Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 16
ГЛАВА I. Паттерн-распознающие рецепторы врожденного иммунитета 16
1.1. Характеристика паттерн-распознающих рецепторов 1-6
1.2. Характеристика Toll-подобных рецепторов
1.2.1. Строение Toll-подобных рецепторов 32
1.2.2. Функции Toll-подобных рецепторов 34
1.2.3. Сигнальные пути Toll-подобных рецепторов 38
1.2.4.Экзогенные лиганды Toll-подобных рецепторов 44
1.2.5.Эндогенные лиганды Toll-подобных рецепторов 50
1,2.6.Эндогенные лиганды в патогенезе заболеваний человека 65
1.2.7.Роль Toll-подобных рецепторов в развитии патологии 68
Toll-подобные рецепторы при иммунодефицитных заболеваниях 69
Toll-подобные рецепторы в развитии сердечно-сосудистых заболеваний 74
Toll-подобные рецепторы в развитии острого панкреатита 83
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 89
2.1. Характеристика групп обследованных больных 89
2.2. Реактивы 94
2.3. Методы исследования 96
2.3.1 .Оценка эффекторной функции TLR 96
Выделение МНК из периферической крови человека 96
Культивирование МНК периферической крови человека 96
2.3.2. Определение концентрации цитокинов в культуральных супернатантах методом иммуноферментного анализа 99
2.3.3.Оценка экспрессии TLR на моноцитах периферической крови 101
2.3.4.0ценка экспрессии мРНК TLR в МНК периферической крови 104
2.3.4.1. Методы выделения РНК из МНК 104
2.3.4.2.Проведение реакции обратной транскрипции 106
2.3.4.3.Постановка ПНР в реальном времени, метод AAct 106
2.3.5. Статистическая обработка результатов 112
Результаты и обсуждение 114
ГЛАВА III. Оценка эффекторной функциональной активности TLR на МНК периферической крови человека 114
3.1. Определение эффекторной функциональной активности TLR по выработке ФНОа 114
3.2.Исследование влияния лигандов TLR на выработку ИФНа МНК здоровых людей 124
3.3 Оценка эффекторной функции TLR у здоровых людей разных возрастных групп 127
ГЛАВА IV. Анализ системы TLR у больных первичными иммунодефицитами 130
4.1 .Оценка эффекторной функции TLR на МНК больных с дефектами антителообразования 130
4.1.1. Определение спонтанной продукции ФНОа МНК периферической крови больных ОВИН и Х-АГГ 131
4.1.2.Определение стимулированной лигандами TLR продукции ФНОа МНК больных ОВИН и Х-АГГ 133
4.1.3.Исследование влияния лигандов Toll-подобных рецепторов на выработку ИФНа МНК больных ПИД с дефектами
антителообразования 140
4.1.4.Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхности моноцитов периферической крови больных ПИД с дефектами
антителообразования 143
4.1.5.0ценка экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в МНК периферической крови больных ПИД с дефектами антителообразования 148
4.2,Оценка показателей системы TLR в МНК периферической крови детей с нейтропенией 153
4.2.1.Определение эффекторной функции TLR на МНК периферической крови больных нейтропенией 153
4.2.2.Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхности моноцитов периферической крови больных нейтропенией 160
ГЛАВА V. Анализ системы TLR в МНК периферической крови больных при острых патологических состояниях, сопровождающихся деструкцией ткани 162
5.1.Оценка компонентов системы TLR у больных острым инфарктом миокарда 163
5.1.1.Оценка эффекторной функции TLR2 и TLR4 на МНК больных острым инфарктом миокарда 163
5.1.2. Изучение влияния rHSP70 на функциональную активность TLR4 на МНК здоровых доноров и больных ОИМ 167
Исследование совместного действия лигандов TLR2 и TLR4 на выработку ФНО а МНК здоровых доноров in vitro 169
5.1.3. Особенности TLR индуцированной выработки ФНОа МНК у отдельных больных ОИМ в динамике заболевания 172
5.1.4.Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных острым инфарктом миокарда 174
5.2.Оценка компонентов системы TLR в мононуклеарных клетках периферической крови больных острым деструктивным
панкреатитом 177
5.2.1.Оценка эффекторной функции TLR2 и TLR4 у больных ОДП в динамике заболевания 178
5.2.1.1.Определение спонтанной выработки провоспалительных цитокинов у больных ОДП 178
Изучение влияния препарата Лорноксикам на опосредованную TLR 1/2 и TLR 4 выработку провоспалительных цитокинов МНК здоровых доноров in vitro 182
5.2.1.2.Определение спонтанной выработки провоспалительных цитокинов у больных, получающих Лорноксикам 185
Определение индуцированной лигандами TLR2 и TLR4 выработки провоспалительных цитокинов МНК больных ОДП. 189
5.2.2.Оценка экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОДП в динамике заболевания 194
5.2.3. Анализ экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в мононуклеарных клетках больных ОДП 196
5.2.4.Изменения показателей в системе TLR у больных ОДП с развитием гнойно-деструктивных осложнений 205
ГЛАВА VI. Заключение 221
Выводы 244
Список литературы
- Сигнальные пути Toll-подобных рецепторов
- Культивирование МНК периферической крови человека
- Определение спонтанной продукции ФНОа МНК периферической крови больных ОВИН и Х-АГГ
- Особенности TLR индуцированной выработки ФНОа МНК у отдельных больных ОИМ в динамике заболевания
Введение к работе
