Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Toll-подобные рецепторы, общие сведения 12
1.2. Сигнальные пути Toll-подобных рецепторов 13
1.3. Эндогенные лиганды Toll-подобных рецепторов
1.3.1. Белки теплового шока 22
1.3.2. Фибриноген 23
1.3.3. Экстра домен А фибронектина 25
1.3.4. Гепаран-сульфат 26
1.3.5. Гиалуронат 26
1.3.6. Белок HMGB
1.4. Роль эндогенных лигандов Toll-подобных рецепторов в развитии патологии 30
1.5. Роль баланса про- и противовоспалительных цитокинов при патологии 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Объекты исследования 40
2.2. Клиническая характеристика обследованных больных 40
2.3. Реактивы 43
2.4. Выделение сыворотки крови 43
2.5. Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови человека 44
2.6. Культивирование МНК периферической крови человека 44
2.7. Оценка влияния лорноксикама на выработку цитокинов МНК периферической крови здоровых доноров in vitro 45
2.8. Определение концентрации цитокинов в сыворотках и культуральных супернатантах методом иммуноферментного анализа 47
2.9. Статистическая обработка результатов 50
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 51
3.1. Разработка дизайна исследования 51
3.2. Изучение выработки про- и противовоспалительных цитокинов МНК периферической крови больных ОДП в динамике
3.2.1. Оценка спонтанной,и индуцированной лигандами TLR продукции ФНОа МНК здоровых доноров и больных ОДП в динамике 54
3.2.2. Оценка спонтанной и индуцированной лигандами TLR продукции ИЛ-6 МНК здоровых доноров и больных ОДП в динамике 55
3.2.3. Оценка спонтанной и индуцированной лигандами TLR продукции ИЛ-8 МНК здоровых доноровіи больных ОДП в динамике 57
3.2.4. Оценка спонтанной и индуцированной лигандами TLR продукции ИЛ-10 МНК здоровых доноров и больных ОДП в динамике 59
3.3. Изучение продукции про- и противовоспалительных цитокинов МНК периферической крови больных с различным течением ОДП 62
3.3.1. Оценка продукции ИЛ-6 МНК периферической крови больных с разным течением ОДП 63
3.3.2. Оценка продукции ИЛ-8 МНК периферической крови больных с разным течением ОДП 68
3.3.3. Оценка продукции ИЛ-10 МНК периферической крови больных с разным течением ОДП 72
3.4. Оценка баланса цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови больных с разным течением ОДП в динамике 76
3.4.1 Оценка баланса цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови, здоровых доноров 78
3.4.2 Оценка баланса цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови, у больных I группы в динамике ОДП 79
3.4.3 Оценка баланса цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови, у больных II группы в динамике ОДП 82
3.4.4 Сравнение баланса цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови, у больных I и II групп в динамике ОДП 86
3.5 Исследование возможности коррекции цитокинового профиля с помощью нестероидного противовоспалительного средства лорноксикам 92
3.5.1 Влияние лорноксикама на опосредованную TLR 1/2 и TLR 4 выработку про- и противовоспалительных цитокинов in vitro 92
3.5.2 Влияние лорноксикама на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов МНК периферической крови пациентов с ОДП в динамике 95
Заключение 103
Выводы 109
Практические рекомендации 110
Список литературы 111Q
- Эндогенные лиганды Toll-подобных рецепторов
- Клиническая характеристика обследованных больных
- Оценка спонтанной,и индуцированной лигандами TLR продукции ФНОа МНК здоровых доноров и больных ОДП в динамике
- Исследование возможности коррекции цитокинового профиля с помощью нестероидного противовоспалительного средства лорноксикам
Введение к работе
Актуальность исследования
На сегодняшний день изучение системы врожденного иммунитета и, в частности, группы Toll-подобных рецепторов (TLR) является актуальным и одним из наиболее перспективных направлений современной иммунологии. Известно, что TLR осуществляют распознавание молекулярных паттернов, ассоциированных с различными патогенными микроорганизмами (Pathogen-Associated Molecular Patterns - PAMP), запуская, таким образом, эффекторные механизмы врожденного иммунитета [Bianchi M.E., 2007]. Активация TLR обуславливает экспрессию множества генов хемокинов и провоспалительных цитокинов. Помимо цитокинов, усиливается экспрессия молекул адгезии, противомикробных пептидов, белков острой фазы воспаления, NO-синтазы, циклооксигеназы. Все это приводит к развитию воспалительной реакции [Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С. и др., 2007].
