Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы 12
Глава 1. Процесс образования Т-клеток в тимусе 12
1.1. Механизм реаранжировки генов Т-клеточного рецептора 13
1.2. Структурные и функциональные изменения тимуса и периферического пула Т-лимфоцитов, связанные с возрастом 18
Глава 2. Т-клеточный гомеостаз 23
2.1. Механизмы гомеостатического контроля пула наивных 25
2.1.1. Факторы выживания наивных Т-лимфоцитов 25
2.1.2. Гомеостатическая пролиферация наивных Т-лимфоцитов 28
2.2. Механизмы гомеостатического контроля пула Т-клеток памяти 31
2.2.1. Факторы выживаемости Т-клеток памяти 32
2.2.2. Гомеостатическая пролиферация Т-клеток памяти 34
Глава 3. Патологии, связанные с нарушением Т-клеточного гомеостаза 35
3.1. ВИЧ-инфекция 35
3.2. Ревматоидный артрит 36
3.3. Бронхиальная астма 38
3.4. Атопический дерматит 40
Часть II. Материалы и методы 42
Часть III. Результаты собственных исследований 55
Глава 1. Оптимизация реакции ПЦР в режиме реального времени для определения количества TREC в популяциях Т-лимфоцитов 55
Глава 2. Характеристика количества TREC-позитивных клеток в норме 61
2.1. Взаимосвязь количества TREC и возраста 61
2.2. Измерение количества TREC в динамике клеточных делений in vitro . 63
Глава 3. Характеристика количества TREC-позитивных клеток при иммунопатологических заболеваниях 68
3.1. Количество TREC при ревматоидном артрите 68
3.2. Количество TREC при бронхиальной астме 71
3.3. Количество TREC при атоническом дерматите 75
3.4. Количество TREC в субпопуляциях CD31-позитивных Т-лимфоцитов в норме и при иммунопатологических заболеваниях 77
Обсуждение 81
Заключение 92
Выводы 94
Список литературы 96
- Механизм реаранжировки генов Т-клеточного рецептора
- Оптимизация реакции ПЦР в режиме реального времени для определения количества TREC в популяциях Т-лимфоцитов
- Измерение количества TREC в динамике клеточных делений in vitro
- Количество TREC в субпопуляциях CD31-позитивных Т-лимфоцитов в норме и при иммунопатологических заболеваниях
Введение к работе
Актуальность темы. Тимус является центральным органом иммунной системы, который создает специфическое микроокружение для созревания и селекции Т-лимфоцитов, несущих Т-клеточный рецептор -типа (95% периферических Т-клеток) и -типа (5%). Созревание по тимусзависимому пути обеспечивает разнообразие репертуара Т клеток, необходимого для иммунного ответа на большое число антигенов, также этот процесс помогает поддерживать Т-клеточный пул на периферии. С возрастом происходит сокращение объема островков в тимусе, где осуществляется процесс тимопоэза [Steinmann G.G., 1986]. Данное явление было обозначено инволюцией тимуса. В последнее время ее рассматривают как одну из основных причин связанного с возрастом снижения функций иммунной системы.
Т-клеточный гомеостаз в организме определяется балансом между процессами образования лимфоидных клеток и их гибели [Freitas A.A., 2000]. Известно, что у взрослых людей наивные Т-лимфоциты пролиферируют с небольшой интенсивностью: делению на периферии подвергается около 1% клеток, в равной степени CD4+ и CD8+ [Hazenberg M.D., 2004; Sachsenberg N.,1998]. При многих аутоиммунных заболеваниях, лимфомах, миеломах наблюдается изменение показателей Т-клеточного гомеостаза (общего количества лимфоцитов, соотношения CD4+/CD8+, CD45RA+/CD45RO+ лимфоцитов и др.), и механизмы пополнения наивных Т-клеток в этих условиях отличаются от таковых в норме. У человека, несмотря на то, что для наивных CD4+ лимфоцитов выявлен поверхностный маркер CD31, точно определить количество клеток, недавно мигрировавших из тимуса довольно трудно, так как CD4+CD31+ клетки способны к самоподдержанию на низком уровне с сохранением экспрессии CD31 [Kohler S., 2009]. Однако во время созревания в тимусе при перестройке генов Т-клеточного рецептора в тимоцитах образуется последовательность кольцевой ДНК, или TREC, которая присутствует в наивных Т-лимфоцитах периферической крови. Измерение количества TREC методом количественной полимеразной цепной реакции позволяет выявить клетки, недавно вышедшие из тимуса, и, таким образом, оценить функциональную активность тимуса [Douek D.C., 1998; Kong F.K., 1999].