Актуальность исследования. Изучение механизмов врожденного иммунитета в настоящее время является одной из актуальных проблем современной фундаментальной и клинической иммунологии. В 90-х годах XX столетия Ch. Janeway и R. Medzhitov выдвинули гипотезу о том, что врожденный иммунитет обладает определенной специфичностью к чужеродным антигенам. Ключевыми рецепторами врожденного иммунитета являются сигнальные паттерн распознающие рецепторы (ПРР) - Toll-подобные рецепторы (TLR) [Ковальчук Л.В.,2005; Medzhitov R., Janeway Ch., 1997]. За последние 20 лет достигнуты впечатляющие успехи в изучении роли TLR во врожденном и адаптивном иммунитете, что позволило совершенно по-новому взглянуть на природу иммунных процессов в организме. TLR распознают высоко консервативные структуры патогенных микроорганизмов, так называемые паттерны, ассоциированные с микроорганизмами (pathogen-associated molecular patterns – PAMP). Различные макромолекулы служат микробными лигандами для TLR, включая липиды, углеводы, белки и нуклеиновые кислоты. К наиболее известным лигандам TLRs экзогенного происхождения относятся компоненты клеточной стенки бактерий: пептидогликаны (ПГ), липополисахариды (ЛПС); флагеллин, ДНК микроорганизмов, вирусная РНК и многие другие. В настоящее время показано, что лигандами для TLR могут также являться эндогенные молекулы, высвобождающиеся в результате некроза клеток и массивной деструкции тканей, а также распада молекул внеклеточного матрикса. Такие лиганды получили обозначение как «сигналы опасности» или DAMP (damage-associated molecular pattern). К эндогенным активаторам TLR относятся белки теплового шока - HSP60, HSP70, фибронектин, b-дефензин и многие другие [Tsan Min-Fu, Gao Baochong, 2004; Bianchi M. E. et al., 2007; Erridge С. et al., 2010]. Распознавание экзогенных и эндогенных лигандов TLR инициирует активацию сигнальных путей, в результате чего происходит экспрессия генов цитокинов, костимуляторных молекул, противомикробных пептидов и других молекул. Продукты этих генов контролируют систему врожденного иммунитета и в дальнейшем направляют развитие адаптивного иммунного ответа [Ковальчук Л.В., 2007; Хаитов Р.М., Ярилин А.А., 2011; Hoebe K. et al.,2003; Akira S.,Takeda K.,2004; Parker L.C.,2007; Uematsu S, Akira S. et al., 2007; Kawai T, Akira S., 2010]. Интенсивность ответа и его направленность в дальнейшем определяются несколькими компонентами, составляющими систему TLR. Система TLR включает лиганды активирующие TLR, сами рецепторы, молекулы, осуществляющие трансдукцию сигнала – адапторные белки, а также эффекторные молекулы, которые вырабатываются в результате активации TLR и опосредуют их дальнейшие эффекты [Ковальчук Л.В., 2007]. Дефекты в системе TLR: нарушения распознавания лигандов, экспрессии TLR, трансдукции сигнала, выработки эффекторных молекул, а также полиморфизм генов TLR могут приводить к развитию тяжелых инфекций, аутоиммунных заболеваний, атеросклероза, аллергопатологии и других заболеваний [Cook D.N., Pisetsky D.S.,2004; Sandor F., Buc.M.,2005; Li Liwu,2004, Ulevitch R.J.,2004; MonteroVega M.T.,2009]. Количество патологий с нарушениями в системе TLRs растет.
Первичные иммунодефициты (ПИД) с дефектами антителообразования, такие как общая вариабельная иммунологическая недостаточность - ОВИН и Х-сцепленная агаммаглобулинемия - Х-АГГ характеризуются частыми реккурентными бактериальными инфекциями. Нарушения, выявляемые при ОВИН, вызваны множественными дефектами иммунной системы, и на данный момент нет единого мнения о молекулярных механизмах этих нарушений. В последнее время в литературе появляются данные о дефектах созревания антигенпрезентирующих клеток у больных ОВИН [Bayry. J.,2004; Cunningham-Rundles C. et al.,2005; Yong P.F.et al.,2008]. Изучение механизмов функционирования врожденной иммунной системы, оценка состояния компонентов системы TLR у больных ПИД с дефектами антителообразования позволит прояснить иммунопатогенез ОВИН, оценить вклад механизмов врожденного иммунитета в развитие и тяжесть течения инфекций и других осложнений.
Со времени открытия TLR представление о них как о структурах, участвующих только в противоинфекционной защите, существенно видоизменилось. При многих воспалительных заболеваниях, сопровождающихся массивной клеточной деструкцией таких, как инфаркт миокарда, острый панкреатит, происходит высвобождение большого количества эндогенных лигандов, что приводит к активации сигнальных путей TLR. Иногда высвобождаемые DAMP связывают с так называемым “стерильным воспалением”, которое развивается в ответ на травму, ишемию, массивное тканевое повреждение при отсутствии патогенной инфекции и сопровождается высокой выработкой провоспалительных цитокинов. Чрезмерная активация TLR и выработка неконтролируемого количества провоспалительных цитокинов могут способствовать развитию системной воспалительной реакции, дальнейшему повреждению тканей, формированию осложнений основного заболевания [Ковальчук Л.В., 2008]. Исследование системы TLR имеет важное значение в понимании патогенеза заболеваний, сопровождающихся деструкцией ткани.