Кроме того, в настоящее время известно, что помимо бактериальных и вирусных компонентов, TLR могут распознавать и эндогенные молекулы, появляющиеся при повреждении тканей, т.е. молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждением (Damage-Associated Molecular Patterns - DAMP). За счет этого происходит вовлечение системы врожденного иммунитета в асептическое воспаление, удаление некротических масс и, впоследствии, восстановление поврежденной ткани [Bianchi M.E., 2007; Piccinini A.M., Midwood K.S, 2010]. Однако, изменение активности TLR, в частности, чрезмерная продукция провоспалительных цитокинов, приводящая к усилению воспалительного ответа, может становиться повреждающим фактором, вовлекаясь тем самым в патогенез основного заболевания [Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С. и др., 2008]. Установлено участие TLR в патогенезе множества воспалительных и аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, сепсис, системная красная волчанка, атеросклероз и инфаркт миокарда [Piccininiand A.M. et al., 2010; Erridge C., 2010].
Острый деструктивный панкреатит (ОДП) – заболевание, в основе которого лежит повреждение ткани поджелудочной железы, сопровождающееся воспалительной реакцией, приобретающей в той или иной степени системный характер, которая зачастую может приводить к полиорганной недостаточности [Weber C.K., Adler G., 2001; Shen Y. et al., 2011]. Этим объясняется высокий уровень смертности, составляющий более 10% в начальный период заболевания. В таких случаях очень важна возможность раннего прогноза течения острого деструктивного панкреатита, которая может дать преимущества при лечении заболевания.
В настоящее время имеется достаточно работ, посвященных изучению уровня провоспалительных цитокинов при ОДП. Установлено, что ведущую роль в патогенезе играют такие провоспалительные цитокины как ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО, именно их гиперпродукция («цитокиновый шторм») на первой неделе заболевания может привести к развитию системной воспалительной реакции [Novovic S. et al., 2009; Shen Y. et al., 2011]. При этом повышение уровня ИЛ-6 и ИЛ-8 тесно коррелирует с тяжестью заболевания. Известно, что продукция этих цитокинов ассоциирована с активацией TLR [Ding J. et al., 2009].
Однако до настоящего времени роль функциональной активности TLR при ОДП изучена недостаточно. Кроме того, не встречается работ по изучению роли соотношения уровней различных провоспалительных цитокинов, а также баланса про- и противовоспалительных цитокинов при ОДП. По нашему мнению не столько уровень, сколько баланс цитокинов может определять направление течения заболевания. Также представляется актуальным изучить возможность терапевтического воздействия, направленного на коррекцию функциональной активности TLR при ОДП.
Цель исследования:
Определить выработку и баланс про- и противовоспалительных цитокинов, продуцируемых мононуклеарными клетками (МНК) периферической крови больных ОДП, под действием лигандов TLR, в динамике заболевания, и оценить их прогностическую значимость.
Задачи исследования:
-
Оценить спонтанную и индуцированную лигандами TLR2 и TLR4 продукцию про- и противовоспалительных цитокинов МНК периферической крови больных ОДП, по сравнению со здоровыми донорами
-
Оценить возможные различия в цитокиновом профиле МНК периферической крови больных ОДП.
-
Разработать метод оценки баланса нескольких цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови больных ОДП, в динамике заболевания.
-
Оценить возможность прогноза течения заболевания по уровню и балансу цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови больных ОДП, на ранних сроках заболевания.
-
Исследовать возможность терапевтического воздействия, направленного на коррекцию функциональной активности TLR при ОДП.
