Введение к работе
Актуальность проблемы.
Объем познаний в области гематологии огромен и постоянно возрастает, іяясь наукой о крови, клетках крови и кроветворных органах, гематология но и прочно связана с десятками направлений теоретической и практической (ицины и биологии. Зародившись как раздел описательной гистологии в пе-д бурного развития морфологических наук в середине XIX столетия, геология стала опорой в самостоятельном становлении и развитии цитологии мбриологии, микробиологии и иммунологии, генетики и онкологии, радиаци-юй медицины и биологии, комбустиологии и трансфузиологии. Пребывание остоянии постоянной физиологической регенерации делает клетки крови и іветворньїх органов исключительно удобной моделью для исследования зако-іерностей клеточной пролиферации, а многообразие морфологических форм ункций позволяет изучать тонкие механизмы дифференциации и созревания ток. Вскрытие закономерностей пролиферации и дифференцировки гемопоэ-:еских клеток,играющих жизненно важную роль в организме, продолжает ос-аться фундаментальной проблемой гематологии. Поддерживая целостность іавновесность своего состояния, гемопоэтическая ткань, циркулирующая вь и органы кроворазрушения чутко реагируют на изменение внутренней ды организма и формируют ответ, направленный на обеспечение гомеостаза. :пень возникающего при этом напряжения проявляет себя в транзиторных мических состояниях, лейкоцитозах и лейкопениях, снижении иммунореак-ности. Однако отличить функциональные сдвиги от симптомов специфичес-[ гематологической патологии, органических поражений и заболеваний явля-я сложной задачей, составляющей предмет дифференциальной диагностики, гуальной остается проблема точного прогноза направленности, течения и ода гематологических синдромов и заболеваний, эффективности их коррек-[ и медикаментозного лечения.
fla разных этапах развития гематологии ее успехи и неудачи во многом еделялись уровнем развития биологических наук в целом. Сегодня, как и 10-іет назад, успешное развитие теории кроветворения обоснованно связывают )стижениями молекулярно-генетической теории (Федоров Н.А.,1976;Чертков [., Гуревич О.А., 1984; Воробьев А.И., 1985; Козинец Г.И., 1987; ЧерковИ.Л. 0; Макаров В.П. и соавт., 1992; Rich I.N., LappinRJ., 1994 и др.). Неоспо-[ы успехи молекулярной биологии и генетики по изучению топких механиз-I управления процессами в кроветворной ткани. Обнаруженные структурные ррации хромосом, включая группы D и G, явились доказательством генетикой природы ряда острых и хронических миелопролиферативных заболева-[, важности генетических исследований в гематологии (Воробьев А.И., 1985; рамов СМ.,1987; Козинец Г.И., Погорелов В.М.,1990; Гейл Р.П., Буттурини 1991; Владимирская Е.Б. и соавт., 1996 ). Достаточно полно охарактеризована семья гемопоэтических ростовых фак-