Для выявления дефектов, связанных с нарушением функционирования системы TLR, необходимы надежные методы. Комплексное исследование системы TLR при различных заболеваниях позволит оценить роль механизмов врожденного иммунитета в развитии патологии. Выявление нарушений в системе Toll-подобных рецепторов способствует проведению более точной своевременной диагностике, прогнозированию характера течения заболевания, дает возможность изучить патогенетические аспекты развития патологии, а также научно обосновать и разработать новые подходы адекватной терапии.
Цель исследования: разработать аналитический подход комплексной оценки компонентов системы распознающих рецепторов врожденного иммунитета - Toll-подобных рецепторов, основанный на определении эффекторной функциональной активности, экспрессии молекул TLR и уровня экспрессии мРНК TLR у здоровых людей, больных с иммунодефицитами и у больных при острых заболеваниях, сопровождающихся деструкцией ткани, оценить возможность использования выявленных изменений в качестве маркеров прогноза течения заболевания.
Задачи исследования:
1.Разработать подход комплексной оценки системы Toll-подобных рецепторов на уровне экспрессии генов, белков и секретируемых молекул, опосредующих эффекторную функциональную активность TLR на мононуклеарных клетках периферической крови человека.
2.Разработать метод и провести оценку эффекторной функциональной активности TLR на мононуклеарных клетках (МНК) периферической крови in vitro у здоровых людей различной возрастной категории (взрослые здоровые доноры, дети).
3.Провести анализ системы Toll-подобных рецепторов у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования. Определить эффекторную функциональную активность TLR2 и TLR4, их экспрессию на поверхности моноцитов, а также уровень экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК периферической крови больных общей вариабельной иммунологической недостаточностью - ОВИН и Х-сцепленной агаммаглобулинемией – X-АГГ.
4.Оценить значимость выявленных изменений экспрессии и функционирования TLR для развития клинических проявлений у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования.
5.С помощью разработанного подхода проанализировать состояние TLR на МНК периферической крови больных при острых заболеваниях, сопровождающихся деструкцией ткани (острый инфаркт миокарда, острый деструктивный панкреатит) в динамике.
6.Определить диагностическую значимость выявленных изменений уровня экспрессии мРНК TLR, экспрессии молекул рецепторов на поверхности клеток и эффекторной функциональной активности TLR у больных острым инфарктом миокарда и острым деструктивным панкреатитом.
7.Оценить возможность использования показателей, характеризующих состояние системы TLR, в качестве маркеров прогноза течения и исхода заболевания
Научная новизна работы
В работе впервые представлен комплексный подход к оценке системы Toll-подобных рецепторов, заключающийся в поэтапном исследовании и анализе эффекторной функциональной активности TLR, экспрессии молекул TLR и уровне экспрессии мРНК TLR МНК периферической крови человека.
Работа содержит новые данные о вовлечении механизмов врожденного иммунитета в патогенез ОВИН. Обнаружены дефекты в системе Toll-подобных рецепторов у больных ПИД с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ). Показано, что при данных ПИД нарушена эффекторная функциональная активность TLR2 и TLR4 на МНК, определяемая по выработке ФНОa в ответ на стимуляцию соответствующими лигандами этих рецепторов. Выявлен дисбаланс TLR4-опосредованной выработки ФНОa и ИФНa МНК больных ОВИН. Сниженная эффекторная функциональная активность TLR2 и TLR4 и низкие значения экспрессии этих молекул у больных ОВИН сопровождаются повышенной частотой развития инфекций.
Впервые на основе нарушения функционирования системы TLR определены прогностические критерии развития неблагоприятного исхода острого инфаркта миокарда. Показано, что повышение функциональной активности и экспрессии TLR2 и TLR4 на МНК у больных ОИМ к 14-м суткам может приводить к развитию осложнений основного заболевания.
Впервые проанализированы показатели системы TLR у больных острым деструктивным панкреатитом различной тяжести течения заболевания в динамике: эффекторная функциональная активность TLR2 и TLR4, экспрессия молекул на поверхности моноцитов и уровень экспрессии мРНК в МНК. Показано, что снижение экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 к концу 1-ой недели заболевания характерно для легкого течения, в то время как тяжелое течение ОДП сопровождается ростом уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в эти сроки.
Выявлены новые маркеры ранней диагностики неблагоприятного исхода острого деструктивного панкреатита, основанные на определении экпрессии мРНК TLR2 и TLR4, их эффекторной функциональной активности и определении содержания ИЛ-6 в сыворотке крови больных в 1-е сутки острого деструктивного пакреатита.
Установлено, что нестероидный противовоспалительный препарат - лорноксикам приводит к снижению индуцированной лигандами TLR2 и TLR4 выработки провоспалительных цитокинов МНК периферической крови здоровых доноров в культуре in vitro.
Впервые установлено, что применение лорноксикама в комплексном лечении больных ОДП на ранних сроках заболевания приводит к снижению TLR2 и TLR4-опосредованной выработки провоспалительных цитокинов, уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК у этих больных.
Практическая значимость работы
В данной работе разработан метод для оценки эффекторной функциональной активности TLR, основанный на определении индуцированной соответствующими лигандами TLR выработки провоспалительного цитокина - ФНО и ИФН МНК периферической крови человека. Проведена оценка выработки ФНОa и ИФНa МНК в ответ на лиганды TLR у здоровых людей различного возраста. Полученные данные позволяют оценить эффекторную функциональную активность рецепторов врожденного иммунитета у больных с иммунопатологией.
У больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) в ходе настоящего исследования обнаружены нарушения в системе рецепторов TLR на МНК: снижение эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4, снижение экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОВИН и нарушение экспрессии мРНК TLR2, TLR4 и TLR9 по сравнению со значениями здоровых доноров, что свидетельствует о новых молекулярных дефектах в системе врожденного иммунитета у больных ОВИН и позволяет уточнить иммунопатогенез ОВИН. Выявлены дефекты TLR2 и TLR4-опосредованной выработки ФНО и ИФН МНК, экспрессии этих рецепторов у больных Х-АГГ.
Выявлены новые маркеры развития осложнений у больных острым инфарктом миокарда. Показано, что увеличение эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4 и экспрессии этих рецепторов на моноцитах больных к 14-м суткам заболевания может служить диагностическим критерием развития осложнений ОИМ.
Низкие значения уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 и эффекторной функциональной активности этих рецепторов в 1 сутки острого деструктивного панкреатита с тяжелой формой течения в сочетании с высокими концентрациями ИЛ-6 в сыворотке крови могут рассматриваться в качестве ранних маркеров диагностики неблагоприятного исхода заболевания.
Обосновано применение нестероидного противовоспалительного препарата - лорноксикам в комплексном лечении больных острым деструктивным панкреатитом на ранних сроках заболевания. Лорноксикам приводит к снижению TLR2 и TLR4-опосредованной выработки провоспалительных цитокинов, уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК у больных на 3-и сутки заболевания и позволяет снизить риск развития системной воспалительной реакции.
Предложенный комплексный подход к оценке системы TLR открывает новые направления в раннем прогнозе течения заболевания и возможности проведения патогенетической коррекции.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработан аналитический подход комплексной оценки системы рецепторов врожденного иммунитета - Toll-подобных рецепторов, основанный на определении эффекторной функциональной активности TLR, экспрессии молекул и уровня экспрессии мРНК TLR мононуклеарными клетками человека.
2. Использование разработанного подхода позволило выявить нарушения в системе врожденного иммунитета у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) на уровне функционирования и экспрессии TLR2, TLR4 мононуклеарными клетками периферической крови.
3. Комплексное исследование системы TLR при заболеваниях, сопровождающихся деструкцией ткани (острый инфаркт миокарда, острый деструктивный панкреатит), позволило выявить активацию системы TLR на ранних сроках заболевания. Увеличение эффекторной функциональной активности и экспрессии TLR2 и TLR4 мононуклеарными клетками периферической крови в динамике заболевания может служить маркером развития осложнений острого инфаркта миокарда.
4.Определены ранние маркеры диагностики неблагоприятного исхода острого деструктивного панкреатита, основанные на выявлении крайне низких значений эффекторной функциональной активности TLR2 и TLR4 и экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК в сочетании с высокими концентрациями ИЛ-6 в сыворотке крови больных в 1-е сутки заболевания.
5. Использование нестероидного противовоспалительного препарата - лорноксикам в лечении больных острым деструктивным панкреатитом на ранних сроках заболевания приводит к снижению TLR2 и TLR4 - опосредованной выработки провоспалительных цитокинов и экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в МНК.
Внедрение результатов работы
Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры иммунологии Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова для студентов, аспирантов и ординаторов, используются в практической работе хирургических отделений ГКБ №55 г.Москвы.
Апробация результатов диссертационной работы
Материалы диссертационной работы докладывались на научных заседаниях кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России, в 2006 году на II Всероссийском конгрессе по детской аллергологии и иммунологии, в 2007 году на VI Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», в 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011 и 2012 году в Москве на XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», на Объединенном иммунологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008 г.), Европейском конгрессе педиатров (Москва, 2009 г.), III Всероссийском Конгрессе по детской аллергологии и иммунологии (Москва 2009 г.), IX Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2010 г.), XVIII международный Конгресс Хирургов - гепатологов стран СНГ «Актуальные проблемы Хирургической гепатологии» (Москва, 2011г.), XI Международный конгресс «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011г.).
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 45 печатных работ, в том числе 17 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 292 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 422 источника, из которых 87 отечественных и 335 зарубежных. Работа содержит 46 таблиц и 52 рисунка.
Сигнальные пути Toll-подобных рецепторов
TLRs являются важными компонентами врождённого иммунитета. Они играют ключевую роль в инициировании иммунной реакции в ответ на попадание патогенного микроорганизма (вируса, бактерии, дрожжей). При распознавании лиганда TLR запускает каскад внутриклеточных реакций, сигнализирующих о появлении опасности. Сигналы через TLRs регулируют активность антигенпрезентирующих клеток (АПК) с помощью синтеза биологически активных молекул (таких как цитокины и хемокины), стимулируют фагоцитоз, способствуют транспорту АПК из периферических тканей в лимфатические узлы и презентации ими антигена (АГ) в том числе за счёт регуляции синтеза костимулирующих молекул на АПК (таких как CD40 или CD80/86). Установлена роль TLRs в созревании дендритных клеток (ДК). [216]. Таким образом, TLRs активно участвуют не только в формировании врожденного иммунитета, но и регулируют адаптивный иммунный ответ, влияя на активность Т-лимфоцитов.