Научная новизна работы
Впервые получен профиль спонтанной и индуцированной лигандами TLR2 и TLR4 продукции провоспалительных (ФНО, ИЛ-6, ИЛ-8) и противовоспалительных (ИЛ-10) цитокинов в культуре МНК периферической крови больных ОДП в динамике заболевания, установлена его связь с течением заболевания. На основе разработанного нами способа оценки баланса цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови, сформулированы критерии для оценки прогноза течения ОДП.
В опытах in vitro установлено, что нестероидное противовоспалительное средство лорноксикам подавляет индуцированную лигандами TLR продукцию исследуемых цитокинов. Выявлена возможность коррекции спонтанной и индуцированной лигандами TLR продукции МНК периферической крови больных ОДП провоспалительных цитокинов (преимущественно ФНО и ИЛ-6) с помощью лорноксикама. Тяжесть течения и исход острого панкреатита зависят от смещения баланса цитокинов, индуцируемых через рецепторы врожденного иммунитета, фармакологическая коррекция позволяет изменять соотношения цитокинов, улучшая течение заболевания.
Практическая значимость работы
Выявленные изменения в соотношении продукции цитокинов на ранних сроках заболевания у больных с различным клиническим течением острого деструктивного панкреатита могут служить прогностическим критерием течения заболевания. Показано, что подавление выработки провоспалительных цитокинов при использовании лорноксикама на ранней стадии улучшает течение заболевания.
Положения, выносимые на защиту:
-
Профиль цитокинов, продуцируемых мононуклеарными клетками периферической крови больных острым деструктивным панкреатитом, коррелирует с клиническим течением заболевания.
-
Баланс между ИЛ-6 и ИЛ-8 может служить прогностическим критерием течения и исхода острого деструктивного панкреатита на ранних сроках заболевания.
-
Коррекция профиля и баланса цитокинов позволяет изменять течение острого деструктивного панкреатита, направляя его в более благоприятную сторону.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования используются в практической работе хирургического отделения ГКБ № 55 г. Москвы.
Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс студентов, ординаторов и аспирантов кафедр иммунологии и хирургии РНИМУ им. Н.И. Пирогова.
Апробация работы
Диссертация апробирована на совместной научной конференции кафедры иммунологии, кафедры экспериментальной и клинической хирургии и отдела иммунологии ГБОУ ВПО "РНИМУ им Н.И. Пирогова" от 05 апреля 2011 года.
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на научных заседаниях кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГБОУ ВПО "РНИМУ им. Н.И. Пирогова" МЗСР РФ, на Международной Пироговской Конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 6 в журналах, рекомендуемых ВАК Российской Федерации.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 184 источников (11 отечественных и 173 зарубежных). Работа содержит 4 таблицы и 38 рисунков.
Эндогенные лиганды Toll-подобных рецепторов
Соединения, распознаваемые TLR, включают липиды, липопротеиды, белки и нуклеиновые кислоты широкого спектра микроорганизмов, таких как бактерии, вирусы и грибы [150]. Однако уже сейчас имеется; достаточно сведений о том, что эндогенные молекулы, появляющиеся в результате гибели клеток организма (Damage-Associated Molecular Patterns - DAMP), при некоторых условиях также могут стимулировать TLR, приводя к развитию или- усилению воспаления и аутоиммунным реакциям [158].
Этиология многих воспалительных и аутоиммунных заболеваний до сих пор остается неясной. Зачастую не совсем; понятно, что является триггером начала таких заболеваний и почему механизмы иммунной регуляции, до этого всегда работавшие исправно вдруг дают сбош Однако известно, что все подобные заболевания характеризуются наличием значительного повреждения и деструкции собственных тканей организма. В результате этого, локально или системно, происходит выброс большого количества эндогенных молекул [86].
Защита от опухолей и быстро развивающихся вирусов, которые не синтезируют молекулы, способные активировать клетки иммунной системы, требует общего механизм мониторирования состояния ткани [148]. Многоклеточные организмы при вторжении чужеродных организмов и повреждении ткани способны к развитию врожденного (в случае позвоночных, и приобретенного) иммунного ответа. У растений и беспозвоночных эти ответы инициируются, когда происходит деградация повсеместных макромолекул, фрагменты которых затем взаимодействуют с рецепторами врожденного иммунитета. Вполне логично предположить сходные механизмы и у высших животных.
