследуемых групп 39
2.2. Методы исследования 44
2.2.1. Анкетирование 44
2.2.2. Определение маркеров вирусных гепатитов 44
2.2.3. Стандартные лабораторные методы исследования 45
2.2.4. Иммунологические методы исследования 46
2.3. Статистическая и математическая обработка данных 49
Глава 3. Эпидемиологический анализ и данные общеклинического лабораторного исследования медицинских работников, контактирующих и не контактирующих с вирусом гепатита С 51
3.1. Эпидемиологическая характеристика медицинских работников, контактирующих с вирусом гепатита С 51
3.2. Гематологический статус медицинских работников, контактирующих и не контактирующих с больными вирусным гепатитом С 53
3.3. Биохимические показатели крови медицинских работников, контактирующих и не контактирующих с больными вирусным гепатитом С 67
Резюме к главе 3 79
Глава 4. Иммунный статус медицинских работников, контактирующих и не контактирующих с вирусом гепатита С 81
4.1. Анализ базовых иммунограмм медицинских работников, контактирующих с вирусом гепатита С 81
4.2. Активация Т-лимфоцитов, формирования пула регуляторных Т-клеток, цитотоксичность естественных киллеров у медицинских работников, контактирующих и не контактирующих с вирусом гепатита С 88
4.3. Спонтанная и индуцированная пролиферация Т-лимфоцитов и естественных киллеров у медицинских работников, контактирующих и не контактирующих с вирусом гепатита С 95
Резюме к главе 4 111
Глава 5. Иммунный статус медицинских работников, контактирующих с вирусом гепатита с, и больных вирусным гепатитом С 114
5.1. Анализ информативных показателей иммунного статуса у медицинских работников, контактирующих с вирусом гепатита С, и у реконвалесцентов после острого гепатита С 114
5.2. Анализ информативных показателей иммунного статуса у медицинских работников, контактирующих с вирусом гепатита С, и у больных хроническим гепатитом С 118
5.3. Обобщение иммунологических характеристик медработников, контактирующих с вирусом
гепатита С, и групп сравнения по полу и возрасту,
обсуждение результатов 148
Резюме к главе 5 158
Заключение и обсуждение 160
Выводы 173
Практические рекомендации 175
Список литературы
- Иммунофенотипы и особенности развития острой и хронической ВГС-инфекции
- Стандартные лабораторные методы исследования
- Биохимические показатели крови медицинских работников, контактирующих и не контактирующих с больными вирусным гепатитом С
- Спонтанная и индуцированная пролиферация Т-лимфоцитов и естественных киллеров у медицинских работников, контактирующих и не контактирующих с вирусом гепатита
Иммунофенотипы и особенности развития острой и хронической ВГС-инфекции
Начало изучения вирусного гепатита С было положено в 1975 году, когда в публикациях впервые появился термин «гепатит ни А ни В», описывающий еще не известную в то время нозологическую форму [82]. Пятнадцать лет спустя в 1989 году был клонирован и секвенирован геном вирусного возбудителя этого заболевания [63], который был отнесен к семейству Flaviviridae, а сама инфекция получила название вирусного гепатита С с трансфузионным механизмом передачи [43, 110].
К настоящему времени в мире насчитывается около 130-170 миллионов человек с клиническими проявлениями этой инфекции [46, 97, 138, 139]. В среднем пораженность населения вирусом гепатита С (ВГС) составляет около 2%-3%, а в Африке, на Среднем Востоке, в Юго-Восточной Азии даже выше [46, 100, 139, 168]. В России определение частоты встречаемости инфицирования ВГС показывает цифру не менее 2 миллионов человек [11, 78].
В нашей стране современные подходы к особенностям эпидемиологии вирусного гепатита С были сформулированы к началу 90-х годов [6, 7, 18]. К этому времени было установлено, что вирусному гепатиту С присущи существенно более низкая интенсивность эпидемического процесса среди населения в целом по сравнению с вирусным гепатитом В и отличие структуры путей передачи возбудителя от таковой при гепатите В (значительно большая доля искусственных путей передачи), редкое вовлечение в эпидемический процесс детей 1-14 лет и взрослых старше 30 лет, высокая частота инфицирования лиц, получавших кровь и ее препараты, а также имевших в анамнезе массивные медицинские и немедицинские манипуляции, в том числе инъекции психотропных препаратов, более частое, чем при вирусном гепатите В, формирование хронических вариантов инфекции [19].