Согласно последним данным, TLRs могут стимулировать развитие воспалительной реакции и в ответ на эндогенные лиганды, появляющиеся при патологических условиях в результате повреждения клеток, формирования клеточного стресса, фиброза, апоптоза и некроза. Именно поэтому сейчас всё больше внимания уделяется связи TLRs и различных воспалительных заболеваний. Как уже было сказано, активация TLRs запускает синтез эффекторных молекул (про- и противовоспалительные цитокины, хемокины, воспалительные медиаторы). Нарушение регуляции активности TLR может приводить к развитию неконтролируемого воспаления, что влияет на течение и прогрессирование воспалительных заболеваний [249,250,308]. Таким o6pa30M,TLRs играют важную роль в развитии острых и хронических воспалительных заболеваний, таких как инфаркт миокарда, деструктивный панкреатит, цирроз печени, атеросклероз, аутоиммунных заболеваний (системная красная волчанка), аллергических заболеваний, онкологических заболеваниях [255,293,302,327,343,346]. TLRs вовлечены в процесс острого отторжения трансплантата, так как их активация может нарушить формирование толерантности [306]. В ответ на эндогенные лиганды TLRs могут участвовать в процессах регенерации тканей, например, в регенерации ткани печени, заживлении ран [309,414]. Активация TLRs способствует ангиогенезу и при экзогенной, и при эндогенной стимуляции, хотя точный механизм данного процесса на сегодняшний день не до конца понятен [220].
TLR1 (ген локализован на 4р14 хромосоме) экспрессируется в высокой степени на клетках селезенки и клетках периферической крови [193]. Прямые лиганды для TLR1 рецепторов не выявлены и их функция остается до конца неясной. Возможно, они действуют как корецепторы. Показано, что в комплексе с TLR2 рецепторами они участвуют в ответе на триацилированные липопротеины [406].
TLR2 или CD282 (4q31.3-32) рецепторы вовлечены в распознавание продуктов грамположительных бактерий, микобактерий, дрожжей. Исследования на мышах, дефектных по TLR2 гену, позволили сделать вывод о важной роли TLR2 в реагировании на пептидогликаны [90]. TLR2 рецепторы могут образовывать гетеродимеры с другими TLR или другими рецепторами (такими как дектин-1, рецептор из лектинового семейства, распознающий (3-глюкан, и CD36), что служит объяснением широкого спектра распознаваемых ими паттернов. Димеризуясь с TLR1, рецептор распознает триацилированные липопротеины, такие как Borrelia burgdorferi OspA [171,297]. Образование гетеродимера TLR1 и TLR2 активирует дендритные клетки, В-клетки, NK-клетки, тучные клетки и кератиноциты [91].TLR2 образуют димеры с TLR6 и участвуют в распознавании пептидогликанов и диацилированных липопептидов микоплазм, а также зимозана. CD36 относится к типу мембранных рецепторов-мусорщиков типа В. Он может выступать в качестве корецептора для гетеродимера TLR2/TLR6, способствуя распознаванию диацилглицерида [207,216].
TLR3 (4q35) рецепторы распознают одно- и двухцепочечную РНК, молекулярные структуры, ассоциированные с вирусной инфекцией. У мышей максимальная экспрессия TLR3 наблюдается на макрофагах, тогда как у человека TLR3 наиболее высоко экспрессируются на незрелых дендритных клетках. Интерферон повышает экспрессию рецептора на клетках. Активация TLR3 ведет к индукции противовирусных и провоспалительных цитокинов, созреванию дендритных клеток [186,256,338]. Эффекты активации TLR3 модулируются специфическими последовательностями РНК, такими как полиА:полии, вызывая преимущественно продукцию IgG2a. Синтетический аналог двухцепочечной РНК - Poly(LC) (полиинозиновая-полицитидиновая кислота) вызывает сниженный ответ у TLR3 дефицитных мышей [269,357].
TLR4 (9q32-33) рецептор для липополисахарида (ЛПС). TLR4 экспрессируется на поверхности нейтрофилов, макрофагов, дендритных клеток, Т- и В-лимфоцитов и других клеток. На модели мышей, дефектных по г7г4-гену, показано, что TLR4 является основным рецептором для проведения сигнала от ЛПС. Выявленные мутации tlr4 связаны со снижением чувствительности к ЛПС [121]. Многие субстанции немикробного происхождения способны действовать через TLR4. Например, белки теплового шока человека HSP60, HSP70 также взаимодействуют с TLR4 и индуцируют экспрессию генов провоспалительных цитокинов [156,239,305]. Алкалоид из коры тихоокеанского тиса - таксол, являющийся эффективным противоопухолевым агентом, блокирующим митоз, также действует через TLR4 [90].
TLR5 (ЦЗЗ) экспрессируется на лейкоцитах периферической крови, клетках селезенки и эндотелиальных клетках. TLR5 распознают флагеллин грамположительных и грам отрицательных бактерий [95,335,366]. Активация TLR5 ведет к активации транскрипционного фактора NF-KB И стимулирует продукцию ФНОа и ИЛ-6 [199].
TLR6 (4р) экспрессируется на лейкоцитах периферической крови, клетках селезенки. Образует димеры с TLR2 и распознает пептидогликаны и зимозан [91,92].
TLR7 (Хр22.3) экспрессируется на лейкоцитах периферической крови, клетках селезенки, легких, плаценты. За счет большого внеклеточного домена TLR7 имеет высокий молекулярный вес в сравнении с TLR1-6. Работы, выполненные на TLR7- дефектных мышах показали, что TLR7 распознают имидозольные соединения, такие как R848, обладающие антивирусными свойствами [215,252].