Первые данные о том, что эндогенные лиганды могут активировать рецепторы врожденного иммунитета появились еще в 2000 году, когда было показано, что белок теплового шока HSP60 может вызывать синтез цитокинов через активацию TLR4 [102, 157]. Примерно в это же время было показано, что в результате некроза клеток, их внутреннее содержимое попадает в кровь и тканевую жидкость и может через TLR2 индуцировать экспрессию генов, кодирующих провоспалительные цитокины и медиаторы, обеспечивающие регенерацию тканей.
Известно, что в синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом присутствует широкий спектр эндогенных лигандов TLR, включая белки теплового шока (HSP), HMGB1, ДНК (собственная), фибриноген, FNEDA, тенасцин-С. При этом в синовиальной жидкости здоровых доноров и больных вне обострения этих веществ не обнаруживается [43, 87, 118, 123, 125, 149, 183]. Высокий уровень тенасцина-С и HMGB1 присутствует и. в плазме крови больных с сепсисом [122, 171], а для системной- красной волчанки характерно наличие в плазме большой концентрации циркулирующих ДНК-содержащих иммунных комплексов-[153], в частности комплекс нуклеосома-HGMB 1 [163, 164]. Кроме того, в плазме и бронхо-альвеолярном смыве пациентов с воспалительными заболеваниями легких обнаруживаются высокие значения содержания низкомолекулярных фрагментов гиалуроновой кислоты (ГК). В большинстве случаев показатели количества эндогенных лигандов TLR отражают активность заболевания и коррелируют с активностью воспалительного процесса [15]. Так, уровень белков MRP8 и MRP14, относящихся к семейству кальций-связывающих белков S100, в синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом на порядок сильнее коррелирует с активностью воспалительного процесса при данном заболевании, чем уровень С-реактивного белка [47].
Обоснованность такого рода предположений подтверждают экспериментальные данные, полученные in vivo на мышах с использованием моделей некоторых воспалительных заболеваний. Показатели уровня многих эндогенных DAMP значительно возрастают при различных заболеваниях, моделируемых на мышах. Вдобавок к этому известны эксперименты, в ходе которых подтверждено, что введение DAMP in vivo может приводить к развитию воспаления за счет активации TLR. Так, внутрисуставное введение лигандов TLR4, таких как тенасцин-С или FNEDA, приводит к развитию воспаления сустава у мышей дикого типа, у мышей с инактивированными генами TLR4 это не приводит к таким последствиям [52, 92]. Аналогично, системные инъекции гепаран-сульфата (ГС) приводят к развитию- сепсиса, аналогичного таковому при инъекциях ЛПС и зимозана, у мышей дикого типа, чего не наблюдается у мышей с отсутствующими TLR4 [71]. Еще один пример — это выработка цитокинов, индуцируемая ДНК, высвобожденной из погибших гепатоцитов, через TLR9 в мышиной модели повреждения печени ацетаминофеном [85].
В настоящее время эндогенные лиганды TLR активно изучаются. Данные, полученные in vitro, такие как иммунопреципитация, изучение функциональной активности TLR в ответ на эндогенные лиганды, а также данные in vivo с использованием мышей, нокаутированных по генам TLR или их адапторным молекулам, дают много новой информации о действии активаторов TLR
Список эндогенных активаторов TLR2 и TLR4 неуклонно расширяется и охватывает все больше внутриклеточных молекул, таких как обширное семейство белков теплового шока (hsp60, hsp70, hsp22, hsp72 и других), Gp96, HMGB1, а также включает молекулы экстрацеллюлярного матрикса, таких как бигликан, версикан, олигосахариды гиалуроновой кислоты, гепаран-сульфат и другие [111]. Собственные нуклеиновые кислоты тоже были описаны как эндогенные лиганды для Toll-рецепторов. Например, мРНК распознается TLR3, двухспиральная РНК (ssPHK) распознается TLR7 и TLR8, а комплекс IgG-хроматин распознается TLR9. Представляется интересным то, что антифосфолипидные антитела (APL) могут активировать как TLR7 и TLR8, так и TLR2 и TLR4, причем у больных с APL-синдромом они активируют вначале TLR7 и TLR8 [184].
