Введение к работе
Актуальность темы исследования. Рак шейки матки (РШМ) занимает одно из ведущих мест в структуре онкологической заболеваемости женщин детородного возраста. Классическим методом профилактики рака шейки матки считается скрининговое обследование женщин, в основе которого лежит цитологическое исследование соскобов эпителия цервикального канала с целью выявления атипичных клеток. Основной сложностью качественной реализации данной схемы является относительно низкий уровень чувствительности выявления предраковых изменений, в среднем составляющий 58% (вариация от 20% до 87%) (Arbyn M., et al., 2006), большое количество неопределенных результатов (до 15% ASCUS), снижающих специфичность исследования и требующих дополнительного тестирования (Nygard J.F., et al., 2003), а также высокий уровень субъективности при трактовке результатов (Подистов Ю.И. и соавт., 2003). Открытие этиологической роли вирусов папилломы человека (ВПЧ) высокого риска в развитии РШМ (Zur Hausen., et al., 1994) позволили предположить эффективность выявления вируса как нового подхода для скрининга рака шейки матки (Wright T., et al., 2004; Cuzick J., et al., 2008). По результатам исследований, методики выявления ДНК ВПЧ (ВПЧ-тесты) оказались существенно более чувствительными, воспроизводимыми и объективными для выявления предрака и рака шейки матки по сравнению с цитологическим анализом. Однако ввиду особенностей папилломавирусной инфекции (способность к спонтанной регрессии и элиминации вируса) специфичность тестирования, направленного на выявление поражений шейки матки на основе ВПЧ-тестов, может быть существенно ниже, чем у цитологического анализа (Arbyn M., et al., 2009; Saslow D., et al., 2012), приводя к их непригодности для скрининга РШМ. Необходимость оптимизации диагностической специфичности анализа при сохранении высокого уровня чувствительности стали приоритетной задачей развития и стандартизации ВПЧ-тестов.
Степень разработанности темы исследования. В современной научной литературе активно обсуждается перспектива использования тестов, направленных на выявление ДНК ВПЧ для скрининга РШМ. Основное внимание уделяется стандартизации тестов и обеспечению оптимальных диагностических характеристик выявления онкогинекологических поражений. Показано, что на соотношение чувствительности и специфичности теста оказывает влияние спектр выявляемых генотипов (выявление большего числа генотипов ведет к росту чувствительности и потере специфичности) (Munoz N., et al., 2004), а также выявляемая концентрация вируса: низкая концентрация не ассоциирована с наличием или прогрессией интраэпителиальных поражений, высокая, напротив, чаще ассоциирована с наличием диспластических поражений эпителия. (Snijers P., et al., 2003; Saslow D., et al., 2012). В 2009 году международной группой экспертов были предложены требования к диагностическим характеристикам и правила валидации ВПЧ-тестов, используемых для скрининга РШМ (Meijer C.J., et al., 2009). Несмотря на обилие разных вариантов отечественных тестов, направленных на выявление ДНК ВПЧ, многие из них не стандартизированы, ни один из них не проходил валидацию по международным требованиям.
Современные знания о естественном течении папилломавирусной инфекции позволили предположить эффективность дополнительных вирус-ассоциированных маркеров. Активно изучается значение вирусной нагрузка как динамического маркера прогрессии или элиминации инфекции, появляются сведения о том, что при постлечебном мониторинге тяжелой дисплазии клинической значимостью могут обладать существенно более низкие концентрации вируса (Минкина Г.Н., и соавт, 2009; Xi L.F., et al. 2011; Hamaguchi D., et al., 2013). Данные сведения позволяют предположить эффективность применения количественных тестов, направленных на выявление ДНК ВПЧ. В настоящее время валидированных для скрининга РШМ диагностических тестов для количественного определения ДНК ВПЧ не существует, выявление клинически значимых случаев инфицирования осуществляется только за счет подбора аналитической чувствительности теста.
