Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления об этиопатогенезе, диагностике и иммунном ответе при патологии шейки матки, ассоциированной с папилломавирусной инфекцией 17
1.1. Эпидемиология папилломавирусной инфекции 18
1.2. Патогенетические аспекты патологии шейки матки, ассоциированной с папилломавирусной инфекцией 23
1.3. Диагностика папилломавирусной инфекции и патологии шейки матки 35
1.4. Иммунный ответ при патологии шейки матки, ассоциированной с папилломавирусной инфекции 40
Глава 2. Материалы и методы исследования 56
2.1. Материалы исследования 56
2.2. Клинические инструментальные и морфологические методы исследования 59
2.3. Микробиологические методы исследования 61
2.4. Молекулярно-биологические методы исследования 61
2.5. Иммунологические методы исследования 66
2.6. Меюды статистической обработки результатов 78
Глава 3. Распространенность вируса папилломы человека высокого риска у женщин, проживающих в г.челябинске и челябинской области 80
Глава 4. Клинико-лабораторная характеристика женщин с патологией шейки матки, ассоциированной с папилломавирусной инфекцией 84
Глава 5. Иммунологические показатели цервикальной слизи у женщин с хроническим цервицитом и цервикальными интраэпителиальными неоплазиями I, II, III степени, ассоциированными с папилломавирусной инфекцией 98
Глава 6. Иммунологические показатели периферической крови у женщин с хроническим цервицитом и цервикальными интраэпителиальными неоплазиями I, II, III степени, ассоциированными с папилломавирусной инфекцией 107
Глава 7. Вирусная нагрузка вируса папилломы человека высокого риска и ее взаимосвязь с показателями системного и местного иммунитета у женщин с хроническим цервицитом- и цервикальными интраэпителиальными неоплазиями I, II, III степени, ассоциированными с папилломавирусной инфекцией ... 119
Глава 8. Определение иммунологических маркеров прогресии цервикальных интраэпителиальных неоплазми, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией 132
Заключение 141
Выводы 169
Практические рекомендации 173
Список литературы 175
- Патогенетические аспекты патологии шейки матки, ассоциированной с папилломавирусной инфекцией
- Клинические инструментальные и морфологические методы исследования
- Распространенность вируса папилломы человека высокого риска у женщин, проживающих в г.челябинске и челябинской области
- Иммунологические показатели цервикальной слизи у женщин с хроническим цервицитом и цервикальными интраэпителиальными неоплазиями I, II, III степени, ассоциированными с папилломавирусной инфекцией
Введение к работе
Актуальность исследования
С открытием и признанием вирусной этиологии рака шейки матки (РШМ) пересматриваются многие подходы к цитологическому скринингу, ранней диагностике и лечению предраковых состояний. Исходя из современных представлений, РШМ – потенциально предотвратимое заболевание, если оно выявлено на стадии морфологической формы предрака - дисплазии шейки матки или цервикальной интраэпителиальной неоплазии (ЦИН), когда своевременно начатое лечение имеет оптимально-радикальный эффект, позволяющий добиться полного регресса патологического очага [Ашрафян Л.А. и др., 2002; WHO, 1996]. Однако, несмотря на достигнутые успехи в области онкологии и вирусологии, заболеваемость РШМ в Российской Федерации не снижается. Кроме этого, в последнее десятилетие отмечается рост заболеваемости у молодых женщин, особенно в возрасте до 29 лет [Чиссов В.И., 2009].
Основным экзогенным фактором, играющим ключевую роль в развитии интраэпителиальных дисплазий и выступающим в качестве пускового механизма неопластической трансформации эпителия шейки матки, является инфицирование высокоонкогенными типами вируса папилломы человека (ВПЧ) [Кисина В.И., Кубанов А.А., 2005; Бебнева Т.Н., 2007; Киселев Ф.Л., 2007; Bosch F.X. et al., 1995; WHO, 2006; Stanley M.A. et al., 2007; zur Hausen H., 2009]. Широкий полиморфизм клинических проявлений, частое бессимптомное течение папилломавирусной инфекции (ПВИ), сложность и высокая стоимость диагностических лабораторных исследований, отсутствие единых протоколов ведения пациенток с различными формами инфекции создают для практических врачей определенные трудности.