Позднее с внедрением методов молекулярной эпидемиологии удалось уточнить превалирующие генетические варианты вируса гепатита С, циркулирующие в стране. В основном, такими субтипами вируса оказались 1b и 3a, значительно реже выявлялись субтипы вируса, относящиеся к генотипам 2 и 4 [13]. Были получены четкие доказательства нарастающей эпидемиологической роли субтипа 3a, связанной с увеличением заражений при инъекционном употреблении психотропных препаратов [31, 121, 174]. В то же время, доминирующим генетическим вариантом вируса при заражении в медицинских учреждениях являлся субтип 1b [8, 10].
ВГС передается в основном при контакте с инфицированной кровью. Причиной заражения в большинстве случаев служат хирургические вмешательства, переливания крови, использование внутривенных наркотических препаратов, лечение у стоматолога, тату-процедуры и др. [194]. Среди путей заражения называют инъекции нестерильными иглами, гемодиализ, повреждения кожных покровов иглами и острыми краями инструментов, передача со слюной (укусы), реже – перинатальный путь и половые контакты. В связи с этим в группы риска входят наркоманы, заключенные тюрем; медицинские работники, работающие в контакте с иглами, острыми инструментами; реципиенты донорской крови (когда не проводится скрининг); реципиенты донорской крови, получающие множественные трансфузии; больные гемофилией, получавшие трансфузии факторов свертывания (когда не проводился скрининг и обеззараживание) [218]. К числу субъектов с высоким риском заражения вирусным гепатитом С относятся больные талассемией [152], пользователи внутривенных препаратов [40], пациенты на гемодиализе [41], пациенты, перенесшие пересадку органов [3]. Иными словами, проблема внутрибольничного заражения вирусным гепатитом С остается довольно острой [180]. Примерно у 50%инфицированных факторы риска заражения установить не удается (так называемые "спорадические" случаи) [218].
Итак, переливания крови и ее препаратов являются основной причиной ВГС-инфекции, однако введение скрининга крови значительно уменьшает риск заражения. Имеющиеся в настоящее время тест-системы в 100% случаев выявляют инфицированных доноров [228]. Препараты факторов свертывания проходят обеззараживание путем нагревания паром [53, 218], тем не менее риск инфицирования, будучи минимальным, неизбежно увеличивается при массивных гемотрансфузиях. По-прежнему остается большим число больных ХГС среди реципиентов донорской крови (в том числе больных гемофилией), инфицированных в клиниках, где тестирование крови не проводится. Примерно 25% лиц, инфицированных ВГС, в анамнезе имеют указания на переливания крови [218].
Инфицирование ВГС в отделениях гемодиализа также может иметь место [59, 129], однако риск заражения снизился благодаря строгому контролю оборудования и скринингу больных на антитела к ВГС.
Распространенность вирусного гепатита С среди наркоманов очень высока – 70-90%. Этот путь передачи представляет собой наибольшую опасность в распространении ВГС [3, 115]. Дело в том, что именно среди этой группы больных вирусным гепатитом С отмечена самая низкая эффективность противовирусной терапии, обусловленная, в первую очередь, низкой приверженностью лечению [160]. При этом в эпидемический процесс гепатита С интенсивно вовлекается молодое трудоспособное население: среди заболевших преобладают лица в возрасте от 15 до 30 лет, на долю которых приходится около 90% заболевших. Молодые люди в возрасте до 30 лет, употреблявшие наркотики, составляют (по данным формы Госстатучета №2) значительную часть летальных исходов (до 42%), обусловленных одновременным инфицированием ВГВ, ВГС, ВИЧ.
