Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Теломераза человека и ее регуляция 12
1.1. Роль теломеразы в проблеме концевой недоренликации хромосом 12
1.2. Состав теломеразного комплекса 17
1.2.1. Каталитическая субъединица теломеразы 17
1.2.2. РНК-субъединица теломеразы 19
1.3. Регуляция активности теломеразы 20
1.3.1. Транскрипционная регуляция hTERT 20
1.3.2. Посттранскрипционная регуляция теломеразы 21
Глава 2. Механизмы регуляции теломеразы в норме и при патологии 24
2.1. Регуляция теломеразы в иммунокомпетентных клетках человека 27
2.1.1. Лимфоидные клетки 28
2.1.2. Миелоидные клетки 34
2.2. Теломераза при различных иммунопатологических состояниях 35
2.2.1. Активность теломеразы при ревматоидном артрите 35
2.2.2. Активность теломеразы при системной красной волчанке 37
2.2.3. Активность теломеразы при рассеянном склерозе 38
2.2.4. Активность теломеразы при атопическом дерматите и псориазе 39
2.2.5. Активность теломеразы при апластической анемии 40
Часть II. Материалы и методы исследования 43
Часть III. Результаты собственных исследований 53
Глава 1. Постановка метода оценки мРНК hTERT в имунокомпетентных клетках с помощью Flow-FISH 53
1.1. Проверка специфичности используемого PNA зонда 53
1.2. Разработка условий гибридизации in situ 57
1.2.1. Выделение и подготовка клеточных образцов 57
1.2.2. Денатурация нуклеиновых кислот 58
1.2.3. Гибридизация 59
1.2.4. Удаление не связавшегося зонда из клеток 62
1.2.5. Окрашивание ДНК 63
1.2.6. Запись и анализ данных 63
1.2.7. Воспроизводимость метода Flow-FISH 67
1.3. Демонстрация метода гибридизации in situ 68
Глава 2. Экспрессия теломеразы в интактных и стимулированных лимфоцитах человека в норме и при иммунопатологических состояниях 70
2.1. Экспрессия мРНК hTERT в интактных лимфоцитах 70
2.2. Содержание субъединицы hTERT в интактных лимфоцитах 71
2.3. Экспрессия мРНК hTERT в стимулированных лимфоцитах 72
2.4. Содержание hTERT в стимулированных лимфоцитах 75
2.5. Содержание hTERT и мРНК hTERT в CD4 и CD8 субпопуляциях лимфоцитов 78
2.6. Исследование активности теломеразы в лимфоцитах при поликлональной стимуляции 80
Обсуждение 85
Заключение 99
Выводы 101
Список литературы 103
- Роль теломеразы в проблеме концевой недоренликации хромосом
- Проверка специфичности используемого PNA зонда
- Экспрессия мРНК hTERT в стимулированных лимфоцитах
- Исследование активности теломеразы в лимфоцитах при поликлональной стимуляции
Введение к работе
Актуальность темы. Теломераза представляет собой фермент, который осуществляет наращивание теломерных районов хромосомной ДНК. Известно, что укорочение теломерных районов ДНК до значений, являющихся критически малыми, может служить сигналом к репликативному старению соматических клеток и дестабилизации их хромосом [Chan S.R.W.L., 2004]. Активность теломеразы в совокупности с длиной теломер отражает пролиферативный потенциал клетки. Существуют данные, свидетельствующие о присутствии определяемой активности этого фермента не только в стволовых, половых и опухолевых клетках, но и в слизистых клетках кишечника и в лимфоцитах периферической крови (ПК) и тимуса [Osterhage J.L., 2009], кроме того, каталитическая субъединица теломеразы (hTERT), являющаяся РНК-зависимой ДНК полимеразой, синтезирующей теломерные повторы, а также мРНК этой субъединицы, также экспрессируются в этих клетках на сравнительно низком, но детектируемом уровне.
В течение жизни в лимфоцитах периферической крови происходит постепенное укорочение теломер. Причиной этого являются клеточные деления, накапливающиеся с возрастом in vivo [Osterhage J.L., 2009]. Показано, что при многих, в том числе иммунопатологических, болезнях (ревматоидный артрит, атопический дерматит, бронхиальная астма и др.) лимфоциты периферической крови характеризуются укороченными теломерами и повышенной пролиферацией по сравнению с аналогичными показателями в лимфоцитах здоровых людей. Кроме заболеваний различного генеза, на скорость укорочения теломер в лимфоцитах могут влиять и многие другие факторы, как, например, наличие хронического стресса [Georgin-Lavialle S., 2010].