торов (гемопоэтинов) или колониестимулирующих фаісгоров (КСФ), подразі ляемых на линейно - неспешіфические раннедействующие и линейно - спещ фические позднодействующие, обеспечивающие поддержание пролифераци дифференцирования и созревания кроветворных клеток (ОгаваМ., 1990; Гер рманнФ.исоавт.Д990;ТестаН., 1994;НатанД.Г.,ЗиффК.А., 1994; McKay] Leigh I., 1993; Nicola N. A., 1994). Клеточное происхождение и предназначен! позволили отнести также эти факторы к цитокинам и/ или интерлейкинам (Фрейдлин И.С., 1995; Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1995). Определен химическое строение, пространственная конфигурация молекул и их субъед ниц, аминокислотная последовательность белковых и функциональная роль > леводных компонентов гемопозтических гормонов, их происхождение и б» логические эффекты. Установлена точная локализация на хромосомах 2, 3,4, 7, 17, 19 генов гемопозтических факторов.С помощью биотехнологий получе и используются в эксперименте рекомбинантные ростовые факторы, и неукло но расширяется, начиная с 90-х годов, их успешное клиническое применею (Декстер Т.М., 1991; Захаров ЮМ., 1991, 1994; Долгушин И.И. и соавт., 199. 1997; Новобранцева Т.И.,1996; Metcalf D., 1993; Patchen M.L. et al., 1993; Espz N.J. etal., 1994 и др.). Таким образом, на примере гемопозтических гормоні наглядно продемонстрировано важное значение взаимодействия фундаментал ной науки и практики. Другим примером плодотворного внедрения фундаме: тальных разработок в медицину стала расшифровка структуры и функции кл< точных рецепторов - поверхностных молекул клеток крови и гемопоэтическ органов, определяющих клеточный фенотип, в том числе лейкозных клеток межклеточные и молекулярно - клеточные взаимодействия, столь необходим) для обеспечения нормального течения процессов кроветворения, и создание г базе полученных данных мошклоналышх антител для диагностики и лечені заболеваний крови (Брондз Б.Д., 1987; Зотиков Е.А.,1987; Барышников А.Ю. соавт., 1989; Кнапп В. и соавт., 1990; Кемниц Дж. и соавт, 1990; Абрамов В.К 1991; Яздовский В.В., 1991; Бочков Н.ГТ. исоавт.,1995 и др.).
Среди охарактеризованных более чем 100 специфических рецепторов,спис( которых постоянно пополняется (Козлов И.Г. исоавт.,1995), наряду с реце торами к гемопоэтическим гормонам, важнейшее функциональное значение д гемопозтических клеток имеют рецепторы контактного взаимодействия с мол кулами межклеточного матрикса и другими клегками, составляющими строи кроветворных органов или, как говорили ранее, гсмопоэтическое микроокруж ние (Фриденштейн А.Я., ЛурияЕ.А., 1980; Чертков Л.И., Гуревич О.А.,198' СадовниковаЕ.Ю. и соавт., 1988; Ястребов А.П. и соавт., 1988; Ругаль В.И. соавт., 1991;ГольдбергЕ.Д, ДыгайА.М., 1994;КантороваВ.И., 1994; Юшю Б.Г. и соавт., 1994; Tavassoli М.,1974; Trentin J.J.,1978; Armstrong J.W., Chape S.K., 1994; Wilson J.G., Tavassoli M., 1994 и др.). В настоящее время эти сіру туры объединены в понятие молекул адгезии ( САМ - cell adhesion molecule насчитывающих 5 подсемейств и более 50 индивидуальных молекул: супере мейство иммуноглобулинов, интегрины, селектины, кадхерины, протеогликаг
эценовскийВ.А., Барышников А.Ю., 1994; Адаменко Г.П., 1995; Козлов И.Г. оавт., 1995; Александров А.В. и соавт.,1997; Faull R.J. et al.,1994; Funk Ph. et 1994 и др.).