Предполагается, что эта нехромосомная кольцевая ДНК не реплицируется в митозе и в процессе деления клетки переходит лишь к одной из дочерних клеток. При стимуляции выделенных из пуповинной крови Т-лимфоцитов антителами против CD3 и CD28 антигенов наблюдалось уменьшение относительного количества TREC, поэтому для оценки функциональной активности тимуса необходимо учитывать время жизни наивных клеток и скорость обновления периферического пула Т-клеток [Douek D.C., 1998; Hazenberg M.D., 2003]. В связи с этим представляется актуальным исследовать динамику TREC в зависимости от количества совершенных периферическими Т-лимфоцитами делений в условиях поликлональной активации in vitro.
Низкий уровень TREC выявлен при таких заболеваниях, как вариабельный неклассифицируемый иммунодефицит, кожная Т-клеточная лимфома, рассеянный склероз [Gauzzi V., 2002; Yamanaka K-i., 2005; Hug A., 2003]. При ВИЧ-инфекции на ранней стадии наблюдается увеличение количества TREC в CD4+ Т-клетках, что можно объяснить как увеличением гибели зрелых CD4+ Т-клеток, так и большей по сравнению со здоровыми донорами продукцией тимуса [Nobile M., 2004]. На поздней стадии ВИЧ-инфекции количество TREC значительно снижается, что может быть обусловлено снижением тимопоэза в следствие дефектов костномозговых предшественников лимфоидной линии [Clark D.R., 2000]; тем не менее после успешной противовирусной терапии оно способно восстановиться до нормальных значений [Steffens C.M., 2001; Franco J.M., 2002]. Кроме того, определение количества TREC используют для оценки вклада тимопоэза в восстановление Т-клеточного пула на периферии после аллогенной трансплантации стволовых кроветворных клеток или костного мозга [Farge D., 2005]. Интересно, что как у детей, так и у взрослых количество TREC достигает границы нормы примерно спустя 6 месяцев после трансплантации [Chen X., 2005; Hazenberg M.D., 2002].
Показано, что при ревматоидном артрите количество CD4+ Т-клеток, содержащих TREC, снижено настолько, что у пациентов в 20-30 лет оно соответствует количеству таких клеток у здоровых людей в 50-60 лет. Предположительно, это связано с нарушением генерации новых Т-клеток, экспансией олигоклональных Т-клеток на периферии, что приводит к укорочению теломер и ускоренному старению популяции Т-лимфоцитов в целом [Koetz K., 2000].
В патогенезе атопического дерматита и бронхиальной астмы ключевую роль играют Т-лимфоциты, которые отвечают на антигенную стимуляцию активацией, пролиферацией и синтезом цитокинов. Свидетельством такой репликативной истории клеток является ускоренное сокращение теломерных районов ДНК на концах хромосом [Борисов В.И., 2007]. Актуальным представляется исследование механизмов поддержания периферического пула Т-лифоцитов при данных заболеваниях, и сравнение их с таковыми в норме и при ревматоидном артрите.
Цель исследования: На основе исследования абсолютного и относительного количества TREC в популяциях Т-лимфоцитов оценить вклад мигрирующих из тимуса наивных клеток в поддержание Т-клеточного пула на периферии в норме, при атопическом дерматите, бронхиальной астме и ревматоидном артрите.
Задачи исследования:
-
Разработать оптимальные условия для количественного определения TREC методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
-
Изучить динамику TREC-позитивных лимфоцитов в зависимости от числа совершенных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитами делений при поликлональной активации in vitro.
-
Определить количество TREC в CD4+ и CD8+ лимфоцитах у здоровых доноров и у больных атопическим дерматитом, бронхиальной астмой, ревматоидным артритом.
-
Оценить число CD31-позитивных Т-клеток и количество TREC в них в норме, при атопическом дерматите, бронхиальной астме и ревматоидном артрите.
Научная новизна. В работе показано снижение количества TREC в зависимости от числа совершенных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитами делений в условиях поликлональной стимуляции in vitro, что подтверждает предположение о переходе данной молекулы при делении только к одной из дочерних клеток.
В результате исследования впервые охарактеризован вклад мигрирующих из тимуса лимфоцитов в пополнение Т-клеточного пула при патологиях, сопровождающихся укорочением длины теломер в иммунокомпетентных клетках. Установлено, что у пациентов с ревматоидным артритом регистрируется снижение относительного количества TREC-содержащих лимфоцитов и абсолютного количества CD8+TREC+ клеток в периферической крови. Пациенты с атопическим дерматитом характеризуются уменьшением относительного количества TREC в субпопуляциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов на фоне повышенного абсолютного количества клеток в мм3 крови в данных субпопуляциях. Учитывая отсутствие изменений у больных данной категории по содержанию TREC-позитивных клеток среди CD4+CD31+ и CD8+CD31+ лимфоцитов, полученные данные свидетельствуют о большем по сравнению с нормой вкладе периферической экспансии в поддержание Т-клеточного пула.