Установлено, что экспрессия теломеразы в лимфоцитах строго контролируется в течение их развития, дифференцировки и активации [Georgin-Lavialle S., 2010]. Известно, что в результате стимуляции зрелые лимфоциты становятся способны экспрессировать теломеразу на довольно высоком уровне, причем после любой повторной стимуляции экспрессия теломеразы также может возрастать, но ее уровень уже не достигает уровня ответа на первичный стимул [Akbar A.N., 2007]. Такая динамика может отражать механизмы регуляции клональной экспансии лимфоцитов, являющейся частью иммунного ответа, на уровне контроля их пролиферации.
Помимо активации теломеразы существует механизм удлинения теломер, альтернативный теломеразному (ALT -alternative lengthening of telomeres). Тем не менее, наличие этого механизма в клетках млекопитающих в настоящее время обнаружено только в аномальных ситуациях, таких как злокачественные клетки, иммортализованные клеточные линии, и нокаутные по гену теломеразы мышиные клеточные линии, тогда как нормальные лимфоциты человека не обладают способностью использовать ALT для поддержания теломер [Muntoni A., 2009]. Таким образом, основным механизмом стабилизации длины теломер в лимфоцитах является активность теломеразы, и поскольку пролонгирование клональной экспансии крайне важно для функционирования лимфоцитов, они задействуют этот механизм для того, чтобы снизить (но не предотвратить целиком) сокращение теломер в течение пролиферации [Kashubowska L., 2008]. Так, в интактных лимфоцитах при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, рассеянном склерозе и атопическом дерматите активность теломеразы увеличена [Klapper W., 2004]. Показано также, что активность теломеразы способна возрастать в результате острого психологического стресса [Epel E.S., 2010].
Многочисленные данные свидетельствуют, что при большинстве перечисленных ситуаций (иммунопатологические заболевания, стресс и многие другие) теломеры в лимфоцитах, несмотря на повышенную активность теломеразы, сокращаются с возрастом быстрее, чем у здоровых доноров, и немногие свидетельства сохранения длины теломер в лимфоцитах при патологических состояниях являются, скорее, исключением. Таким исключением, например, является отсутствие ускоренного укорочения теломер при бронхиальной астме (БА) смешанного генеза, при том, что при атопической и инфекционно-зависимой БА теломеры укорачиваются с возрастом значительно быстрее, чем у доноров [Борисов В.И., 2009].
Учитывая, что регуляция активности теломеразы контролируется как на уровне транскрипции гена hTERT, так и механизмами посттранскрипционной и посттрансляционной модификации [Ly H., 2009], представляет интерес изучение не только экспрессии мРНК hTERT в лимфоцитах, но и наличия в них самого белка hTERT. Исследование изменений продукции теломеразы на уровне мРНК и белка ее каталитической субъединицы, таким образом, представляет значительный интерес, поскольку может помочь объяснить причину укорочения или сохранения длины теломер при иммунопатологических процессах.
Для количественной оценки мРНК hTERT обычно используют RT-PCR или Northern Blotting. Эти методы недостаточно информативны, поскольку необходимость разрушения клеток для выделения мРНК не позволяет одновременно охарактеризовать исследуемый материал по другим параметрам (к примеру таким, как субпопуляционная принадлежность или экспрессия интересуемых белков) без дополнительного использования методов их сепарации. Этот недостаток отсутствует в методе Flow-FISH, позволяющем оценивать содержание исследуемой ДНК или РНК на уровне единичной клетки с помощью внутриклеточной in situ гибридизации зонда, меченого флуорохромом, с последующим анализом на проточном цитофлуориметре. Представляется перспективным таким образом модифицировать метод Flow-FISH для выявления мРНК hTERT, чтобы это позволило с достаточной информативностью и высокой производительностью определять экспрессию теломеразы в исследуемом материале.
Цель исследования. Исследовать изменения активности теломеразы в лимфоцитах человека при иммунопатологических заболеваниях аутоиммунного и аллергического генеза на уровне продукции мРНК и белка hTERT и оценить влияние этих изменений на динамику длины теломер.