Клиническая характеристика обследованных больных
Ферментативная фаза (1-5 сутки) — данная фаза характеризуется формированием очагов панкреонекроза различной протяженности. В данный период происходит запуск каскада воспалительной реакции, что может приводить к раннему развитию синдрома полиорганной недостаточности. В этот период летальность среди пациентов может достигать 11% [9, 10].
Реактивная фаза или фаза асептических осложнений (6-14 сутки) -данный период характеризуется реакцией организма на сформировавшиеся очаги некроза [9, 10]. Наблюдается развитие воспаления и образование инфильтрата в ткани поджелудочной железы. В эту фазу может развиваться поздний синдром полиорганной недостаточности. Дальнейшее клиническое течение заболевания может проходить по-разному. В.наиболее благоприятном варианте течения происходит рассасывание перипанкреатического инфильтрата и дальнейшее выздоровление. При менее благоприятном течении происходит асептическое расплавление и секвестрация очагов некроза в ткани поджелудочной железы, возможно формирование псевдокист. В случае транслокации кишечной флоры может происходить септическое расплавление и секвестрация с дальнейшим развитием гнойных осложнений - это наименее благоприятный вариант развития- заболевания [8]. Среди вошедших в исследование пациентов не зарегистрировано случаев присоединения инфекции с дальнейшим развитием гнойных осложнений.
Группу I больных ОДП составили больные, находившиеся в стационаре ГКБ № 55 12±3 койко-дней. К этому времени у них наблюдалось рассасывание перипанкреатического инфильтрата, т.е. наблюдался наиболее благоприятный вариант течения острого панкреатита. В данную группу вошли 16 человек в возрасте 20-60 лет: 9 мужчин и 7 женщин.
Группу II больных ОДП составили больные, находившиеся в стационаре 30±10 койко-дней. У них наблюдалось менее благоприятное течение заболевания: асептическое расплавление и секвестрация очагов некроза в ткани поджелудочной железы. В данную группу вошли 14 человек в возрасте 35-60 лет: 8 мужчин и 6 женщин. Кроме того, в этой группе отмечено развитие ряда осложнений в течении ОДП, таких как ферментативный перитонит и формирование псевдокисты.
Все пациенты получали стандартную терапию, предусмотренную протоколом ведения больных с ОДП. Помимо нее, группе пациентов дополнительно проводилась терапия с использованием нестероидного противовоспалительного средства лорноксикам. Всего, среди набранных больных, присутствовало 16 человек, получавших дополнительно лорноксикам. Лечение остальных 14 человек проводилось с использование только стандартной терапии.
Кровь для получения сыворотки набиралась в пробирки с активатором свертывания и разделительным гелем (олефиновый гель). Активатором свертывания в пробирке служит напыление из диоксида кремния. После образования сгустка, пробирку центрифугировали 15 минут с ускорением 1500 G (3000 об/мин) для максимального выдавливания сыворотки из сгустка. После центрифугирования и полной ретракции сгустка сыворотку собирали и хранили в течение 2-3 месяцев при температуре -70С. Концентрацию цитокинов в полученной сыворотке определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА).
Суспензию мононуклеарных клеток выделяли из периферической крови человека по методу Boyum, основанному на седиментации в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина [3].
Выделение МНК проводили в стерильных условиях при комнатной температуре. 15 мл гепаринизированной крови человека (25 ед. гепарина на 1 мл крови) разводили в 3 раза (1 часть крови и 2 части среды 199), тщательно перемешивали и наслаивали на раствор фиколл-урографина (плотность 1,077
г/см ), затем центрифугировали 45 минут при 400 G (1700 об/мин) в центрифуге с горизонтальным ротором. После центрифугирования собирали интерфазное кольцо, содержащее МНК. Суспензию МНК трижды отмывали средой 199, центрифугируя по 10 минут при 200 G, после чего клетки ресуспендировали в 1 мл среды RPMI 1640, содержащей антибиотик — гентамицин (100 мкг/мл). Количество выделенных МНК подсчитывали в камере Горяева по стандартно методике. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью 0,1% раствора трипанового синего. Жизнеспособность клеток после выделения была выше 95%.