Культивирование МНК периферической крови человека
Для определения концентрации ФНОа и ИФНа использовали коммерческие наборы для иммуноферментного анализа фирм BioSource, Бельгия) и (Bender Medsystems, Австрия). Данный тест основан на методе твердофазного иммуноферментного анализа. Анализ проводился согласно следующей методике:
В лунки, предназначенные для стандартов, вносили 50 мкл Инкубационного буфера, а в лунки, предназначенные для образцов культуральных супернатантов, вносили 50 мкл Разбавляющего буфера для стандартов. Затем добавляли 100 мкл стандартов, образцов или контролей в соответствующие лунки. Все пробы анализировались в дублях. Планшет закрывали пленкой и инкубировали 2 часа при комнатной температуре.
После окончания инкубации осторожно снимали плёнку, помещая её затем в дезинфицирующий раствор. Стрипы промывали 4 раза промывающим раствором (раствор готовили в соответствии с методическими рекомендациями из 25-кратного концентрата ФСБ-Т и дистиллированной воды). При этом в каждую лунку вносили не менее 300 мкл раствора в процессе одного промывания. Раствор из лунок тщательно удаляли постукиванием планшета по фильтровальной бумаге.
Затем в каждую лунку вносили 100 мкл биотинилированных антител к ФНОа. Планшет закрывали пленкой и инкубировали 1 час при комнатной температуре. По окончании инкубации промывали стрипы 4 раза и удаляли влагу, как описано выше.
После в каждую лунку вносили 100 мкл рабочего раствора конъюгата стрептавидин-пероксидазы. Планшет закрывали пленкой и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации промывали стрипы 4 раза и удаляли влагу, как описано выше. Затем вносили в каждую лунку 100 мкл хромогенного раствора ТМБ. Инкубировали 30 мин при комнатной температуре, в темноте. По окончании инкубации вносили в каждую лунку 100 мкл Стоп-реагента. Результаты анализа учитывали спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Оптическую плотность определяли на приборе Anthos 2020. Калибровочная кривая строилась автоматически по результатам, полученным для стандартов, и по ней определяли содержание ФНОа в исследуемых образцах. Примеры калибровочных кривых, полученных в ходе исследования, представлены на рис. 5 и 6.
При исследовании влияния различных лигандов TLR на продукцию ФНОа или ИФНа МНК принимали спонтанную выработку цитокина за 1 и стимулирующее влияние различных лигандов на продукцию ФНОа оценивали, используя коэффициент стимуляции (КС). КС рассчитывали как отношение концентрации ФНОа в супернатантах стимулированных лигандами МНК к концентрации ФНОа в супернатантах нестимулированных МНК. Относительные единицы вводились для выявления прироста уровня цитокинов под действием лигандов TLR по отношению к спонтанной выработке цитокинов, а также с целью стандартизации метода.
Данный этап исследования проводили совместно с сотрудниками лаборатории клинической иммунологии ФГБУ НЦ Акушерства, гинекологии и перинатологии им. Ак. В.И.Кулакова Министерства здравоохранения РФ (директор - академик РАМН, д.м.н., профессор Сухих Г.Т.) ст.н.с, д.б.н. Николаевой М.А и сотрудниками ФГБУ ФНКЦ Детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д.Рогачева (директор - академик РАМН, д.м.н., профессор Румянцев А.Г.) ст.н.с, к.м.н. Давыдовой Н.В. В работе использовали МкАТ к CD 14, меченые FITC («Caltag», «Invitrogen», «е-Biosciences»), а также к TLR2, меченые РЕ («e-Biosciences»), и к TLR4, меченые РЕ Су-5 («e-Biosciences») и к TLR4, меченые РЕ («e-Biosciences»). Для определения экспрессии антигенов на поверхности моноцитов периферической крови МНК инкубировали с мечеными МкАТ в течение 30 мин. при 4С, дважды отмывали при 1200 об/мин при 4С и фиксировали раствором BD Cell Fix. Анализ образцов клеточных суспензий проводили на проточном цитометре Facscan (Becton Dickinson, США). В каждом образце выявляли процент двойных позитивных (CD 14 TLR2 или CD14+TLR4+) клеток. Процент меченых антителами клеток оценивали, вычитая процент PITC- и РЕ-позитивных клеток в негативном контроле из процента PITC- и РЕ-позитивных клеток, в исследуемых образцах. В качестве негативного контроля использовали мышиные PITC-меченые и РЕ-меченые IgG («Caltag»). Интенсивность экспрессии рассчитывали, как отношение интенсивности флуоресценции образца, меченного CD14+TLR2+ или CD14+TLR4+, к интенсивности флуоресценции изотипического контроля.
Определение спонтанной продукции ФНОа МНК периферической крови больных ОВИН и Х-АГГ
В последние годы накапливаются данные об экспрессии Toll-подобных рецепторов не только на клетках врожденного иммунитета - нейтрофилах, макрофагах, дендритных клетках, но и на многих других клетках организма эндотелиальных, эпителиальных и многих других. В связи с этим возникает важная проблема, касающаяся роли TLR в функционировании этих клеток в норме и при патологии с вовлечением различных органов: почек, сердца, ЦНС, печени и т.д. Кроме того, появляется все больше сведений об участии эндогенных лигандов TLR в патогенезе ряда заболеваний человека, среди них острый инфаркт миокарда, атеросклероз, болезнь Крона и другие [67.146,255,293]. Физиологические концентрации эндогенных лигандов не инициируют запуск реакций врожденного иммунитета. Однако при повреждении и стрессовых воздействиях их концентрация значительно возрастает, что приводит к активации сигнальных путей TLR, в результате чего, как и при воздействии экзогенных лигандов, происходит экспрессия генов провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12 и других), костимуляторных молекул и некоторых других молекул. Таким образом, TLR способны распознавать неинфекционные, эндогенные «сигналы опасности», являющиеся маркерами тканевого повреждения, в результате чего инициируется развитие реакций врожденного иммунитета. Отличительной характеристикой патологических состояний, сопровождающихся деструкцией тканей, является чрезмерное воспаление. Массивное повреждение тканей с большим количеством клеток, подвергающихся некрозу, приводит к выбросу DAMP, активации TLR и развитию стерильного воспаления. Длительная и избыточная активация TLR приводит к высвобождению повышенных количеств ФНОа, который будет выполнять не только позитивную роль в организме, но может оказаться фактором тканевого повреждения, способствующим развитию различных осложнений основного заболевания, так хроническое воспаление, включающее повышенные уровни провоспалительных цитокинов, способствует прогрессированию дисфункции левого желудочка и его ремоделированию после инфаркта миокарда [233,281,343].