Наиболее наглядно и убедіггельно концепция роли межклеточных взаимо-іствий и кооперативных отношений различных ростков кроветворения в :спечении нормального функционирования гемопоэтической ткаїш проявила я на примере эритробластических островков (ЭО) костного мозга, представ-мцих собой ассоциацию клеток моноцитарного ряда и эрнтрондных клеток issis М., 1958 - 1991). Обнаружеїшьіе вначале у больных с железодефицитной ;мией на электронограммах костного мозга при изучении инкорпорации гра-1 ферритина в эритробласты (Bessis М., Breton-Gorius J.,1956), ЭО не сразу ни признаны морфо - функциональными единицами эритропоэза (Захаров М., Мельников И.Ю.,1984).Только благодаря разработке достаточно простых годов выделения и подсчета ЭО, удалось развернуть широкое фундаменталь-! изучение их в эксперименте (Le Charpentier Y., Prenant M.,1975; Prenant M., !0; Zakharov Y.M., Prenant M., 1982). С 1982 года в Российской Федерации логичные исследования стали проводиться в Челябинском медицинском ин-ггуте в лаборатории профессора Ю.М. Захарова Благодаря этим исследова-[м, удалось вкрыть функции, выполняемые макрофагами ЭО в отношении вивающихся эритроидных клеток, однако многие детали процесса фагоцито-i лизиса ядер нормобластов и неполноценных эритроцитов, обеспечения гтроидных клеток пластическим материалом, поддержания высоких концент-[ий эритропоэзрегулиругощих факторов, создания специфического эритропо-ческого микроокружеїшя, регуляции комплементарности клеток в ЭО оста-:я малоизученными до сих пор. Не в полной мере исследовано значение фун-юнальной активности макрофагов ЭО для поддержании эритропоэза в ост-іках. Учитывая, что макрофаги занимают ключевую позицию в цитокиновой уляторной сети, продуцируя и выделяя более 75 разнообразных молекул >ейдлинИ.С, 1995), можно считать перспективным углубленное изучение роли в поддержании эритропоэза в организме.Оставаясь частью системы фа-итарукшщх мононуклеаров, макрофаги островков могут реагировать на воз-цающие и повреждающие воздействия, ослабляя эритроиоэтическую функ-о, что непосредственным образом может сказаться на состоянии эритропоэза эганизме и привести к анемии. Вполне вероятно, что таков механизм разви-анемий при ожоговой травме, радиационном воздействии, инфекциях и ин-сикациях. Исследования в этом направлении могут помочь в поиске адекват-с способов профилактики и лечения анемических состояний, что делает изу-иеЭО костного мозга особо привлекательным. Для медицины актуальным ается получение точных и обоснованных критериев оценки состояния эрит-оэза в организме, и, как представляется, количественный и качественный лиз ЭО костного мозга, эритропоэза в островках полностью отвечает на дан-і запрос практики.
Цель исследования.
Целью выполненной работы явилось определение на основе новых методі количественного и качественного анализа роли и места эритробластически островков костного мозга в обеспечении пролиферации, дифференцирования созревания эритроидных клеток в условиях физиологической нормы и при тъ нении состояния эритропроэза в организме при возмущающих и повреждаюгщ воздействиях.
Задачи исследования.
В рамках поставленной цели решались следующие задачи:
-
Разработать, апробировать и внедрить в практику научных и клинически исследований методы количественного и качественного анализа эритробласт* ческих островков костного мозга человека и животных, классифицировал островки.
-
Апробировать и внедрить в практику научных исследований модифицирі ванные методы прижизненного исследования эритробластических островков
-
Изучить становление гемопоэтической функции эритробластических островков у животных в периоде раннего постнатального онтогенетическог развития.
-
Исследовать характер изменений эритропоэза в эритробластических ос ровках костного мозга при стимуляции эритропоэза в организме на фоне острі кровопотери, гемолитической анемии и при введении эритропоэтина.
-
Исследовать характер изменений эритропоэза в эритробластических ос ровках костного мозга при угнетении эритропоэза в организме на фоне пост трансфузионной полицитемии.
-
Изучить характер количественных и качественных изменений эритробла тических островков костного мозга при повреждающих воздействиях: термич< ком ожоге и общем однократном радиационном облучении организма в разны дозах.
-
Выявить характер количественных и качественных изменений эритробла тических островков при модуляции эритропоэтической функции их централь ных макрофагов на фоне иммунизации организма и при введении иммуномод) ляторов.
-
Изучить механизмы комплементарности клеток в эритробластически} островках и защитные эффекты ряда лекарственных средств в отношении под держания в них эритропоэза.
-
Исследовать особенное! и эритробластических островков костного мозі у гематологических больных и больных с гематологической симптоматикой.