Задачи исследования:
-
Изучить информативность, эффективность и особенности применения метода Flow-FISH при определении относительного количества мРНК hTERT в иммунокомпетентных клетках.
-
Исследовать динамику экспрессии hTERT и мРНК hTERT в CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах человека в условиях поликлональной стимуляции.
-
Изучить уровень спонтанной и индуцированной экспрессии hTERT и мРНК hTERT в лимфоцитах человека при ревматоидном артрите, атопическом дерматите, бронхиальной астме и апластической анемии.
Научная новизна. Показано, что уровень мРНК hTERT в лимфоцитах периферической крови человека достаточно высок для достоверной ее оценки путем in situ гибридизации с флуоресцентным зондом, специфичным к последовательности этой мРНК, с последующим анализом на проточном цитофлуориметре.
Обнаружено, что после трех суток поликлональной стимуляции лимфоцитов здоровых доноров в культуре in vitro экспрессия в них мРНК hTERT достоверно повышается. Такое повышение происходит за счет клеток, находящихся в S/M/G2 фазе клеточного цикла (пролиферирующих клеток), тогда как в состоянии покоя (фаза G1/G0) как стимулированные, так и интактные клетки экспрессируют равные уровни мРНК hTERT. Содержание hTERT в лимфоцитах также достоверно возрастает в результате их стимуляции in vitro, более того, между содержанием hTERT в интактных и стимулированных лимфоцитах существует статистически значимая положительная корреляция.
Выявлено более высокое содержание мРНК hTERT в CD8 лимфоцитах пациентов с ревматоидным артритом по сравнению с группой доноров. Тем не менее, содержание hTERT в группе пациентов с РА не отличается от доноров ни в общей популяции лимфоцитов, ни в CD4 и в CD8 субпопуляциях.
Впервые исследовано содержание hTERT и ее мРНК в лимфоцитах пациентов с бронхиальной астмой. Полученные данные свидетельствуют, что в отличие от группы доноров, экспрессия мРНК hTERT в стимулированных лимфоцитах пациентов с БА повышена по сравнению с исходным (спонтанным) значением независимо от стадии клеточного цикла (G1/G0 и S/M/G2). Кроме того, для пациентов с БА смешанного генеза характерно повышение содержания каталитической субъединицы теломеразы в лимфоцитах после трех суток поликлональной стимуляции по сравнению с группой доноров.
Обнаружено, что в лимфоцитах пациентов с атопическим дерматитом, стимулированных поликлонально в течение трех суток, уровень мРНК hTERT, в отличие от доноров, не повышается. Также у пациентов с АД отсутствует корреляция между содержанием hTERT в интактных и стимулированных лимфоцитах.
Научно-практическая значимость работы. Модификация способа определения уровня мРНК каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) обладает высокой производительностью и позволяет с достаточной информативностью определить мРНК hTERT в исследуемом материале (Flow-FISH). В данной методике окрашивание мРНК hTERT на уровне единичных клеток производится в суспензии фиксированных клеток с помощью гибридизации in situ, после чего следует анализ образца на проточном цитофлуориметре. Методика опубликована в виде патента «Способ определения уровня мРНК каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) как показателя уровня активности фермента» и в статьях.
Данные об измененной экспрессии и/или способности к индукции hTERT и мРНК hTERT в лимфоцитах при таких патологиях, как ревматоидный артрит, атопический дерматит, бронхиальная астма и апластическая анемия, дают объяснение феномену ускоренного укорочения или, наоборот, сохранения длины теломер, наблюдаемое в различных субпопуляциях лимфоцитов при этих заболеваниях.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Модифицированный метод Flow-FISH позволяет определять содержание мРНК каталитической субъединицы теломеразы в иммунокомпетентных клетках с помощью гибридизации in situ с флуоресцентным PNA зондом и последующим анализом суспензии клеток на проточном цитофлуориметре.
-
Повышение экспрессии мРНК hTERT, наблюдаемое при поликлональной стимуляции лимфоцитов, достигается за счет клеток, находящихся в фазе S/M/G2 клеточного цикла, в то время как клетки, находящиеся в фазе G1/G0, экспрессируют мРНК теломеразы на одинаковом уровне независимо от того, были ли они выделены из интактных или стимулированных в культуре лимфоцитов.