Впервые показано, что пациенты с длительностью заболевания бронхиальной астмой менее одного года демонстрируют увеличение абсолютного и относительного количества TREC в CD4+ и CD8+ лимфоцитах по сравнению с донорами и пациентами с давностью заболевания более одного года. В совокупности с повышенным количеством TREC среди CD31-позитивных клеток эти данные говорят о более интенсивном при бронхиальной астме пополнении периферического пула Т-лимфоцитов за счет мигрирующих из тимуса клеток.
Научно-практическая значимость работы. На основе плазмиды pBluskript создан оригинальный стандарт, который позволяет количественно определять молекулы TREC в субпопуляциях Т-лимфоцитов методом ПЦР в режиме реального времени.
Полученные данные расширяют представление об иммунопатогенезе атопического дерматита, бронхиальной астмы и ревматоидного артрита и позволяют визуализировать механизмы пополнения периферического пула Т-клеток. Изменение относительного и абсолютного количества TREC-позитивных клеток в субпопуляциях Т-лимфоцитов указывает на изменение соотношения процессов тимопоэза и периферической экспансии при заболеваниях аллергической и аутоиммунной природы.
Результаты исследования лягут в основу для разработки новых подходов по оценке функциональной активности тимуса при различных патологических состояниях.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Количество TREC в CD4+ и CD8+ лимфоцитах в условиях поликлональной стимуляции in vitro уменьшается в геометрической прогрессии в зависимости от числа совершенных клетками делений, свидетельствуя о том, что данная кольцевая структура не реплицируется в процессе митоза и передается одной из дочерних клеток.
-
Изменения абсолютного и относительного количества клеток, содержащих TREC, а также общего числа CD4+ и CD8+ лимфоцитов отражают изменения соотношения процессов тимопоэза и периферической экспансии в поддержании Т-клеточного пула на периферии при иммунопатологических заболеваниях.
Апробация результатов. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (г. Красноярск, 2010), на 14 Международном иммунологическом конгрессе - 14th International Congress of Immunology (Kobe, Japan, 2010), на XIV Всероссийском форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2011), 8-ой отчетной конференции ГУ НИИ КИ СО РАМН «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике» (г. Новосибирск, 2011). Апробация диссертации состоялась 13 марта 2012г. на семинаре ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН.
Объем и структура диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Материал изложен на 117 страницах машинописного текста, включающего 8 таблиц и 13 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 205 литературных источников, в том числе 196 зарубежных.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов работ соискателей учёной степени кандидата наук.
Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю д.м.н., проф. В.С. Кожевникову за помощь и поддержку, оказанную при работе над диссертацией, к.б.н. М.Л. Филипенко и Е.А. Храпову сотрудникам группы фармакогеномики ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск за участие в разработке стандарта, а также д.м.н., проф. С.В. Сенникову и сотрудникам лаборатории молекулярной иммунологии ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН, особенно к.б.н. А.Н. Силкову за советы и всестороннюю поддержку.
Механизм реаранжировки генов Т-клеточного рецептора
Т-клеточный рецептор (TCR) является главной поверхностной структурой Т-лимфоцитов, от которой зависят дифференцировка и выполнение функций этими клетками. Антигенраспознающие рецепторы а(3 либо уб-типа формируются таким образом, что на каждой клетке образуется уникальный по специфичности рецептор, передающийся дочерним клеткам. Все полипептидные цепи, входящие в состав гетеродимерного TCR, относятся к суперсемейству иммуноглобулинов и имеют доменную структуру. в геноме зародышевых и всех соматических клеток, за исключением зрелых Т-лимфоцитов, гены, кодирующие V, D, J фрагменты полипептидных цепей TCR, представлены не в готовом виде, также как и гены иммуноглобулинов. Поэтому во время созревания Т-лимфоцитов в тимусе синтезу полноценной и функциональной цепи TCR предшествует перестройка соответствующего ей гена, или так называемая V-(D)-J рекомбинация. На сегодняшний день механизм реаранжировки изучен достаточно полно. В геноме обнаружены сигнальные последовательности (RSS), которые распознаются специфическими ферментами рекомбиназами. По одной такой сигнальной последовательности находится на 3 -конце каждого V-сегмента, на 5 -конце каждого J-сегмента, и на обоих концах D-сегмента, т.е. на участках, вовлечённых в присоединение последовательностей друг к другу. RSS содержат консервативный гептамер CACAGTG и консервативный АТ-богатый нонамер АСАААААСС, разделенные спейсером, содержащим неконсервативную последовательность длиной либо 12, либо 23 нуклеотида. Сигнальные последовательности, имеющие 12-нуклеотидный спейсер, могут соединяться только с последовательностями, имеющими 23-нуклеотидный спейсер. Это, так называемое, правило соединения 12/23. Оно позволяет быть уверенным, что все сегменты соединятся в надлежащем порядке, а однотипные сегменты не смогут соединиться между собой [Lewis S.M., 1994].