МНК, выделенные из периферической крови, культивировали в полной среде RPMI 1640, содержащей антибиотик (гентамицин) и 10% ЭТС, в течение 24 и/или 48 часов при 37С. Рабочая концентрация клеток составляла 1 106 в мл. В качестве лигандов TLR использовали следующие стимуляторы: ЛПС, зимозан, пептидогликан в концентрациях 0,1 мкг/мл, 10 мкг/мл и 2,5 мкг/мл, соответственно. Контролем служили МНК, культивируемые в чистой среде RPMI 1640. По окончании культивирования МНК осаждали центрифугированием при 400 G в течение 15 минут. Супернатанты собирались и хранились в течение 2-3 месяцев при -70С. Концентрацию цитокинов в полученных супернатантах определяли методом иммуноферментного анализа. Общая схема эксперимента представлена на рисунке 2.
Оценка спонтанной,и индуцированной лигандами TLR продукции ФНОа МНК здоровых доноров и больных ОДП в динамике
На рисунке 7 видно, что спонтанная продукция ИЛ-8 МНК больных острым панкреатитом по сравнению со здоровыми донорами имеет тенденцию к повышению уже на 1 сутки заболевания и составляет 3435 (2573 -3933) пг/мл и 10370 (2379-19151) пг/мл у здоровых доноров и больных ОДП, соответственно (однако разница статистически не достоверна р=0,2). К 3-м суткам течения заболевания спонтанная выработка ИЛ-8 повышается до
7 сутки 14 сутки 12467 (7820-22031) пг/мл, разница по сравнению с группой здоровых доноров становится достоверной (а=0,05), высокий уровень спонтанной продукции ИЛ-8 держится вплоть до 14 суток заболевания. Индуцированная пептидогликаном выработка ИЛ-8 также статистически значимо повышается только к 3-м суткам и составляет в этот период 22735 (18610-27783) пг/мл. Что же касается продукции, индуцированной ЛПС, то здесь наблюдается достоверное (а=0,05) отличие от группы контроля уже в 1-е сутки заболевания и составляет 22743 (15499-26800) пг/мл. На 14-е сутки отмечается тенденция к снижению индуцированной выработки ИЛ-8 (уровень значимости различий а=0,1).
Таким образом, как и отмечено в литературе повышение уровня продукции ИЛ-8 характерно для ОДП и во многом коррелирует с уровнем продукции ИЛ-6. Представляется вероятным, что именно уровень этих цитокинов будет отражать тяжесть течения. заболевания (такие же данные имеются и в известных литературных источниках [100]). Поскольку, как уже отмечалось, высокие значения разбросов показателей могут свидетельствовать о неоднородности группы больных, связанной с разницей в клиническом течении заболевания, в дальнейшем необходимо провести анализ закономерностей связанных с уровнем данных цитокинов. Именно ИЛ-6 и ИЛ-8 видятся как одни из возможных предикторов прогноза течения ОДП.
ИЛ-10 является одним из важнейших противовоспалительных цитокинов. Его продукция осуществляется в основном Т и В-лимфоцитами, моноцитами, а также макрофагами. Он подавляет продукцию многих провоспалитлеьных цитокинов, таких как ИЛ-1, ФНОа, ИЛ-6 и ИЛ-8, таким образом, осуществляя отрицательную обратную связь в воспалительном ответе. Некоторые литературные источники утверждают, что ИЛ-10 может улучшать течение ОП. Уровень ИЛ-10 в сыворотке больных ОП повышается на 7-14 сутки, в это же время снижается количество провоспалительных цитокинов [83]. По мнению некоторых авторов, противовоспалительная роль ИЛ-10 не доказана, поскольку, при проведении исследований по клиническому применению ИЛ-10 в качестве противовоспалительного препарата, достоверного значимого результата получено не было [107]. В настоящее время вопрос о роли ИЛ-10 при ОДП и его возможном положительном эффекте до сих пор остается открытым.
Оценка полученных нами данных соответствует литературным данным. Результат оценки спонтанной и индуцированной лигандами TLR продукции ИЛ-10 МНК периферической крови пациентов с ОДП представлен на рисунке 8.