С тех пор как впервые было показано, что активация Toll-подобных рецепторов 2 и 4 может происходить при помощи эндогенных лигандов, список эндогенных активаторов TLR2 и TLR4 неуклонно расширяется и охватывает все больше внутриклеточных молекул, таких как обширное семейство белков теплового шока (HSP60, HSP70, HSP22, HSP72 и других) Gp96, HMGB1 , а также включает молекулы экстрацеллюлярного матрикса (ЕСМ), такие как бигликан, версикан, олигосахариды гиалуроновой кислоты, гепарансульфат и другие [97,162,166,168,185,221,223,319,320,380,381,388,389239,80]. В связи с этим целью данного этапа работы было оценить состояние компонентов системы TLR, в частности TLR2 и TLR4, у больных при острых патологических состояниях, сопровождающихся деструкцией ткани - остром инфаркте миокарда и остром деструктивном панкреатите, в динамике заболевания.
Изучали спонтанную и индуцированную лигандами TLR выработку ФНОа МНК больных ОИМ на 1 и 14 сутки заболевания. Известно, что TLR-основные рецепторы врожденного иммунитета, которые задействованы в развитии сердечно-сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз и др. [102,176,179,225,253,283].
У больных ОИМ в 1-е сутки заболевания мы выявили повышение спонтанной выработки ФНОа по сравнению со здоровыми донорами. К 14-м суткам после развития ОИМ спонтанная выработка ФНОа у больных снижалась и приближалась к спонтанной выработке ФНОа МНК здоровых доноров (Табл. 23). Повышение спонтанной продукции ФНОа МНК больных в 1 сутки ОИМ может быть обусловлено воздействием различных молекул, высвобождающихся при повреждении миокарда, например, белков теплового шока, активных форм кислорода и др. [178]. Увеличение спонтанной выработки провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками больных ОИМ свидетельствует о повышенной функциональной активности клеток врожденного иммунитета у этих больных в 1-е сутки заболевания. При развитии острых патологических состояний, таких как острый инфаркт миокарда, важную роль играют клетки врожденного иммунитета: нейтрофилы, макрофаги, а также провоспалительные цитокины. Их экспрессия может быть индуцирована при активации рецепторов врожденного иммунитета. При остром инфаркте миокарда некроз кардиомиоцитов запускает механизмы врожденного иммунитета, вызывая TLR-опосредованные реакции, выработку провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-1, ИЛ-6 и др.), активацию каскада системы комплемента и выработку активных форм кислорода (АФК). S.Frantz и соавторы показали, что экспрессирующийся на кардиомиоцитах TLR2 принимает участие в ответе этих клеток на оксидативный стресс. Действие активных форм кислорода на клетки, находящиеся в очаге некроза (кардиомиоциты, моноциты, нейтрофилы) приводит к активации TLR2, что, в свою очередь, запускает сигнальный путь, завершающийся активацией NF-KB. Активация TLR2 и TLR4 и последующая индукция NF-KB способствуют транскрипции генов провоспалительных цитокинов, хемокинов и молекул адгезии. ФНОа вырабатывается на ранних этапах развития инфаркта миокарда, индуцирует выработку других медиаторов воспаления лейкоцитами и эндотелиальными клетками [179,180]. Про воспалительные цитокины могут участвовать в развитии локальной воспалительной реакции и приводить к развитию системного воспаления.
Особенности TLR индуцированной выработки ФНОа МНК у отдельных больных ОИМ в динамике заболевания
Первичные иммунодефицита с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) характеризуются частыми рекуррентными бактериальными инфекциями. Молекулярно-генетические дефекты, локализуемые при ОВИН, касаются в основном адаптивного звена иммунной системы [105,112]. В последнее время появились публикации, сообщающие о дефектах врожденного иммунитета у больных ОВИН [94,111,148,169]. В том числе, обсуждаются нарушения в функционировании антигенпрезентирующих клеток при ОВИН. Описываются дефекты созревания и дифференцировки дендритных клеток, нарушение экспрессии костимулирующих молекул CD80/86, CD83, CD40, различных активационных маркеров дендритных клеток, таких как HLA-DR, CD la, CD 11с [111,148], также у некоторых больных отмечается снижение содержания дендритных клеток (в особенности плазмоцитоидных) в периферической крови по сравнению со здоровыми людьми [123,409]. Дендритные клетки больных ОВИН характеризуются сниженной выработкой ИЛ-12 в ответ на различные стимуляторы (ЛИС, CD40L и ФНОа) [148,268,379]. С другой стороны у больных ОВИН показана повышенная продукция ИЛ-12 моноцитами, что в дальнейшем способствует дифференцировке Th в направлении ТЫ, нарушению дифференцировки В лимфоцитов [134] .