Реаранжировка начинается со сближения последовательностей RSS разных фрагментов, они, застегиваясь подобно застежке «молния», формируют петлю с изымаемым материалом (TCR-делетирующий элемент, или TREC). Дальнейший разрыв двух нитей ДНК в области гептамера катализируется ферментами, названными в совокупности V(D)J рекомбиназой. Белками, активирующими рекомбинацию, являются RAG-1 и RAG-2, они распознают последовательности RSS, садятся на них, димеризуются, и, действуя синергичным образом, вносят двухцепочечные разрывы в ДНК [Oettinger М.А., 1990; Bassing С.Н., 2002]. Экспрессия RAG-1 и RAG-2 осуществляется исключительно в тимусе.
После изымания материала прилежащие к кодирующим сегментам нити воссоединяются, формируя «шпильку». Эндонуклеазы катализируют разрыв в одной нити в области, прилежащей к шпильке. В результате образуются выпрямленные отрезки ДНК разной длины, и по более длинной нити осуществляется комплементарная достройка, называемая Р-вставкой. В это же время активируется терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT), которая обеспечивает нематричное и, следовательно, случайное, генетически не детерминированное добавление на свободных концах ДНК олигонуклеотида; такие вставки называют N-фрагментами.
Первая реаранжировка генов TCR начинается со сближения J- и D-сегментов у- и (3-цепей обеих хромосом. Затем на стадии DN2 в одной из хромосом осуществляется VDJ-перестройка гена Vp, а также генов Vy и V5. Успешное завершение перестройки гена Vp и других генов сопровождается прекращением экспрессии генов RAG-1 и RAG-2, что обеспечивает блокаду реаранжировки второй (3-цепи (основа аллельного исключения). Экспрессия продуктов перестроенных генов происходит на следующей стадии - DN3. Образующаяся (3-цепь соединяется с так называемой а-цепью проторецептора (preTCR-a), аналогичной суррогатной L-цепи в В-клетках, и комплексом CD3. Вследствие контакта с неизвестным лигандом, локализующимся на поверхности эпителиальных клеток, в клетки подается сигнал при участии цепей CD3, который вызывает их пролиферацию, обозначаемую как (3-селекция. Как и в случае с В-лимфоцитами, эта волна пролиферации обеспечивает поддержку клеток, в которых успешно осуществился первый этап реаранжировки генов TCR. Она важна и для достижения, достаточной численности предшественников Т-лимфоцитов, позволяющей сформировать разнообразный рецепторный репертуар.
При переходе к стадии DP-клеток окончательно делается выбор в пользу формирования рецепторов ар- или уб-типа. До этого момента перестройка V-генов р\ y-, -цепей могла совершаться параллельно в каждой клетке. Хотя механизмы выбора до конца не выяснены, установлено, что решающая роль в этом принадлежит регуляторному участку Уу-гена, в частности сайленсерам, ответственным за блокаду его экспрессии [Ofr R., 1995; Huang C.-Y., 2007]. По-видимому, в тимусе обеспечиваются условия, благоприятствующие формированию TCR ар-типа.
Как и в случае перестройки Vp-гена, реаранжировке Уа-гена предшествует повторная активация генов RAG-1 и RAG-2, которая открывает стадию DP. Для успешной перестройки генов должна произойти делеция генов б-цепи, так как они располагаются межу сегментами Va и Ja-Делеция дельта локуса является важным этапом в процессе дифференцировки Т-клеток и признаком их окончательного перехода в линию лимфоцитов с TCR сф-типа. Успешное завершение реаранжировки и экспрессия (х-цепи приводят к формированию зрелого рецептора а(3-типа и его появлению на поверхности клетки. Одновременно с этим на поверхности тимоцитов усиливается экспрессия молекул CD4 и CD8 и подавляется экспрессия генов RAG-1, RAG-2, npeTCRa, а также протоонкогена Вс1-2 [Lanzavechia А., 1999].
Хотя перестройка генов TCR может в принципе происходить независимо в обеих гомологичных хромосомах, в действительности экспрессируются гены только одной из них, так как завершение перестройки гена конкретной цепи в одной хромосоме приводит к прекращению экспрессии генов RAG-1 и RAG-2. Это обеспечивает аллельное исключение в отношении V-генов, что означает невозможность одновременной экспрессии в одной клетке молекул TCR с разной специфичностью. На таких же принципах базируется запрет на одновременную экспрессию TCR еф- и уб типов.