Стандартные лабораторные методы исследования
ВГС содержит одноцепочечную РНК, упакованную в малый по размеру (50нм) белковый конверт. Проникновение вируса в клетку представляет собой сложный многоступенчатый процесс. Первоначально вирус связывается с гликозаминогликанами (GAGs) и рецептором липопротеинов низкой плотности (LDLR) на поверхности клетки, после чего последовательно происходит взаимодействие с четырьмя факторами проникновения: скавенджер-рецептором класса В первого типа (SR-BI), тетраспанином CD81, клаудином 1 (CLDN-1) и окклюдином (OCLDN) [103]. После проникновения в клетку и раздевания вируса происходит его репликация.
Геном ВГС представлен одноцепочечной РНК, которая не обладает способностью встраиваться в геном клетки-мишени хозяина, благодаря чему процессы вирусной репликации проходят в цитоплазме гепатоцитов. РНК участвует в репликации ВГС, а также в процессах трансляции с последующим синтезом вирусных белков, прикрепляясь через определенный сайт к IRES-области рибосом [5, 147, 216]. ВГС транслируется как полипептид и лишь на следующем этапе подвергается процессингу вирусными и человеческими протеазами до 3-х структурных и 7 неструктурных белков [147, 185, 216].
Структурные белки включают сердцевинный белок (core), гликопротеины E1 и E2. Сердцевинный белок участвует в формировании вирусного нуклеокапсида, имеющего множество регуляторных функций и играющего решающую роль в развитии стеатоза печени и гепатоцеллюлярной карциномы при данной инфекции [86, 205, 216, 260]. Он обладает способностью влиять на развитие клеточного апоптоза [64, 127], может ингибировать Т-лимфоцитарные функции в ходе иммунного ответа [256, 257], подавляет транскрипцию генов интерферона [72, 114, 161, 248] как ключевого механизма противовирусной защиты [123, 207, 208].
Е1 и Е2 формируют функциональные свойства конверта, обеспечивая проникновение вируса в клетку в виде нековалентно связанного гетеродимерного комплекса Е1/Е2 [101, 186, 216, 219, 245], присоединяющегося к тетраспанину (CD81) и другим белкам на гепатоцитах, а также лимфоцитах человека [5, 49, 66, 243]. Е2 гликопротеин содержит, как минимум 2 гипервариабельных сайта, способствующих формированию изменчивости ВГС в ходе инфекционного процесса и изменяющих качество врожденного и адаптивного иммунного ответа на вирус [93, 234].
Е2 может вступать во взаимодействие с CD81 на поверхности В-лимфоцитов, способствуя активации этих клеток и помогая В-Т-клеточной кооперации путем индукции адгезивных рецепторов [142]. В то же время растворимая форма этого же антигена вызывает агрегацию лимфоидных клеток и угнетение В-клеточной пролиферации [87]. По-видимому, этот механизм преобладает при носительстве ВГС, при котором отмечается выраженный дефицит В-клеточной популяции [264].
Гликопротеид конверта Е2 ВГС ингибирует естественные киллеры (ЕК) печени, и это способствует хронизации инфекционного процесса [35]. Детальное изучение эффекторных реакций ЕК показало, что при ХГС наблюдается дихотомия – рост цитотоксической активности ЕК и нарушение их цитокинпродуцирующих свойств [171].
Неструктурные белки p7, NS2, NS3, NS4А, NS4В, NS5А, NS5В ВГС вовлечены в процессы репликации вирусного генома, а белок р7 участвует в формировании вирусных частиц [117, 185, 216]. С функцией NS5A и NS5B в составе единого комплекса связана репликативная функция геномной РНК [121, 148]. С биологическими свойствами белка NS3, стимулирующего клеточные функции, связан механизм злокачественной опухолевой трансформации гепатоцитов, вызываемый ВГС, но при взаимодействии с NS4A он, наоборот, выполняет свойства ингибитора клеточного роста [252]. Внутриклеточное воздействие такого неструктурного белка ВГС как NS4B осуществляется в виде влияния на процессы самосборки вирионов и одновременно в форме индукции повреждения внутриклеточного мембранного аппарата, в частности, мембран эндоплазматической сети [98]. Вероятно, этот механизм лежит в основе высвобождения вирионов из клетки, тем более, что ВГС присущи прямые цитопатические эффекты [12, 25]. Влияние на репликацию вируса в сочетании с разнообразными воздействиями на пораженную клетку свойственно и NS5A-белку ВГС, который регулирует клеточный рост, усиливает апоптоз, способствует персистенции вируса [83, 149].