На диаграмме видно, что начало заболевания (1-3 сутки) не отличается по уровню выработки ИЛ-10 от группы контроля. Однако уже к 7-м суткам течения ОДП наблюдается выраженное усиление продукции ИЛ-10, как спонтанно, так и при индукции, опосредованной активацией TLR. То есть в динамике ОДП, вероятно, происходит смещение цитокинового баланса в сторону противовоспалительных цитокинов. При этом стимуляция TLR, имеющая место за счет эндогенных лигандов, должна приводить более к усилению регенеративных процессов, нежели к воспалению. Что в итоге должно привести к восстановлению поврежденных тканей и прекращению заболевания. Конечно, полученные данные не позволяют с уверенностью сказать, что именно ИЛ-10 обеспечивает подавление воспалительной реакции. Скорее можно говорить об общем изменении характера воспалительного процесса, сопровождающемся снижением продукции провоспалительных и увеличением выработки противовоспалительных цитокинов. Поэтому литературные данные, показывающие отсутствие терапевтического эффекта от введения ИЛ-10 [22], становятся вполне понятными. Поскольку несвоевременное увеличение уровня ИЛ-10 может не влиять (и даже оказывать негативное действие) на течение заболевания.
В заключение данного раздела можно сказать, что у больных ОДП по сравнению с группой здоровых доноров наблюдается повышение индуцированной лигандами TLR, а в некоторых случаях и спонтанной выработки провоспалительных цитокинов ИЛ 6 и ИЛ 8 мононуклеарными клетками. Таким образом, мы можем сказать, что клетки экспрессирующие TLR у больных ОДП обладают повышенной функциональной активностью, проявляющейся в повышенной продукции провоспалительных цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-8). К 7-14 суткам течения ОДП происходит усиление индукции противовоспалительного цитокина ИЛ-10.
При оценке продукции цитокинов МНК периферической крови больных ОДП нами отмечена высокая вариабельность показателей продукции цитокинов, что свидетельствует о неоднородности клинического течения заболевания в набранной группе больных. При оценке баланса исследуемых цитокинов была выявлена интересная закономерность. Рассмотрение пациентов по отдельности показало, что часть набранных больных имела высокие показатели продукции ИЛ-6 при одновременном снижении уровня ИЛ-8 (на рисунке 9 отмечены звездочками). У другой части больных наблюдалась противоположная картина.
Исследование возможности коррекции цитокинового профиля с помощью нестероидного противовоспалительного средства лорноксикам
Активация TLR2 и TLR4 лигандами приводит к индукции MyD88-зависимого пути, экспрессии транскрипционного фактора NF-KB, выработке провоспалительных цитокинов, развитию реакций врожденного иммунитета, а в дальнейшем запуску адаптивного иммунного ответа. TLR-опосредованная выработка как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов осуществляется через сигнальные пути с участием транскрипционного фактора NF-KB. ОН играет важную роль в активации синтеза многих воспалительных медиаторов и цитокинов [126]. Известно, что ингибиторы ЦОГ-2 подавляют активацию NF-KB, наблюдаемую в норме через 8 часов после развития ОП [133]. Лорноксикам в экспериментах на мышах подавляет активность NF-KB И угнетает выработку ФНОа [181]. Возможно, ингибирующее действие лорноксикама на выработку провоспалительных цитокинов и ИЛ-10 МНК периферической крови осуществляется через подавление активации фактора транскрипции NF-KB.
В результате исследования продукции провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНОа) МНК периферической крови больных ОДП выявлено, что в группе пациентов, получавших лорноксикам, с 3 суток заболевания отмечается достоверно более низкий уровень провоспалительных цитокинов, чем в группе базисной терапии.
Так спонтанная продукция ИЛ-6 достоверно ниже в группе, получавшей лорноксикам, на 3 и 14 сутки течения ОДП, составляя 198 (82,01-1216,3) пг/мл и 169 (168,31-543,62) пг/мл, соответственно, по сравнению с 2382 (1352-3507) пг/мл и 3239 (2649-3829) пг/мл. Кроме того, в группе стандартной терапии в динамике наблюдается тенденция к повышению спонтанной продукции ИЛ-6 МНК периферической крови, в то время как в группе лорноксикама заметна тенденция к снижению этого показателя от исходного уровня (Рис. 34).