В результате созревание по тимусзависимому пути обеспечивает разнообразие репертуара Т-клеток, необходимого для иммунного ответа на большое число антигенов, также этот процесс помогает поддерживать Т-клеточный пул на периферии.
TREC
У некоторых животных было обнаружено, что клетки, недавно вышедшие из тимуса, на поверхности экспрессируют особые маркеры, по которым их можно отделить от остальных наивных Т-лимфоцитов на периферии. Для куриц таким маркером служит chTl, для крыс hyl CD45RC RT6“ [Kong F, 1998; Hosseinzadeh H., 1993]. Kong с соавторами в экспериментах с цыплятами первым показал, что в недавно образованных в тимусе Т-лимфоцитах присутствует эписомльная кольцевая молекула ДНК, содерщащая фрагменты генов TCR. Причем процесс вырезания этой ДНК происходит только при реаранжировке генов TCR в тимусе [Kong F.K., 1999]. Затем подобные эписомальные ДНК были обнаружены методом ПНР в режиме реального времени в периферических Т-лимфоцитах человека и названы TREC (Т cell receptor excision circles). Однако молекулярным маркером недавних мигрантов из тимуса принято считать одну разновидность этих молекул - sj TREC. Она представляет собой побочный продукт перестройки генов а-цепи, которая завершается экспрессией зрелого TCR и не предполагает массовой пролиферации, как в случае успешной перестройки (3-цепи. Кроме того, примерно в 70% Т-лимфоцитов делеция дельта локуса происходит за счет специфической реаранжировки участков Rec и \j/J.a [Verschuren М.С., 1997].
Принято считать, что местом локализации TREC является цитоплазма. Эта кольцевая молекула ДНК не реплицируется в процессе митоза и при каждом делении клетки переходит лишь к одной из дочерних клеток [Douek D.C., 1998; Livak F., 1996]. Внутри одной Т-клетки с ар TCR может присутствовать максимум два sj TREC в том случае, если соответствующий процесс реаранжировки произошел в обоих аллелях, и если клетка после этой перестройки еще не поделилась.
Оптимизация реакции ПЦР в режиме реального времени для определения количества TREC в популяциях Т-лимфоцитов
Приступая к работе с применением метода определения количества TREC в популяциях Т-лимфоцитов, не использованного ранее отечественными исследователями, необходимо было оптимизировать реакцию ПЦР в режиме реального времени. Экспериментальным путем была подобрана концентрация специфических праймеров и флюоресцентных зондов для гена CCR5 и TREC, образующегося при реаранжировке генов а-цепи TCR. Она составила 200 нМ для каждого праймера и зонда. Концентрация термостабильной Taq ДНК-полимеразы была получена в реакции титрования фермента, когда на 25 мкл реакционной смеси для ПЦР добавлялось 2, 4, 6, 8 и 10 ед. активности фермента соответственно. После проведения реакции ПЦР в режиме реального времени, эффективность использованной концентрации фермента оценивали по отсутствию неспецифической амплификации и димеров праймеров при электрофоретическом разделении ампликонов в 8% ПААТ. Таким, образом, оптимальная концентрация Taq ДНК-полимеразы составила 2 ед. активности.
На рис. 2 представлено электрофоретическое разделение продуктов амплификации TREC и гена CCR5 после проведения полимеразной цепной реакции с подобранными концентрациями специфических праймеров и термостабильной Taq ДНК-полимеразы. В качестве образца была использована ДНК, полученная из МНК. Видно, что при амплификации гена CCR5 образуется один продукт, ему на форезе соответствует единственный бенд размером 92 пн. При амплификации TREC наряду с основным продуктом амплификации - ярким бендом размером 82 пн - присутствует небольшое количество еще одного продукта. Возможно, это связано с тем, что в некоторых Т-клетках реаранжировка генов а-цепи TCR прошла не совсем точно по участкам 5Rec и \Ла. Однако как для амплификации TREC, так и для амплификации CCR5 характерно отсутствие димеров праймеров.
Для того чтобы подтвердить специфичность реакции, помимо электрофоретического разделения продуктов амплификации после ПЦР, измеряются их кривые плавления [Nolan Т., 2006]. При этом вместо технологии TaqMan, которая основана на деградации зонда полимеразой за счет ее 5 -3 экзонуклеазной активности во время стадии элонгации и, следовательно, высвобождении молекулы флюорохрома, используется интеркалирующий флюоресцентный краситель SYBR Green, уровень флюоресценции которго возрастает при связывании двуцепочечной ДНК. При этом режим термоциклирования и состав реакционной смеси остаются без изменений. Реакцию ПЦР также проводят в режиме реального времени с добавлением еще одного шага в протокол - измерения кривой плавления (опция Melting Curve). Прибор измерял уровень флюоресценции в образцах на каждый градус, начиная с 55С и до 95С, и автоматически определял количество пиков и соответствующую им температуру плавления ампликонов.