-
Повышенная активация hTERT в Т-лимфоцитах периферической крови обеспечивает сохранение длины теломер при иммунопатологических состояниях, как показано в случае бронхиальной астмы смешанного генеза, в то время как при нормальной или сниженной экспрессии теломеразы возникает ускоренное укорочение теломер (при ревматоидном артрите, атопическом дерматите и апластической анемии).
Апробация результатов. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на 7-ой отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике» (г. Новосибирск, 2006), на научно-практических конференциях «Дни иммунологии в Сибири» (г. Омск, 2007, г. Красноярск, 2010), на Объединенном иммунологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008), на школе 3rd ENII-MUGEN summer school in advanced immunology (Alghero, Italy, 2008). Апробация диссертации состоялась 25 мая 2010г. на семинаре НИИ клинической иммунологии СО РАМН.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 120 страницах машинописного текста, включающего 12 таблиц и 33 рисунка. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 182 литературных источника, в том числе 171 зарубежных.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов работ соискателей учёной степени кандидата наук, и 1 патент.
Роль теломеразы в проблеме концевой недоренликации хромосом
Существование специальных структур на концах хромосом было постулировано в 1938 году Мак-Клинток и Мёллером. Используя в качестве объекта исследования кукурузу (Мак-Клинток) и дрозофилу (Мёллер), они независимо друг от друга обнаружили, что фрагментация хромосом под действием рентгеновского облучения и появление у них дополнительных концов ведут к хромосомным перестройкам и деградации хромосом [О Sullivan R.J., 2010]. В сохранности оставались лишь области хромосом, прилегающие к их естественным концам. Мёллер предложил называть их теломерами (от греч. телос - конец и мерос - часть) [Chuaire L., 2006]. Лишенные теломер, хромосомы начинают сливаться с большой частотой, что ведет к тяжелым генетическим аномалиям. В последующие годы выяснилось, что теломеры не только предотвращают деградацию и слияние хромосом (и тем самым поддерживают целостность генома хозяйской клетки), но и, по-видимому, ответственны за прикрепление хромосом к ядерному матриксу, играя, таким образом, важную роль в создании специфической архитектуры и внутренней упорядоченности клеточного ядра. Более того, наличие на концах хромосом специальной теломерной ДНК позволяет решить так называемую проблему концевой недорепликации ДНК [Belgiovine С, 2008, Sekaran V.G., 2010].
Многократно повторяющиеся блоки в теломерной ДНК простейших состоят из шести-восьми нуклеотидных остатков. При этом одна цепь ДНК сильно обогащена остатками гуаниловой кислоты (G-богатая цепь), а комплементарная ей цепь ДНК соответственно обогащена остатками цитидиловой кислоты (С-богатая цепь). Очень важная характеристика теломерных ДНК - их длина. У человека она колеблется от 2 до 20 тысяч пар оснований, а у некоторых видов мышей может достигать сотен тысяч пар оснований [O Sullivan R.J., 2010].
Известно, . что ДНК-полимеразы синтезируют дочернюю цепь ДНК в направлении 5 -3 . Кроме того, ДНК-полимераза начинает синтез только со специального РНК-праймера - короткой РНК-затравки, комплементарной ДНК. После окончания синтеза ДНК РНК-праймеры удаляются, а пропуски в одной из дочерних цепей ДНК заполняются ДНК-полимеразой. Однако на 3 -конце ДНК такой пропуск заполнен быть не может, и поэтому З -концевые участки ДНК остаются одноцепочечными, а их 5 -концевые участки - недорешшцированными. Отсюда ясно, что каждый раунд репликации хромосом будет приводить к их укорочению. Понятно, что прежде всего должна сокращаться длина теломерной ДНК. Первым на проблему "концевой недорепликации ДНК" обратил внимание Оловников в 1971 году. Он высказал гипотезу о том, что потеря концевых последовательностей ДНК вследствие их недорепликации ведет к старению клетки [Chuaire L., 2006]. Иными словами, предполагалось, что процесс укорочения теломер и есть тот механизм, который определяет репликативный потенциал клетки, и когда длина теломер становится угрожающе короткой, этот механизм предотвращает дальнейшее деление клетки. Оловников предположил также, что в нестареющих клетках (а к ним кроме раковых относятся зародышевые, стволовые и другие генеративные клетки) должна существовать специализированная ферментативная система, которая контролирует и поддерживает длину теломерной ДНК. Гипотеза Оловникова нашла подтверждение в последующие годы. Во-первых, было установлено, что теломеры нормальных (то есть обреченных на старение) клеток действительно укорачиваются на 50-60 нуклеотидных звеньев при каждом клеточном делении. Во-вторых, в 1984 году Блэкберн и Грайдер выделили фермент, который с помощью механизма, отличного от механизма реакций, лежащих в основе репликации ДНК, синтезирует теломерную ДНК. Этот фермент, первоначально названный теломерной терминальной трансферазой, впоследствии получил название теломераза [Chuaire L., 2006].