Рисунок 34. Спонтанная продукция ИЛ-6 МНК периферической крови больных ОДП при стандартной терапии и терапии с применением лорноксикама. - различия между группами достоверны, а=0,05.
При оценке индуцированной лигандами TLR продукции ИЛ-6 наблюдается похожая картина. Уровень стимулированной ЛПС продукции ИЛ-6 в группе лорноксикама достоверно ниже на 3 и 7 сутки течения заболевания (Рис. 35), составляя 8228 (4969-9522) пг/мл и 9000 (5331-11507) пг/мл, соответственно, по сравнению с 13522 (10059-20871) пг/мл и 14088 (11982-15398) пг/мл. 22000
При стимуляции ПГ наблюдается похожая картина, здесь различия между группами достоверны на 3, 7 и 4 сутки. Это не полностью соответствует результатам, полученным нами in vitro, где продукция ИЛ-6, стимулированная ЛПС, не ингибировалась лорноксикамом даже при максимальной концентрации. Это может быть связано с основным действием лорноксикама как НПВС, воздействующего на метаболизм арахидоновой кислоты посредством ингибирования как ЦОГ-1, так и ЦОГ-2, таким образом, подавляя развитие воспалительного ответа, основанного на действии эйкозаноидов.
Изменения в продукции ИЛ-8 МНК между группами стандартной терапии и терапии с применением лорноксикама наблюдаются только при спонтанной секреции. Она достоверно ниже в группе, получавшей лорноксикам, на 3 течения панкреатита и составляет 12050 (9037-17914) пг/мл по сравнению с показателем группы, получавшей стандартную терапию 21793 (19953-23634) пг/мл. В дальнейшей динамике наблюдается тенденция к повышению уровня спонтанной выработки ИЛ-8 (Рис. 36).
Спонтанная продукция ИЛ-8 МНК периферической крови больных ОДП при стандартной терапии и терапи с применением лорноксикама. - различия между группами достоверны, а=0,05. При стимуляции лигандами TLR достоверные различия между группами наблюдаются на 7 сутки, в этот период продукция ИЛ-8 МНК периферической крови в группе пациентов, получавших лорноксикам, выше, чем в группе стандартной терапии и составляет 25004 (22700-25881) пг/мл и 18559 (15609-20147) пг/мл, соответственно. Таким образом, здесь мы видим довольно слабое влияние лорноксикама на уровень ИЛ-8, которое проявляется только в отношении спонтанной продукции. Однако, как в отношении спонтанной, так и в отношении индуцированной лигандами TLR продукции ИЛ-8 в группе лорноксикама на кривой динамики на 3 сутки однозначно просматривается тенденция к снижению секреции. Это существенное отличие от результата, полученного in vitro, можно предположительно объяснить очень высоким уровнем продукции ИЛ-8 у больных острым панкреатитом. Вследствие чего используемые в терапии дозировки не позволяют существенно подавить его продукцию. Тем более, что в эксперименте in vitro нами наблюдался дозазависимый эффект действия лорноксикама. Кроме того, в предыдущих разделах мы выяснили, что смещение баланса цитокинов в сторону ИЛ-8 ассоциировано с более бла оприятным течением острого панкреатита.
Похожие данные мы получили при оценке продукции ФНОа (Рис. 37). Здесь наблюдается снижение спонтанной продукции этого цитокина МНК на 3 сутки течения заболевания в группе пациентов, получавших лорноксикам. В этот период у больных с базисной терапией наблюдается подъем уровня ФНОа до 211 (171-268) пг/мл, в то время как у пациентов, получавших лорноксикам отмечается снижение до 94 (52-149) пг/мл. Достоверного снижения индуцированной лигандами TLR продукции ФНОа МНК не наблюдается.
Похожие диссертации на Анализ баланса оппозитных цитокинов, ассоциированных с рецепторами врожденного иммунитета, у больных с острыми патологическими состояниями