Принцип построения кривой плавления заключается в следующем. При увеличении температуры происходит денатурация ДНК и ее диссоциация с молекулами интеркалирующего красителя, следовательно, уровень флюоресценции постепенно снижается. В тот момент, когда температура достигает температуры плавления ампликона (т.е. когда половина молекул ДНК теряет спиралевидную структуру) происходит резкое уменьшение флюоресценции (RFU), и на дифференциальном графике зависимости -d(RFU)/dT от температуры (Т) мы видим пик. В свою очередь температура плавления амплифицированного фрагмента зависит от его размера и нуклеотидного состава. Так GC-богатые последовательности имеют боле высокую температуру плавления по сравнению с ампликонами с избытком AT пар оснований.
В качестве образца была взята та же самая полученная из МКК ДНК, для которой был проведен анализ электрофоретического разделения продуктов амплификации (рис. 3). Кривая плавления продуктов реакции ПЦР для гена CCR5 имеет один единственный пик с температурой плавления 79С. В случае TREC мы также видим большой пик с температурой плавления 78С. Маленький пик программой не был включен в анализ, его можно не рассматривать, так как он практически не влияет на специфичность реакции. Скорее всего он соответствует небольшому количеству димеров праймеров, которое не детектируется на форезе, так как его температура плавления ниже, чем у основного продукта.
Был проведен еще один дополнительный эксперимент, в котором подтверждается специфичность выбранных праймеров (рис. 4). В реакцию ПЦР в режиме реального времени в качестве образцов использовали ДНК, выделенную из линий опухолевых клеток BRO и К562, а также из МНК, CD4+ и CD8+ лим фоцитов. Клетки опухолевой линии меланомы человека BRO и опухолевой линии хронической миелоидной лейкемии человека К562 были получены из Онкологического центра РАМН (г. Москва). Эти клетки характеризуются отсутствием поверхностных маркеров В- и Т-лимфоцитов, следовательно, в них не происходила VDJ-рекомбинация и гены TCR представлены в первозданном виде, т.е. молекулы TREC в этих клетках отсутствуют.
При анализе количества TREC, нормализованного относительно количества CCR5, оказалось, что в линиях опухолевых клеток в небольшом количестве амплифицируется неспецифический ПЦР продукт. В реакцию было внесено достаточно большое количество геномной ДНК, в таких условиях может наблюдаться нестабильное случайное связывание праймеров с матрицей, что и приводит к синтезу неспецифичного продукта реакции. Образцы, где использовалась ДНК, выделенная из МНК и чистых субпопуляций лимфоцитов, содержат гораздо большее количество TREC. Относительное количество TREC в МНК отличается от такового в CD4 - и С08+-клетках, вследствие того, что в состав этого клеточного пула помимо Т-лимфоцитов входят еще моноциты. Именно они влияют на количество вносимой в реакцию ДНК, и уменьшают истинное количество TREC. CD4 - и СИ8 -лимфоциты демонстрируют сопоставимый уровень TREC.
Более корректное определение количества TREC в популяциях Т-лимфоцитов требует проведения количественной ПЦР в режиме реального времени, при которой необходим стандарт (методика изготовления стандарта рассмотрена в гл. Материалы и методы). Неизвестное количество TREC и вносимой ДНК в образцах определялось по калибровочным прямым, построенным по серии разведений соответствующего стандарта для TREC и CCR5. Тангенс угол наклона калибровочной прямой составлял не более -3,2 с коэффициентом корреляции R 0,98, что соответствовало общепринятым значениям [Nolan Т., 2006]. Разница в пороговом цикле Ct между дублями составляла не более 0,5 цикла. Все перечисленные критерии необходимы для стандартизации анализированных данных и убеждают в объективности полученных результатов.
Таким образом, оптимизация реакции ПЦР является ключевым этапом в исследовании, она позволяет достичь высокой чувствительности, специфичности и воспроизводимости данного метода.
Измерение количества TREC в динамике клеточных делений in vitro
Период существования TREC был исследован с помощью методики культивирования Т-клеток. МНК периферической крови 5 здоровых доноров культивировали в течение 7 дней без поликлональной активации и в присутствии анти-СОЗ антител и IL-2. После чего определяли концентрацию кольцевой молекулы ДНК, образующейся при реаранжировке а-цепи TCR, в CD4+ и в CD8+ лимфоцитах до культивирования, а также после культивирования (рис. 7). В обеих субпопуляциях Т-лимфоцитов уровень TREC значительно снизился в поликлонально стимулированных клетках, которые активно пролиферировали в течение 7 суток (р 0,01). Среднее значение концентрации TREC до культивации составило 12000 против 1200 копий/млн после культивирования с поликлональной активацией для CD4+-лимфоцитов, 13900 против 1100 копий/млн - для CD8+-лимфоцитов, соответственно. В клетках, культивируемых без активации анти-СПЗ антителами й IL-2, относительное количество TREC осталось практически на том же уровне.