10. Определить нормативные количественно - качественные характеристик
островков и эритропоэза в эритробластических островках костного мозга.
Научная новизна.
На основе вновь разработанного метода исследования эритробластических ровков ( Авторское свидетельство № 1309735 "Способ определения эритро-[стических островков" от 8 января 1985 г.) у гематологических больных и [ьных с гематологической симптоматикой охарактеризованы признаки нару-тий нормальных межклеточных взаимоотношений эритроиднойи моноци-ной линий кроветворения, имеющие важное диагностическое, дифферен-ільно - диагностическое и прогностическое значение, и показано, что эритро-істические островки костного мозга отражают сохранность или отклонения травильной организации эритропоэза у больного.
При экспериментальном моделировании различных состояний физиологи-кого напряжения гемопоэтических функций организма или патологических тояний доказана универсальная важная роль эритробластических островков ргангоации и регуляции эффективного эритропоэза у человека и животных. ;рвые проведённые расчеты позволили получить количествешше характе-ггики объемов островкового и внеостровкового эритропоэза. Впервые разработана классификация эритробластических островков, отра-ощая объем и интенсивность вовлечеїшя в эритропоэз в эритробластических ровках костного мозга эритроидных колониеобразующих клеток, объем и рость амплификации эритроидных клеток, интенсивность и эффективность созревания, выделены формы островков, свидетельствующие о глубоком ;авлении эритропоэза ("атипичные" островки) и, напротив, - о гиперрегене-орном течении эритропоэза ("суперостровки").
Впервые доказано, что наиболее важными, с функциональной точки зрения, актеристиками состояния эритропоэза в эритробластических островках слу- число митозов, количество ядросодержащих клеток и число ретикулоцитов троидной "короны", определенные в островках разных классов зрелости; :отическая активность эритроидных клеток охарактеризована также с попью включения метки 3Н-тимидина и определения статмокинетического [екса по числу К-митозов.
Наличие среди эритробластических островков "суперостровков", с числом осодержащих клеток более 32, находящихся на одной стадии развития, до-ивает возможность прохождения эритроидными колониеобразующими псами шести, а не пяти, как считалось ранее, последовательных делений. Зпервыена примере эритробластических островков продемонстрирована асциональная гетерогенность компартментов костного мозга трубчатых гей и их различный реактивный ответ на повреждающие воздействия. Впервые проведено углубленное изучение становления гемопоэтической подии эритробластических островков в раннем постнатальном онтогенезе, влена этапность этого процесса и особенности течения эритропоэза в эовках у молодых животных.
Впервые получены полномасштабные доказательства важного значения для держания эритропоэза в эритробластических островках активного функци-
онального состояния центральных макрофагов, в частности, их лизосомально-пластинчатого комплекса цитоплазмы. In vivo и in vitro продемонстрирован чувствительность макрофагов эритробластических островков к действию гор мона эритропоэтина, охарактеризована субпопуляция макрофагов костного мозга, тройных к эритропоэзу, как имеющая развитый лизосомальныи аппарат
Впервые расшифрованы механизмы комплементарности клеток вэритро бластических островках, нарушаемых при гемолитической анемии, термических ожогах, общем радиационном облучении организма, и показано, что вовлечение макрофагов эритробластических островков в процессы иммунологичеі кой направленности снижает их гемопоэтический потенциал.
На моделях термической травмы и общего радиационного облучения орг низма продемонстрированы протекторные эффекты церулоплазмина и преп; рата БИТО в отношении эритробластических островков костного мозга.
Теоретическое и практическое значение работы.