Как правило, стволовые клетки экспрессируют теломеразу и таким образом длина теломер в них остается стабильной на протяжении жизни (рис.1, сплошная зеленая линия), в то время как при низкой экспрессии теломеразы (или же вовсе ее отсутствии) в соматических клетках теломеры постепенно укорачиваются [Flores ! 2010]. Например, как в гемопоэтических клетках, так и в зрелых соматических клетках обнаруживается укорочение теломер с возрастом. Теломеры гемопоэтических стволовых клеток (рис.1, сплошная красная линия) более длинные, чем в клетках лимфоидного (пунктирная синяя линия) и миелоидного (сплошная желтая линия) ростков. Разница в длине теломер между четырьмя этими типами клеток отражает укорочение теломер в процессе дифференцировки. Принцип укорочения теломер с возрастом в различных клетках одинаков: потеря или увеличение длины теломер с возрастом определяется уровнем активности теломеразы в этих клетках. В миелоидных клетках (гранулоцитах) выявляется постоянное укорочение теломер, которое может отражать процесс, происходящий в миелоидных клетках-предшественниках.
Если в результате критического укорочения теломер происходит остановка клеточного цикла в одной из контрольных точек, пролиферация замедляется или прекращается. В случае сниженной активности теломеразы резерв теломер истощается быстрее, что приводит к преждевременному старению, в особенности в высокопролиферирующих тканях [O Sullivan R.J., 2010]. В процессе иммортализации, когда остановки клеточного цикла не происходит, клетки продолжают делиться несмотря на сильное укорочение теломер, что влечет за собой нестабильность генома и клеточную гибель [Gancarcikova М, 2010]. Реактивация теломеразы (или включение механизма ALT) позволяет клеткам выйти из кризиса и пролиферировать с короткими, но стабильными теломерами (рис.2).
Итак, основное назначение теломеразы - синтезировать тандемно повторяющиеся сегменты ДНК, из которых состоит G-цепь теломерной ДНК [Belgiovine С, 2008]. Таким образом, она относится к классу ДНК-полимераз, являясь РНК-зависимой ДНК-полимеразой или обратной транскриптазой [Sekaran V.G., 2010]. РНК, используемая теломеразой для синтеза теломерной ДНК в качестве матрицы, входит в состав этого фермента. Матричный участок представлен в теломеразной РНК только один раз. Его длина не превышает длину двух повторов в теломерной ДНК, которые он кодирует и которым он комплементарен.
Так как теломераза синтезирует сегменты ДНК, повторяющиеся много раз, используя только один сегмент своей РНК, она должна обладать способностью периодически (после завершения синтеза каждого повтора) перемещать (транслоцировать) матричный участок в район З -конца синтезируемой теломерной ДНК. На рисунке 3 изображена общепринятая схема механизма синтеза теломерных повторов, катализируемого теломеразой. На первой стадии теломераза находит 3 -конец теломерной ДНК, с которым часть матричного участка теломеразной РНК образует комплементарный комплекс. При этом теломераза использует З -конец хромосомной ДНК в качестве праймера. Далее наступает очередь РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности теломеразы, которая обеспечивается белковой субъединицей теломеразы. Когда синтез ДНК-повтора заканчивается, происходит транслокация, то есть перемещение матрицы и белковых субъединиц фермента на заново синтезированный конец теломерной ДНК, и весь цикл повторяется вновь [Sekaran V.G., 2010].