Для того чтобы оценить вклад врожденной иммунной системы в вариабельность патофизиологических и клинических проявлений ОВИН и X-АГГ у больных ПИД с дефектами антителообразования мы провели комплексную трехуровневую оценку системы TLR. На первом этапе оценивали эффекторную функциональную активность TLR на мононуклеарных клетках в этой группе больных, используя модель активации МНК периферической крови TLR агонистами.
В ходе исследования выявлено, что у больных ОВИН и Х-АГТ повышена спонтанная выработка ФНОа, что свидетельствует о повышенной функциональной активности клеток-продуцентов цитокина, вероятно благодаря постоянной микробной стимуляции клеток врожденного иммунитета у этих больных. Абсолютные значения индуцированной лигандами TLR1/2, TLR4, TLR5, TLR2/6 выработки ФНОа МНК больных ПИД также были повышены, либо сопоставимы со значениями доноров. Однако при оценке эффекторной функции TLR2 и TLR4 у больных ОВИН и Х-АГТ выявили сниженные по сравнению со здоровыми донорами значения КС в ответ на ЛПС и ПГ, т.е. у этих больных нарушена потенциальная способность МНК «отвечать» на лиганды TLR2 и TLR4. При этом низкие значения эффекторной функции рецепторов сопровождались повышенной частотой развития бактериальных инфекций и других осложнений у таких больных.
В нашем исследовании мы показали, что индуцированная лигандами TLR4 и TLR9 выработка ИФНа МНК периферической крови больных ОВИН не нарушена. Полученные нами результаты свидетельствуют о наличии дисбаланса ЛПС - индуцированной выработки ФНОа, и ИФНа МНК периферической крови больных ОВИН, который возможно обусловлен нарушением сигнальных путей, ведущих к активации транскрипционного фактора NF-кВ. Выявленные изменения эффекторной функции TLR2 и TLR4 могут быть опосредованы нарушением экспрессии рецепторов на поверхности клеток-продуцентов цитокинов, а также нарушением трансдукции сигнала от этих рецепторов, т.е. дефектом адапторных молекул. Экспрессия TLR2, TLR4 на поверхности CD14+-MOHOUHTOB периферической крови больных ОВИН существенно ниже по сравнению с группой здоровых доноров. Вероятно, снижение плотности экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОВИН вносит свой вклад в развитие клинической картины, наблюдаемой у больных ОВИН. В литературе имеются противоречивые данные о выработке цитокинов в ответ на лиганды TLR и уровне экспрессии TLR на клетках иммунной системы больных с различными заболеваниями, наблюдается зависимость этого показателя от тяжести течения заболевания, например, у больных хроническим гепатитом С и хронической гранулематозной болезнью [196,291]. В обследуемой нами группе больных ОВИН выявлено двое детей, у которых наряду с высокой спонтанной выработкой ФНОа полностью отсутствовала стимуляция выработки цитокина МНК периферической крови лигандами TLR и определялись низкие уровни экспрессии TLR2, TLR4 и CD 14 на поверхности моноцитов. Обнаруженные дефекты у этих больных ОВИН сочетались с тяжелым течением заболевания, развитием злокачественных новообразований. У больных Х-АГГ нами также была выявлена сниженная стимулирующая активность лигандов TLR2 и TLR4 на выработку ФНОа МНК. Выявленные изменения индуцированной выработки ФНОа в ответ на лиганды TLR2 и TLR4 могут быть связаны с мутациями в гене btk. В литературе имеются противоречивые данные о роли Btk в индукции синтеза цитокинов, показано, что Btk вовлечена в сигнальные пути от TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 и TLR9 [159,219,266,267] и участвует в индукции синтеза ФНОа. Анализируя экспрессию TLR2 и TLR4 на С014-положительных моноцитах больных X-АГТ, мы не выявили изменения содержания CD14+TLR2+ и CD14+TLR4+ моноцитов, но при этом значения интенсивности экспрессии TLR2, TLR4 на CD 14""" моноцитах ниже по сравнению с группой здоровых доноров. В работе Taneichi et al.[375] показано нарушение созревания дендритных клеток под влиянием лигандов TLR2, TLR4 и TLR7/8 и снижение выработки ФНОа в ответ на эти лиганды, при этом экспрессия TLR на дендритных клетках больных Х-АГГ не изменялась. Противоречивые данные об уровнях экспрессии TLR на клетках больных Х-АГГ могут быть связаны с гетерогенностью, обусловленной различными мутациями Btk, встречающимися у больных Х-АГГ [40].
Следующий уровень оценки компонентов системы TLR включал оценку экспрессии мРНК TLR2, TLR4 и TLR9 в МНК периферической крови детей больных ОВИН и Х-АГГ. Обнаружили статистически значимое снижение экспрессии мРНК TLR9 в МНК больных ОВИН. По уровню экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 были выделены 2 подгруппы больных: с высокими значениями экспрессии и с низкими значениями в экспрессии. У больных ОВИН с высокой экспрессией мРНК TLR2 и TLR4 обнаружили также повышенные значения количества CD14+ моноцитов, экспрессирующих TLR2 и TLR4, но интенсивность экспрессии рецепторов при этом была снижена. Продолжительность заболевания в этой группе больных составила от более 6 лет. Возможно, в ответ на микробную стимуляцию у этих больных происходит повышение уровня экспрессии мРНК TLR. Затем уже транскрипционные и посттранскрипционные механизмы могут приводить к снижению экспрессии белка на поверхности клеток.