Полученные в работе результаты имеют фундаментальное значение для ме дицинской науки. На примере эритробластических островков ликвидируете} пробел в понимании роли межклеточных взаимодействий в подцержанш эритропоэза в организме, в частности, участия в нем клеток моноцитарного ря да, и конкретным содержанием наполняются понятия: клеточно-клеточные и гуморально-клеточные механизмы обеспечения процессов нормального гемоп эза, специфическое гемопоэтическое микроокружение и гемопоэтические ни ши. В экспериментальных исследованиях количественный и качественный анализ эритробластических островков костного мозга представляет собой тої кий и чувствительный инструмент вскрытия интимных механизмов нарушен» процессов нормального кроветворения, раннего обнаружения неблагоприятны: последствий воздействия возмущающих и повреждающих факторов. Полученные в работе результаты исследований открывают широкую перспектив целенаправленного научного поиска средств и методов коррекции нарушений эритропоэтической функции организма при длительных космических полета> хронических производственных интоксикациях, при экологическом загрязне нии среды обитания.
Раскрытые механизмы комплементарности клеток эритробластических ост ровков позволяют ио-новому взглянуть на проблему диагностики и лечена анемией различного генеза, включая постгеморрагическую, гемолитическую, ожоговую, пострадиационную гипорегенераторную и вызванную инфекцион ным началом. Разработка простого и доступного для практической медицины метода выделения и анализа эритробластических островков костного мозг человека позволяет использовать его для оценки эффективности лечебных Ml роприятийи прогнозирования течения заболеваний.
Для детской гематологии выявленные закономерности становления гемі поэтической функции эритробластических островков костного мозга могут быть полезными в расшифровке патогенеза анемий раннего детского возраста
Положения, выносимые на защиту.
-
Эффективный эритропоэз в организме человека и животных протекает в ггробластических островках костного мозга, представляющих собой морфо-нкционалъные единицы эритрона, количественный и качественный анализ горых дает исчерпывающую характеристику состояния эритропоэза.
-
Только становление гемопоэтической функции эритробластических ост-жов костного мозга обеспечивает адекватную продукцию эритроцитов в раз-іающемся организме при переходе кроветворения из печени и селезенки в тгный мозг.
-
Снижение комплементарности клеток эритробластических островков на не возмущающих либо повреждающих воздействий ведет к их диссоциации, )ушению нормальных взаимоотношений между клетками моноцитарного и ггроидного ряда, увеличению количества "атипичных" островков и эритроид-ных клеток вне островков, увеличению объема внеостровкового эритропоэза.
-
Наиболее полную и точную характеристику состояния эритропоэза в эрит-зластических островках дает количественный анализ числа митозов эритро-:шх клеток, самих ядросодержащих эритроидных клеток и ретикулоцитов, введенный в островках разных классов зрелости.
-
Популяция костномозговых клеток моноцитарного ряда, принимающих істие в образовании эритробластических островков, является частью системы гоцитирующих мононуклеаров, и модуляция функционального состояния ионуклеарных фагоцитов отражается на течении эритропоэза в островках.
Внедрение результатов исследования в практику.
Практическое внедрение результатов исследования осуществлялось по мере полнения плановых государственных научно-исследовательских работ и преставления отчетных материалов:
. Гуморально - клеточные взаимодействия в эритробластических островках ягного мозга в норме и их место в системе эритрона при некоторых экспери-ггальных состояниях. ( 1986 - 1988 гг., № гос. регистрации 01860004736 ). . Задание Государственного комитета СССР по науке и технике от 4 августа 58 г. №281 "О проведении дополнительных научно - исследовательских ют в области медицинской науки и техники ЦНИЛ Челябинского медицинс-о ипститутаМЗ РСФСР." (1988 - 1990 гг.).
. Морфо-фунциональныс свойства эритробластических островков,поддержи-эщие гемопоэз межклеточные взаимодействия у гематологических больных ри экспериментальных моделированиях эритропоэза. ( 1989 - 1993 гг., № . регистрации 01880086968).
. Изучение роли межклеточных взаимодействий и нейро-гуморальных меха-:мов в регуляции кроветворения в норме и патологии. ( 1989 - 1991 гг., Дого-| № 14/118/14, № гос. регистрации 01890046006).