Действие теломеразы может быть опосредовано двумя возможными механизмами: процессивным (когда она способна добавлять сотни нуклеотидов к предложенному теломерному праимеру на протяжении многих циклов синтеза теломерных повторов) и не процессивным (когда она способна только на один цикл добавления теломерного повтора к матрице) [Chang М, 2007, Kim N.W., 1997]. Не процессивные варианты теломеразы каждый раз после синтеза одного повтора диссоциируют с матрицы теломер [Chen J.L., 2003], в случае же процессивного фермента синтезированный теломерный повтор перемещается на 5 участок матрицы, после чего синтез происходит заново. Таким образом, эффективность этого перемещения может определять процессивность теломеразы. Теломераза таких организмов, как человек [Ren X., 2006] и Tetrahymena [Chen J.L., 2003] является процессивной; в других видах, например в мышах и в Saccharomyces cerevisiae, она отличается значительно меньшей процессивностью. В дополнение к этому показано, что в течение одного цикла человеческая теломераза может диссоциировать и ассоциировать несколько раз, достраивая повторы к одной и той же теломере. Также известно, что на очень коротких теломерах (короче 125 по.) процессивность теломеразы значительно увеличена [Chang М., 2007]. Процессивность теломеразы зависит от взаимодействия синтезированного продукта с ферментом не только в области матрицы, существует еще сайт «заякоривания», независимый от матричного, иначе этот продукт диссоциирует с фермента после добавления первого же повтора, на стадии транслокации [Hardy CD., 2001].
Проверка специфичности используемого PNA зонда
Существовала вероятность, что при используемых в данной работе условиях гибридизации PNA зонд мог связываться не только с искомой матричной РНК, но и с какой-либо геномной ДНК человека. Чтобы определить, действительно ли используемый зонд специфичен только к РНК, лимфоциты периферической крови и клетки опухолевой линии BRO были обработаны РНКазой А, не обладающей активностью ДНКазы [Flemington Е.К., 2004], в концентрации 10 и 20 мкг/мл, после чего была проведена параллельная гибридизация обработанных РНКазой и интактных клеток. В результате обработки клеток РНКазой после гибридизации их светимость по каналу FL1 уменьшилась до значения фоновой аутофлуоресценцин по сравнению со светимостью клеток, не обработанных РНКазой (табл.2), из чего можно сделать вывод, что используемый PNA зонд при гибридизации избирательно связывается только с РНК.
В таблице представлены относительные единицы флуоресценции исследованных образцов по каналу FL1. Приведен показательный результат одного из четырех экспериментов.
В качестве дополнительного контроля обработку клеток РНКазой провели уже после завершения стадии гибридизации. В этом случае флуоресцентный сигнал клеток также был значительно снижен по сравнению с образцом, не обработанным РНКазой (данные не представлены). Вероятной причиной этого может являться то, что фрагменты мРНК (в том числе связавшиеся с флуоресцентным PNA зондом), образующиеся внутри клеток после обработки РНКазой, могут легко вымываться из клеток, так как их мембрана повреждена в результате воздействия формамида и нагревания до 80С.
Так как используемый зонд комплементарен только мРНК hTERT и не должен давать флуоресцентного сигнала при гибридизации с мРНК теломеразы мыши, была проведена гибридизация с мышиными спленоцитами. Известно, что в сплепоцитах мыши присутствует активная теломераза и, соответственно, мРНК ее каталитической субъединнцы mTERT [Artandi S.E., 2002]. Гибридизация этих клеток с PNA зондом дала флуоресцентный сигнал, который был намного ниже, чем сигнал человеческих лимфоцитов (табл.3), следовательно, можно говорить о специфичности зонда к мРНК теломеразы человека.
В таблице представлены относительные единицы флуоресценции исследованных образцов по каналу FL1. Приведен результат одного из двух экспериментов.
Тем не менее, существовала вероятность, что уровень флуоресцентного сигнала может напрямую зависеть от качества отмывки избыточного количества зонда, а соответственно, от размера клеток, так как при проведении гибридизации с клетками человеческой опухолевой линии BRO, наоборот, наблюдается очень высокий сигнал (табл.3), который теоретически может быть обеспечен недостаточным количеством отмывок.
Чтобы исключить такую возможность, для проведения гибридизации из периферической крови условно здорового донора были выделены гранулоциты, клетки, которые превышают лимфоциты но размеру (как клетки опухолевой линии), но при этом не содержат ни hTERT, ни ее мРНК (как спленоциты мыши) [Akbar A.N., 2007]. Для этого осадок, полученный после центрифугирования лейковзвеси в градиенте фиколл-верографин, отобрали в отдельную пробирку и подвергли десятиминутному воздействию лизирующего буфера с целью избавления от эритроцитов, после чего клетки отмыли ЗФР-ЭА. Полученный осадок почти полностью состоял из популяции гранулоцитов (рис.8).