Отдельное место в диагностике папилломавирусной инфекции уделяется определению генотипа ВПЧ. Наибольшим онкогенным потенциалом обладают генотипы 16 и 18, прогноз их выявления наиболее тревожный (Szoke K., et al., 2003). При их выявлении рекомендуется агрессивная тактика ведения и лечения больных, при выявлении других типов возможна выжидательная тактика (Castle P.E. et al., 2006; Saslow D. et al.,2012). Проведение генотипирования позволяет отличить реинфицирование от персистентной инфекции при повторном визите пациента. Данная информация важна, так как опасность представляет именно персистентная форма инфекции, недавнее инфицирование наиболее вероятно спонтанно излечивается (Kjaer S.K., et al., 2010). О реинфицировании говорит изменение, о персистентной инфекции – сохранение генотипа вируса через год (Marks M., et al., 2011; Chen H.C., et al., 2011). В настоящее время большинство методик генотипирования достаточно трудоемки и не могут быть использованы на одной технологической платформе с скрининговым ВПЧ-тестом (Poljak M., et al., 2010). Разработка удобной методики генотипирования, используемой совместно со скрининговым ВПЧ-тестом на единой приборной базе представляет собой отдельную важную задачу.
Цель исследования. Разработка комплекса молекулярно-биологических методик для скрининга рака шейки матки, основанных на выявлении, количественном определении и генотипировании вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска.
Задачи исследования:
-
Разработать методику для выявления и количественного определения ДНК широкого спектра вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска на основе метода мультиплекс-ПЦР в реальном времени и оценить ее аналитические характеристики.
-
Разработать методику для генотипирования ДНК широкого спектра вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска на основе метода мультиплекс-ПЦР в реальном времени и оценить ее аналитические характеристики.
-
Разработать рекомендации по забору материала для методик выявления, количественного определения и генотипирования ДНК ВПЧ ВКР.
-
Изучить диагностические характеристики разработанных методик, оценить их в соответствие с международными требованиями и провести сопоставление с характеристиками цитологического метода выявления предрака и рака шейки матки.
-
Провести апробацию разработанных методик для выявления случаев неопластической патологии шейки матки при обследовании женщин, проходящих профилактический осмотр и среди больных дерматовенерологического профиля.
Научная новизна исследования.
Разработана концепция количественного определения ДНК ВПЧ как инструмента для оптимизации лабораторной диагностики папилломавирусной инфекции. Описанный подход позволил впервые в лабораторной практике применения ВПЧ-тестов использовать концентрационный порог для определения клинически значимых случаев инфицирования ВПЧ.
Выполненное впервые в лабораторной практике сопоставление диагностической чувствительности и специфичности выявления предрака и рака шейки матки при использовании методики, основанной на количественном определении ДНК ВПЧ ВКР, и цитологического анализа мазка и показало бльшую диагностическая чувствительность количественного ВПЧ-теста при сходной специфичности.
Теоретическая и практическая значимость исследования.
Разработаны методики на основе высокочувствительной и специфичной технологии мультиплекс-ПЦР для выявления и количественного определения широкого спектра генотипов ДНК ВПЧ ВКР, а также генотипирования широкого спектра генотипов ВПЧ ВКР, ставшие основой наборов реагентов, предназначенных для использования в рутинной лабораторной практике.
Впервые была проведена валидация отечественной методики, направленной на выявление ВПЧ ВКР, в соответствие с международными требованиями к тестам, используемым для скрининга рака шейки матки.
Предложена величина количественного порога клинической значимости равная 1000 копий ДНК ВПЧ ВКР на 100 тысяч клеток человека и показана эффективность его применения для достижения оптимального уровня диагностической специфичности и чувствительности выявления предраковых поражений шейки матки при использовании ВПЧ-тестов.
На основании полученных результатов были предложены рекомендации к выполнению преаналитического этапа проведения анализа, включающие оптимальный локус и инструментарий для взятия материала и обеспечивающие максимальную информативность проведения исследования, а также выработаны критерии оценки качества взятия материала в лаборатории.
Обоснована целесообразность использования методики для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ для раннего выявления предрака и рака шейки матки среди больных дерматовенерологического профиля в возрастных группах как старше, так и моложе 30 лет.
Методология и методы исследования. Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне сравнительного открытого исследования с использованием клинических, лабораторных, аналитических и статистических методов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработана методика для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ ВКР, обладающая высокими показателями аналитической и диагностической чувствительности и специфичности, пригодная для применения при скрининге РШМ.
-
Разработана методика для генотипирования ДНК ВПЧ ВКР с высокими показателями аналитической и диагностической чувствительности и специфичности, пригодная для применения при скрининге РШМ.
-
Диагностическая чувствительность и специфичность разработанных методик по отношению к неопластической патологии шейки матки соответствует международным научно-обоснованным критериям.
-
Диагностическая чувствительность методики для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ ВКР достоверно выше, чем у метода цитологического анализа мазка, что указывает на необходимость использования методик направленных на выявление и количественное определение ДНК ВПЧ при ранней диагностике РШМ.