Неструктурные белки обсладают разнообразными иммунотропными эффектами. NS3-белок обладает свойством ингибировать интерферон-реактивный фактор-3 (IRF-3) и нарушать, таким образом, интерферонопродуцирующую функцию гепатоцитов, инфицированных этим вирусом [173, 184]; способностью воздействия на сигнальные пути интерферона обладает и другой неструктурный белок ВГС – NS5A [126, 149, 201].
Белок NS3, стимулируя фагоциты, приводит к бурной продукции активных кислородных радикалов, оксидативному стрессу, что способно индуцировать нарушение функций лимфоциов и их апоптоз, однако, эти же эффекты препятствуют канцерогенезу [92]. Было установлено, что одинаковые иммунодоминантные эпитопы неструктурного белка NS3 часто выступают мишенью обусловленного Т-хелперами (CD3+CD4+) клеточного ответа [77, 108].
Биохимические показатели крови медицинских работников, контактирующих и не контактирующих с больными вирусным гепатитом С
Таким образом, анализ базовых иммунограмм показал, что иммунный статус медицинских работников, контактирующих с ВГС, в целом не отличался от такового в контрольной группе. В то же время использование половозрастного принципа деления медицинских работников на подгруппы показал, что как у мужчин, так и у женщин различных возрастных категорий возможно зарегистрироовать некоторые отличия у контактных лиц по таким показателям как абсолютное число Т-лимфоцитов, абсолютное число Т-хелперов, относительное и абсолютное число естественных киллеров.
Учитывая эти особенности, дальнейшее углубленное исследование иммунного статуса было направлено на получение более детальных характеристик процессов активации и регуляции функций Т-клеток и ЕК, а также способности Т-лимфоцитов, их субпопуляций и естественных киллеров к спотанной и индуцированной (ФГА и вирусами 1b, 2а-3а) пролиферации.
Активация Т-лимфоцитов, формирование пула регуляторных Т-клеток, цитотоксичность естественных киллеров у медицинских работников, контактирующих и не контактирующих с вирусом гепатита С
Процессы активации Т-лимфоцитов анализировались на основе определения уровня экспрессии маркера активации этих клеток – CD25 (-цепь рецептора к ИЛ-2). Исследовались два уровня экспрессии этого маркера – умеренный, соответствующий фенотипу CD3+CD25+, и высокий с фенотипом CD3+CD25high. Поскольку содержание этих клеток в крови невелико, оно выражалось их процентом от общего числа Т-лимфоцитов.
Характеристика пула регуляторных Т-клеток (Трег) в крови изучалась путем определения их внутриклеточного маркера – FoxP3. При этом характеризовалась субпопуляция этих клеток в целом (CD3+FoxP3+), а также варианты Трег, формирующиеся путем перепрограммирования Т-лимфоцитов в процесс их активации (CD3+CD25+FoxP3+ и CD3+CD25highFoxP3+).
Что касается функционального состояния естественных киллеров, то оно изучалось на основе экспрессии внутриклеточного маркера цитолитических гранул этих клеток – CD107a, что количественно определялось процентом CD56+CD107a+ клеток среди всех ЕК. Высокий уровень экспрессии указанного маркера характеризовал потенциальную способность ЕК проявлять цитотоксические свойства.
Результаты подобных сравнительных исследований в группах медицинских работников, контактировавших и не контактировавших с больными вирусным гепатитом С, представлены в таблице 8 и на рисунке 34. В последнем показаны результаты расчета коэффициентов отклонения данных контактных лиц от контрольных значений.
Как следует из таблиц и рисунка, процессы активации Т-клеток в крови медицинских работников, контактирующих с ВГС, были в значительной мере угнетены по сравнению с контролем. Таблица 8. Показатели активации и регуляции Т-лимфоцитов и ЕК в крови медицинских работников, контактирующих и не контактирующих с больными вирусным гепатитом С
Особенно выраженно снижение числа клеток проявилось на уровне клеток с высоким уровнем эксперессии CD25. В значительной степени у этих субъектов было снижено присутствие в крови всех категорий регуляторных Т-клеток. Что же касается ЕК, то цитотоксические потенции этих лимфоцитов не различались у медработников, контактирующих и не контактирующих с ВГС. Определение гетерогенности по показателям активации и регуляции Т-лимфоцитов показало некоторую зависимость уровня экспрессии соответствующих маркеров от пола и возраста медработников, как это представлено в таблице 9, при отсутствии такой зависимости со стороны естественных киллеров.