После проведения гибридизации светимость гранулоцитов по каналу FL1 практически не отличалась от сигнала контрольной пробы, в то время как в популяции лимфоцитов, подвергшихся гибридизации параллельно и с теми же условиями, флуоресцентный сигнал превысил сигнал контрольной пробы в 8,4 раза (рис.9). Это говорит о том, что уровень мРНК hTERT, выявляемый с помощью описываемой здесь методики, отражает действительную ситуацию в иммунокомпетентных клетках, и определение мРНК каталитической субъединицы теломеразы происходит с достаточной специфичностью.
Метод Flow-FISH дает возможность детекции ДНК/РНК последовательностей на уровне единичной клетки с помощью внутриклеточной in situ гибридизации зонда, меченого флуорохромом, с последующим анализом на проточном цитофлуориметре. Именно этот метод является традиционным для измерения числа теломерных повторов [Lansdorp P.M., 1996]. На рисунке 10 приведены шесть основных этапов Flow-FISH, каждый из которых в процессе выполнения данной работы был модифицирован для наиболее специфичного определения экспрессии мРНК hTERT в иммунокомпетентных клетках.
Экспрессия мРНК hTERT в стимулированных лимфоцитах
Так как все клетки лимфоидного ряда становятся способны экспрессировать теломеразу после неспецифической активации в культуре, было рассмотрено влияние поликлональной стимуляции лимфоцитов на экспрессию ими мРНК hTERT.
Всего было проанализировано 4 донора и по 2 пациента с РА и АД. На рисунке 25 приводится показательный результат одного из экспериментов, из которого следует, что в лимфоцитах как доноров, так и пациентов с РА и АД максимальное количество мРНК hTERT выявляется на третий день стимуляции, после чего ее количество постепенно снижается. Поэтому в дальнейшем содержание мРНК hTERT анализировали именно на третьи сутки поликлональной активации в культуре для всех исследуемых МНК, чтобы в каждом случае достичь максимального значения экспрессии мРНК и сравнить его с интактным.
При культивировании лимфоцитов доноров только лишь в присутствии IL-2 (без стимуляции awra-CD3 антителами) содержание в них мРНК hTERT не менялось значительно по сравнению с исходным, оставаясь примерно на уровне начального значения (т.е. как в интактных лимфоцитах) в течение недели. На рисунке 26 приводится показательный результат одного из трех экспериментов. Для сравнения на диаграмме отражена также динамика содержания мРНК hTERT в лимфоцитах (приведенная выше, на рис. 25), культивируемых параллельно, но в присутствии aHTH-CD3 антител.
По сравнению с интактными МНК, индуцированный уровень мРНК hTERT был достоверно повышен у доноров и пациентов с РА и БА. В отличие от этого, индуцированный уровень мРНК hTERT в лимфоцитах пациентов с АД достоверно не изменялся по сравнению с уровнем мРНК hTERT до стимуляции (рис.27).
Известно, что активность теломеразы, а также экспрессия мРНК hTERT в лимфоцитах строго контролируется в зависимости от дифференцировки и состояния активации. Поэтому исследуемые лимфоциты были распределены по фазам клеточного цикла, чтобы отделить покоящиеся лимфоциты (фазы клеточного цикла G1/G0) от лимфоцитов, находящихся в пролиферации (фазы S/M/G2) по сигналу ядерного красителя 7AAD.
На диаграмме для каждой переменной отображены: медиана, квартальный размах (25%, 75% процентили), размах (минимум, максимум). - достоверность отличий стимулированных лимфоцитов от интактных р 0,05 (критерий Вилкоксона). Данные приведены в %BRO.
Оказалось, что повышение экспрессии мРНК hTERT при стимуляции лимфоцитов доноров и РА достигалось именно за счет лимфоцитов, находящихся в фазах S/M/G2 клеточного цикла (экспрессия мРНК hTERT в этой фазе была достоверно повышена по сравнению с интактными лимфоцитами как в норме, так и при всех исследованных заболеваниях). Лимфоциты доноров, РА и АД, находящиеся в фазе G1/G0, экспрессировали мРНК теломеразы на одинаковом уровне независимо от того, были ли они выделены из интактных МНК или культивировались на протяжении 3 суток (рис.27). У пациентов с БА уровень мРНК hTERT в активированных лимфоцитах был повышен также и в фазе G1/G0 по сравнению с интактными лимфоцитами. Отличий исследуемых показателей от доноров выявлено не было.