Считается, что TREC не реплицируется в митозе и в процессе деления клетки переходит лишь к одной из дочерних клеток. Как меняется количество TREC в популяциях CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов при культивировании in vitro в зависимости от числа совершенных делений, было установлено с помощью витального красителя CFSE (Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester). При окрашивании CFSE ковалентно связывается со свободными №ї2-группами белков внутри клетки, и при ее делении он равномерно распределяется между дочерними клетками. Таким образом, неделившиеся клетки будут иметь самый высокий уровень флуоресценции, тогда как активно пролиферирующие клетки будут светиться наименее ярко. В течение 7 дней стимулированные анти-СПЗ антителами и IL-2 Т-лимфоциты в среднем совершили 6-7 делений. Перед выделением ДНК и последующим определением количества TREC клетки сортировали на неделивщиеся и прошедшие 1, 2 и 3 деления субпопуляции CD4 и CD8 Т-лимфоцитов.
Среди субпопуляций CD4 - и СВ8 -клеток, прошедших разное количество делений, наибольшее количество TREC демонстрируют неделившиеся клетки («О» точка). Затем уже на первом делении это количество снижается и значительно падает на 2 и 3 делениях. Так как возраст доноров варьировал от 24 лет до 41 года, то исходное количество TREC сильно различалось в группе. Поэтому, чтобы установить зависимость между уровнем TREC и количеством совершенных Т-лимфоцитами делений, все полученные значения были нормализованы по количеству TREC в неделившихся клетках. На рис. 8 представлены усредненные по 5 донорам кривые по изменению относительного количества TREC для CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов. Теоретическая кривая построена на основе предположения, что молекула TREC при делении клетки не разрушается внутриклеточными ферментами нуклеазами, но и не реплицируется, а переходит лишь к одной из дочерних клеток.
Кривые по динамике уровня TREC в зависимости от количества делений имеют схожий вид для субпопуляций CD4 и CD8 Т-лимфоцитов и в ранговом анализе вариаций по Краскелу-Уоллису не отличались от предсказанной теоретической кривой (Н (2, N 12)=0,27, р=0,87). То, что уровень TREC в СВ4+-клетках снижается несколько быстрее, чем в CD8-клетках, можно объяснить тем, что CD4+ лимфоциты больше подвержены активационному апоптозу.
После 7 суток культивирования происходит снижение количества С04+-клеток с 44,5±5,4 % до 35,7±6,5 % и увеличение СВ8+-клеток с 20,8±2,3 % до 44,4±3,6 % (критерий Манна-Уитни р 0,01). При этом суммарный уровень апоптоза в культуре для CD4+ лимфоцитов повысился с 0,24 % до 1,12 % (р 0,05), тогда как для CD8+ лимфоцитов наблюдалась лишь тенденция к его увеличению с 0,45 % до 0,77 % (р=0,07). В зависимости от количества совершенных делений процент клеток, находящихся в апоптозе постепенно увеличивался и достигал максимума на 5 делении (табл. 2). Несмотря на это, однофакторный дисперсионный анализ не выявил зависимости между уровнем апоптоза и числом совершенных Т-лимфоцитами делений (для CD4+ F=2,18 р=0,063; для CD8+ F=0,75 р=0,59).
Достоверных различий между субпопуляциями CD4+ и CD8 лимфоцитов по количеству клеток, находящихся в фазе апоптоза, в зависимости от числа совершенных ими делений выявлено не было. Исключение составляют СВ4+-клетки, поделившиеся 3 раза, для которых уровень апоптоза имел тенденцию к увеличению (р=0,053) по сравнению с СИ8+-клетками.
Таким образом, можно сделать вывод, что кольцевая молекула ДНК, образующаяся при реаранжировке а-цепи TCR, представляет собой достаточно стабильную структуру с длительным периодом существования. При делении доля Т-лимфоцитов, содержащих TREC, уменьшается в геометрической прогрессии.
Количество TREC в субпопуляциях CD31-позитивных Т-лимфоцитов в норме и при иммунопатологических заболеваниях
Молекула CD31, известная также как РЕСАМ-1, относится к семейству иммуноглобулинов, экспрессируется не только на поверхности тимоцитов и наивных Т-лимфоцитов, но и тромбоцитов, моноцитов, гранулоцитов и эндотелиальных клеток. Показано, что она участвует в регуляции процессов адгезии, миграции и активации Т-клеток [Jackson D.E., 2003]. В последнее время некоторые исследователи рассматривают CD31 в качестве маркера недавно мигрировавших из тимуса СП4 -клеток. Чтобы посмотреть, насколько чувствительным является этот маркер, было определено число CD4+ и CD8 31-позитивных лимфоцитов и количество ТІЛЕС в них в периферической крови 10 условно здоровых доноров и пациентов с иммунопатологическими заболеваниями (РА, АД и БА).