Примечание: n – число медицинских работниках в подгруппах по полу и возрасту; F – критерий Фишера в группах медработников; р – вероятность различий по полу или возрасту в группах медработников; голубым цветом показана достоверность различий по критерию Фишера при р 0,05. Анализ характера выявленной зависимости практически по всем категориям Т-клеток проводился на основе определения 95% доверительного интервала каждого показателя и построения ROC-кривых.
На рисунке 35 этот анализ проведен для числа CD3+CD25+ лимфоцитов. Из рисунка видно, что только у мужчин старше 40 лет и у женщин моложе 40 лет существуют достоверные различия по числу активированных Т-лимфоцитов между медработниками, контактирующими и не контактирующими с ВГС. В первом случае доля этих клеток среди Т-лимфоцитов с абсолютной точностью тестирования была ниже 40%, а во стором – выше 20%, чего не наблюдалось в контроле.
Несколько иная зависимость от половозрастных характеристик отмечалась для числа клеток с высоким уровнем экспрессии CD25 (рисунок 36). В этом случае диагностически значимым было повышение числа этих клеток выше 0,3% у мужчин 40 лет и старше и падение ниже 0,15% в подгруппе женщин 40 лет и старше (AUROC = 1,0). моложе 40 лет
Спонтанная и индуцированная пролиферация Т-лимфоцитов и естественных киллеров у медицинских работников, контактирующих и не контактирующих с вирусом гепатита
Инкубирование лимфоцитов в присутствии антигенов ВГС lb действовало на пролиферативный эффект Т-клеток и ЕК более избирательно.
В частности, коэффициент пролиферации Т-хелперов в данной тест-системе выявлял особенности медработников, контактирующих с больными вирусным гепатитом С, только у лиц в возрасте 40 лет и старше, как это видно на рисунке 49. При этом во всех случаях пролиферативная активность Т-хелперов у контактных лиц была выше, чем в контроле. У мужчин в этой возрастной подгруппе значения КП превышали 3,5% при AUROC = 1,0, что говорило в пользу очень высокой диагностической точности этого теста. У женщин 40 лет и старше разграничетельное значение КП для основной и контрольной группы были ниже и проявлялось в диапазоне выше 1% для контактных лиц при умеренной диагностической значимости (AUROC = 0,750). У мужчин и женщин более молодого возраста КП Т-хелперов не был информативным.
Коэффициент пролиферации ЦТЛ под влиянием антигенов ВГС 1b возрастал достоверно (AUROC = 0,722) выше 2% у женщин моложе 40 лет, а в остальных половозрастных подгруппах этот показатель как дифференциальный критерий был неинформативен (рисунок 50).
Пролиферативная активность естественных киллеров в присутствии антигенов ВГС 1b у медработников, контактирующих с вирусом, испытывала разнонаправленные влияния в подгруппах, различных по полу и возрасту (рисунок 51). У мужчин моложе 40 лет и в более старшем возрасте она была ниже 2% при высокой диагностической точности теста (AUROC, соответственно, 0,933 и 1,0), у женщин моложе 40 лет не отличалась от контроля (AUROC = 0,528), а у женщин 40 лет и старше была выше 8% с абсолютной диагностической точностью (AUROC = 1,0).
Т-хелперы медработников, контактирующих с ВГС, реагировали на его антигены генотипов 2а-3а во всех подгруппах, кроме мужчин моложе 40 лет, у которых AUROC = 0,6 (рисунок 52). У мужчин старше 40 лет разница между этим показателем в основной и контрольной группах была абсолютно значима (AUROC = 1), при этом у контактных лиц отмечались преимущественно величины КП 4%. У женщин моложе 40 лет это был диапазон значений коэффициента пролиферации выше 3%, а в возрасте 40 лет и старше – выше 1% при AUROC, равном, соответственно, 0,722 и 0,833.