Исследование активности теломеразы в лимфоцитах при поликлональной стимуляции
Активность теломеразы в лимфоцитах ПК исследовали с использованием набора TRAPeze RT (подробно методика описана в разделе Материалы и Методы). Полученный в результате показатель активности теломеразы выражен в относительных единицах (рис.31).
Содержание мРНК hTERT отображено в %BRO, содержание hTERT и активность теломеразы - в относительных единицах. Каждый образец был поставлен в дублях; на диаграмме приводится среднее значение. На 4 день стимуляции была произведена замена 50% среды на новую с 50 ед/мл IL-2.
МНК периферической крови условно здорового донора активировали в культуре в течение 7 суток в присутствии airra-CD3 антител и 50 ед/мл IL-2; на 4 день культивирования была произведена замена 50% среды на новую с тем же содержанием IL-2. В интактных лимфоцитах, а также в лимфоцитах, полученных с каждого дня культивирования, была определена активность теломеразы и содержание мРНК hTERT и hTERT. В результате было получено, что динамика активности теломеразы при стимуляции лимфоцитов в культуре повторяет динамику как мРНК hTERT, так и hTERT, достигая максимального значения на 3 сутки и затем постепенно снижаясь (рис.31). Но несмотря на то, что в интактных лимфоцитах присутствовал некоторый уровень мРНК hTERT и hTERT, активность теломеразы в них не была выявлена (находилась на уровне негативного контроля). Также было выявлено, что на 7 сутки культивирования активность теломеразы была низка, несмотря все еще довольно высокий уровень мРНК hTERT и hTERT в исследуемых клетках.
Далее было рассмотрено содержание мРНК hTERT, hTERT и активности теломеразы при культивировании лимфоцитов в присутствии различных концентраций IL-2.
При культивировании МНК периферической крови в отсутствии анти-СОЗ антител количество в них мРНК hTERT зависело от содержания IL-2 в среде (рис.32): при концентрации 50 ед/мл IL-2 содержание мРНК hTERT на 3 сутки культивирования не отличалось от интактных МНК, но при увеличении концентрации IL-2 до 100 и 200 ед/мл уровень мРНК достоверно возрастал по сравнению с начальным значением. Далее было исследовано содержание мРНК hTERT, hTERT и активности теломеразы в лимфоцитах ПК условно здорового донора при стимуляции анти-СБЗ антителами в течение 7 суток, но на этот раз содержание IL-2 в среде как изначально, так и после замены среды (на 4 и 5 сутки), было 100 ед/мл (рис.33).
Содержание мРНК hTERT отображено в %BRO, содержание hTERT и активность теломеразы - в относительных единицах. Каждый образец был поставлен в дублях; на диаграмме приводится среднее значение. На 3 и 5 день стимуляции была произведена замена 50% среды на новую с 100 ед/мл IL-2.
Как и в предыдущем случае, пик приходился на 3 сутки культивирования, и затем активность теломеразы снижалась, несмотря на увеличение количества мРНК hTERT и hTERT, содержание которых возрастало даже по сравнению с 3 сутками культивирования (рис.33). Из этого можно сделать вывод, что присутствие в клетках каталитической субъединицы теломеразы еще не гарантирует наличия в них теломеразной активности. Действительно, в то время как содержание мРНК hTERT и hTERT в лимфоцитах может достигать десятков процентов относительно содержания в клетках BRO (табл.12), активность теломеразы в них относительно клеток BRO крайне мала (особенно в интактных лимфоцитах). Таким образом, важное значение имеет определение содержания hTERT и ее мРНК в стимулированных лимфоцитах, так как именно наличие субъединицы hTERT является основополагающим для проявления активности фермента, которая в данном исследовании определялась в лимфоцитах только после их стимуляции (рис.33, табл.12). Тем не менее, количество hTERT в интактных лимфоцитах имеет значение для того, какого уровня достигнет содержание hTERT после стимуляции, поскольку между содержанием субъединицы hTERT в интактных и стимулированных лимфоцитах существует значимая положительная корреляция (табл.9).
Содержание мРНК hTERT отображено в %BRO, содержание hTERT и активность теломеразы - в относительных единицах, в скобках указано содержание в % от BRO. Каждый образец был поставлен в дублях; на диаграмме приводится среднее значение.