-
Полученные данные о выявляемости случаев онкогинекологической патологии папилломавирусной этиологии среди больных дерматовенерологического профиля указывают на первостепенную необходимость внедрения ВПЧ-теста для профилактики РШМ у данной группы больных.
Степень достоверности и апробация результатов исследования.
Статистическая обработка полученных результатов осуществлена с помощью программы SPSS 11.5. Количественные показатели представлены в виде среднего арифметического значения, стандартного отклонения и стандартной ошибки среднего. Для величин, распределенных ненормально, использовались непараметрические характеристики – медиану, 1 и 3 квартили. Для оценки линейности количественных методик рассчитывался коэффициент корреляции Спирмена, для оценки воспроизводимости рассчитывался коэффициент вариации. Для сравнения групп использовались тест Манна-Уитни, критерий Вилкоксона и метод Хи-квадрат. Расчет интервала значений при статистической обработке биномиальных данных (расчет диагностической чувствительности, специфичности, PPV) проводился по методу Вилсона. Для проверки соответствия разработанных методик международным требованиям величины чувствительности и специфичности оценивались в сравнении с референтными методиками при помощи теста «non-inferiority» (Meijer C.J., et al. 2009). Для всех видов анализа достоверным считались различия при р< 0,05.
Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, протокол №20 от 04 октября 2013 г. Основные положения диссертации были доложены на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней - 2007» 28-30 ноября 2007 (г. Москва), Международном симпозиуме "Папилломавирусная инфекция и злокачественные новообразования. Интегрированная система надзора и профилактики" 4-6 июня 2009 (г. Санкт-Петербург), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2010», 24-26 ноября 2010 (г. Москва), II Международном симпозиуме по папилломавирусной инфекции, 7-9 июня 2011 (г. Санкт-Петербург), Международном междисциплинарном форуме «Шейка матки и вульвовагинальные болезни» 14-17 ноября 2012 года (г. Москва).
Публикации. По теме диссертации опубликована 31 печатная работа, в том числе 9 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Внедрения результатов исследования. На основе разработанных методик созданы диагностические наборы реагентов: «АмплиСенс ВПЧ ВКР Скрин-Титр-FL», «АмплиСенс ВПЧ ВКР Генотип-FL». Наборы реагентов прошли Государственные испытания, зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ и разрешены и применению на территории Российской Федерации. С января по сентябрь 2013 года производством ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора было выпущено 2800 наборов «АмплиСенс ВПЧ ВКР Скрин-Титр-FL», и 1470 наборов «АмплиСенс ВПЧ ВКР Генотип-FL». Наборы реагентов применяются в 185 лечебно-профилактических учреждениях страны. Полученные в ходе выполнения работы результаты использовались при создании практического руководства для врачей (Профилактика рака шейки матки: Руководство для врачей /под ред. акад. РАМН Г.Т.Сухих, проф. В.Н.Прилепской. – 3-е изд., перераб. и доп. – М.: МЕДпресс – информ, 2012.). Результаты проведенных исследований были включены в качестве учебного материала в программы сертификационных циклов усовершенствования «ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний» на базе ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора (г. Москва, Россия) и НМАПО им. П.Л. Щупика МЗ Украины (г. Киев, Украина)
Личное участие автора в получении результатов. Автор составил план настоящего исследования, провел аналитический обзор литературы, сформировал критерии отбора образцов клинического материала, осуществлял договоренности с коллабораторами по проведению совместных научных исследований, подбору пациентов и проведению необходимых диагностических процедур, выполнил весь объем молекулярно-биологических лабораторных исследований, участвовал в организации проведения цитологических и гистологических исследований, сформировал базу данных, провёл статистическую обработку и обобщение полученных результатов, сформулировал выводы и практические рекомендации.
Структура и объем диссертации.
Диссертация представлена на 185 страницах, включая 15 рисунков, 38 таблиц, список литературы и приложения. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов и выводов. Список использованной литературы включает 21 отечественный и 132 зарубежных источников.
![Эффективность высокой ножевой конизации шейки матки при лечении дисплазии, преинвазивного и микроинвазивного рака шейки матки и ее влияние на репродуктивную функцию [Электронный ресурс]](/i/i/4448/189989.png "Эффективность высокой ножевой конизации шейки матки при лечении дисплазии, преинвазивного и микроинвазивного рака шейки матки и ее влияние на репродуктивную функцию [Электронный ресурс] Савченко Александр Анатольевич")