Коэффициенты пролиферации ЦТЛ в присутствии ВГС 2а-3а, хотя и имели в большинстве случаев тенденцию к снижению, но c позиций диагностической точности оказались неинформативными, как это наглядно представлено на рисунке 53, поскольку величины AUROC в тестированных половозрастных группах колебались в пределах 0,625-0,667.
Таким образом, определение спонтанной и индуцированной пролиферации Т-лимфоцитов и естественных киллеров в крови медицинских работников, контактирующих с больными вирусным гепатитом С, оказалось наиболее информативным тестом при определении иммунологических особенностей этого контингента. Как и другие лабораторные признаки, результаты этой серии исследований зависели от пола и возраста.
Резюме к главе 4:
1. Иммунный статус медицинских работников, контактирующих с ВГС, по базовым иммунограммам не отличался от такового в контрольной группе, однако некоторые отличия по содержанию Т-лимфоцитов в целом, Т-хелперов и естественных киллеров регистрировались у женщин различных возрастных категорий.
2. У медицинских работников, контактирующих с ВГС наблюдается снижение активационных процессов в системе Т-лимфоцитов, более выраженное у женщин, у которых отмечено еще и падение числа регуляторных Т-клеток с супрессорной активностью.
3. У медработников, контактирующих с ВГС, происходит общее снижение пролиферативного потенциала клеток иммунной системы, особенно, у естественных киллеров, которое проявляется снижением коэффициентов пролиферации Т-клеток и ЕК по сравнению с контролем при инкубировании с фитогемагглютинином.
4. У медработников, контактирующих с ВГС, отмечен феномен различия в способности субпопуляций Т-лимфоцитов отвечать пролиферацией на антигены ВГС различных генотипов: на ВГС 1b отвечают преимущественно ЦТЛ (CD3+CD8+),на ВГС 2а-3а – Т-хелперы (CD3+CD4+).
5. Особенности спонтанного и индуцированного пролиферативного ответа Т-клеток и естественных киллеров у медработников, контактирующих с ВГС, как и прочие иммунологические особенности, зависели от пола и возраста, как это показано в таблице 12.
Интерпретация полученных данных требует учета нескольких обстоятельств. Во-первых, в основную группу медработников, контактирующих с ВГС, входили клинически здоровые лица, чем они принципиально отличались от больных с острой инфекционной патологией. Во-вторых, иммунный статус больных острым гепатитом С исследовался в период реконвалесценции, что, несомненно, наложило свой отпечаток на характер иммунологических сдвигов. Третье и очень важное обстоятельство – у всех тестированных больных группы сопоставления острый гепатит С закончился полной элиминацией возбудителя.
Если у медработников, контактирующих с ВГС, основные отклонения от контроля проявлялись низким уровнем процессов активации, сопровождаюшимся падением числа регуляторных Т-клеток, высоким уровнем спонтанной и индуцированной вирусными антигенами пролиферативной активности Т-лимфоцитов и естественных киллеров, сниженной способности этих клеток к митоген-индуцированной пролиферации, то у больных ВГС изменения носили совершенно иной характер. Иммунологическая составляющая инфекционного процесса у больных ОГС в период реконвалесценции характеризовалась преобладанием в крови естественных киллеров, высоким числом регуляторных клеток, наличием спонтанной и вирус-индуцированной пролиферативной реакции со стороны преимущественно Т-лимфоцитов (Т-хелперов и ЦТЛ) при сохранении их способности отвечать на митоген (ФГА).
Таким образом, проявления иммунного ответа на острую ВГС-инфекцию на стадии реконвалесценции принципиально отличались от иммунного статуса медицинских работников, контактирующих с больными вирусным гепатитом С, и лишний раз показывали основные особенности последнего – отсутствие активационных процессов и механизма восполнения пула регуляторных Т-клеток, выраженная пролиферативная реакция Т-лимфоцитов и, в меньшей степени, ЕК на вирусные антигены на фоне резкого снижения способности к митоген-индуцированной пролиферации.