. Молекулярные и клеточные механизмы регуляции кроветворения в норме и ологии. ( 1991 - 1995 гг., Договор № 14/ 235/ 29 ).
6. Роль клеточно - гуморальных взаимодействий и особенности метаболизма регуляции эритрона в норме и патологии (экспериментальные состояния) и прі анемиях различной этиологии у больных . (1994 - 1995 гг.).
Под грифом Министерства здравоохранения РСФСР издано и распростране но методическое письмо: "Количественная и качественная оценка эритропоэз; с помощью определения эритробластических островков костного мозга."
Метод количественного и качественного анализа эритробластических остро ков костного мозга человека внедрен на базе гематологического отделени Чеяябшгской областной клинической больницы № 1 и Челябинского городскої гематологического центра. Метод признан изобретением (А.с. № 1309735).
Исследование эритробластических островков костного мозга в эксперимет внедрено в практическую деятельность 15 учебных и научных учреждени: России и зарубежных стран (Болгария, Украина), на рабочих местах обучен более 30 врачей - лаборантов, аспирантов и стажеров - исследователей.
Апробация работы.
Материалы диссертационного исследования представлены и обсуждены н< симпозиумах, научных конференциях и конгрессах: "Кроветворные клетки предшественники в механизмах повреждения и компенсации системы крові (Челябинск, 1986 ); I съезд физиологов Уральского региона "Механизмы физи< логических функций" (Уфа, 1986); Второй Всероссийский съезд гематологов и трансфузиологов (Челябинск, 1986); "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при физиологических и патологических состояниях" (Челябинсі 1986,1988,1990); Республиканская конференция "Молекулярные и клеточные механизмы адаптации" (МоскваД986);ХУ съезд Всесоюзного физиологическої общества им. И.П. Павлова (Ленинград, 1987); ХІ11 научная конференция пате физиологов Урала "Патология дыхания, крови и регулирующих систем органи ма и принципы коррекции нарушений" (Ижевск, 1989); IV Всесоюзный съез; патофизиологов "Нарушения механизмов регуляции и их коррекция" (Москвг 1989); II съезд физиологов Уральского региона "Физиологические механизмы адаптации человека и животных " (Свердловск, 1990); конференция "Лабора торные животные для медико - биологических и биотехнологических исследог ний (Москва, 1990 ); конференция ассоциации физиологов Европы (Чехослова кия, Прага,1990); конференции патофизиологов Урала "Системные и клеточнь механизмы адаптации организма к действию повреждающих факторов" (Чел) бинск,1991); 1 Учредительный конгресс международного союза патофизиологе (Москва, 1991); III Всесоюзный съезд гематологов и трансфузиологов (Mocks 1991); Российский научный симпозиум "Экологические факторы и кроветворе ние (Москва, 1992); XXXII конгресс международного союза физиологически наук ( Англия, Глазго, 1993); Ш (XVI) Учредительный съезд физиологическої общества России им. И.П. Павлова (Пушино, 1993); 14 международный симш зиум "Диоксин" (Япония, Киото, 1994); международная конференция "Новы технологии в медицине" (Трехгорный, 1996); конференция "Механизмы адапті
и организма" (Томск, 1996); III Всероссийский съезд гематологов и трансфу-элогов (Санкт - Петербург, 1996). Публикации.
Всего по материалам диссертациошюго исследования опубликовано 56 работ, них - 29 статей в центральных и международных периодических изданиях, /дах международных и Всероссийских конференций. Структура и объем диссертации.
Диссертация представлена на420 страницах машинописного текста, иллюст-рована 65 таблицами, 21 рисунками и 111 микрофотографиями. Состоит введения, обзора литературы, 2 глав материалов и методов исследования, -лав с изложением результатов собственных исследований, обсуждения, зак->чения, выводов и списка использованной литературы, включающего 732 гочников, в том числе 520отечественных и 212 иностранных.