Согласно данным, представленным в литературе и данным собственных экспериментов на 3 здоровых донорах, экспрессия маркера CD31 на поверхности клеток памяти с фенотипом CD45RA RO не превышает 5% и не меняется с возрастом [Junge S., 2007]. Другими словами, CD31 коэкспрессируется преимущественно с CD45RA на наивных Т-лимфоцитах, поэтому в данном исследовании при фенотипировании клеточных субпопуляций не использовались антитела против RA-изоформы молекулы CD4 5.
CD8 лимфоцитов, тогда как количество CD4+CD31+ клеток
Различные авторы говорят о том, что у человека доля CD31 позитивных CD4+ и CD8+ лимфоцитов снижается с возрастом и коррелирует с объемом тимуса, определенным с помощью неконтрастной компьютерной томографии [Junge S., 2007; Tanaskovic S., 2010]. В настоящем исследовании количество CD8 CD31 клеток у доноров составляло примерно 60% от всей популяции — 1 — г+ггт + варьировало с возрастом и после 40 лет составляло около 30% популяции CD4 лимфоцитов. Четкой связи между возрастом и количеством CD4+CD31+ клеток не наблюдалось. Также не было выявлено достоверных отличий по содержаний CD4+CD31+ и CD8+CD31+ клеток в периферической крови между группами пациентов с РА, БА, АД и подобранными по возрасту к ним группами доноров (табл. 6).
По данным разных авторов у доноров количество TREC в субпопуляции CD4+CD31+CD45RA+CD45RO" клеток в 8-18 раз превышает количество этих молекул в CD4+CD31 -CD45RA+CD45RO" лимфоцитах [Kimmig S., 2002; Junge S., 2007]. Что подтверждает предположение о том, что CD31 может выступать в качестве маркера недавно мигрировавших из тимуса наивных клеток. В данной работе было определено количество TREC среди CD4+CD31+ и CD8+CD31+ Т-лимфоцитов у 10 доноров, возрастной диапозон которых составлял интервал между 23 и 46 годами. Корреляционный анализ выявил обратную зависимость между количеством содержащих TREC CD31-позитивных CD4+ и CD8+ клеток и возрастом (коэффицент корреляции: для CD4+CD31+ г=-0,71, р 0,05; для CD8+CD31+ г=-0,65, р 0,05), которая представлена на рис. 13. Подобная зависимость между количеством TREC-позитивных CD4+CD31+ и CD8+CD31+ Т лимфоцитов и возрастом регистрировалась у пациентов с РА, АД, БА.
Снижение количества TREC в CD31-позитивных клетках с возрастом служит еще одним доказательством инволюции тимуса и сокращения числа мигрирующих на периферию наивных Т-лимфоцитов. Также данный феномен дает основание предполагать наличие ГП наивных клеток с сохранением на поверхности маркера CD31. Кроме того, возможно, чем старше становится человек, тем более у него выражен такой тип гомеостатической пролиферации.
По уровню TREС в CD4+CD31 и CD8+CD31 клетках пациенты с РА и АД также не отличались от соответствующих им по возрасту групп доноров (табл. 7). Известно, что размер пула наивных Т-клеток меньше при РА, чем у доноров [Ponchel Р., 2002]. Следовательно, полученные результаты говорят лишь о том, что доля недавно мигрировавших из тимуса лимфоцитов и уровень TREC в них при РА сопоставимы с донорскими значениями, но если оценить абсолютное количество 31-позитивных CD4+- и СВ8 -клеток и абсолютное количество TREC в них, то, возможно, будут получены различия. В случае АД существенных изменений в компартменте наивных Т-лимфоцитов не описано, поэтому полученные данные свидетельствуют о находящейся в пределах нормы функциональной активности тимуса.
При БА уровень TREC в субпопуляции CD4+CD31+ лимфоцитов был достоверно повышен, тогда как в субпопуляции CD8+CD31+ лимфоцитов он имел тенденцию к увеличению по сравнению с таковым у доноров (р=0,06). В связи с тем, что для данного заболевания данные об изменении соотношения числа наивных Т-клеток к клеткам памяти отсутствуют, и в данном исследовании показано, что относительное количество CD31-позитивных CD4+ и CD8+ лимфоцитов сопоставимо с донорскими значениями, увеличение количества TREC происходит в основном за счет стимуляции процесса тимопоэза.