В настоящее время благодаря широкому внедрению молекулярной диагностики существует возможность определять ВПЧ в заражённых эпителиальных клетках даже при отсутствии цитологических изменений, что предполагает раннее проведение профилактических мероприятий [Караванова Е.А. и др., 2007; Nelson J.H., 2000]. Однако достоверно оценить уровень заболеваемости ПВИ на сегодняшний день не представляется возможным, так как эта инфекция не подлежит обязательной государственной регистрации и учету. К тому же ввиду высокой распространенности 16 типа ВПЧ, все молекулярно-биологические исследования сосредоточены именно на этом генотипе, а относительно клинической значимости других высокоонкогенных типов ВПЧ при патологических процессах шейки матки сведения малочисленны и разноречивы. Между тем, изучение региональных особенностей инфицированности и вариаций частоты встречаемости генотипов ВПЧ крайне важны для организации мероприятий по ранней диагностике и профилактике РШМ.
Инфицирование ВПЧ высокого риска (ВПЧ ВР) является ключевым моментом в инициации опухолевого процесса, но недостаточным условием для его прогрессии [Роговская С.И., 2003; Прилепская В.Н., 2007; Свидинская Е.А., Джибладзе Т.А., 2010]. Вирусом заражаются 8 из 10 женщин, ведущих активную половую жизнь, но в течение 6-18 месяцев у 80% он уходит из организма самостоятельно, без какого-либо лечения, не вызывая заболеваний. Только у 10-20% женщин с персистирующей ВПЧ-инфекцией может развиться РШМ [Frazer I.H., 2007]. Факторы, определяющие характер и течение патологического процесса, обусловленного ВПЧ, и самое главное, риск развития злокачественной трансформации цервикального эпителия полностью не изучены, между тем, их значение трудно переоценить. В настоящее время в качестве таких факторов активно исследуются генетические, молекулярно-биологические, иммунологические и пролиферативные маркеры.
В многочисленных работах подчеркивается, что важную роль в генезе малигнизации эпителия шейки матки играет иммунная система [Киселев Ф.Л., 2007; Падруль В.М., 2007; Семенов Д.М. и др., 2008; Rudolf S. et al., 2001; Benton C. et al., 2002; Stanley М., 2006]. Показано, что наиболее часто ВПЧ-инфекции разрешаются в результате формирования Th1-иммунного ответа. Однако высокоонкогенные типы ВПЧ активно подавляют эндогенный ответ на уровне системы интерферонов и тормозят активацию Toll-подобных рецепторов, что в сочетании с низкими уровнями вирусного белка, образуемого в рамках инфекционного цикла, а также отсутствием воспаления и виремии, способствует длительному игнорированию этой инфекции иммунитетом [Stanley М., 2006; 2009] и, вероятно, может привести к прогрессированию заболевания до интраэпителиальных поражений высокой степени (ЦИН II-III) и риску развития карциномы.
Благоприятный фон для развития диспластического процесса шейки матки создает хроническое воспаление [Абелев Г.И., Эрайзер Т.Р., 2008; . et al., 2001] вследствие взаимосвязанных нарушений местного, системного иммунитета, кровоснабжения подлежащей стромы и клеточного обновления эпителиального пласта [Лебедева М.И., 2008]. В связи с чем, изучение иммунологических особенностей течения хронического цервицита, ассоциированного с ПВИ, как звена цепи последовательных событий мультистадийного процесса канцерогенеза, представляет значительный интерес.
В некоторых работах была показана прямая взаимосвязь между концентрацией высокоонкогенных типов ВПЧ и риском развития цервикальных неоплазий. Персистенция вируса с высокой нагрузкой может способствовать быстрой прогрессии цитологически нормальных клеток шейки матки в диспластически измененные и даже опухолевые [Мелехова Н.Ю. и др., 2006; Куевда Д.А. и др., 2007; Josefsson A.M. et al., 2000; Dalstein V. et. al., 2003; Botezatu A. et. al., 2009]. Однако роль количественной нагрузки ВПЧ в прогнозе развития цервикальных неоплазий окончательно не определена. Наряду с этим, остается открытым вопрос о взаимосвязи между количеством вирусной ДНК и показателями иммунитета, что может иметь определяющее значение в понимании механизмов иммунного ответа при ВПЧ-инфекции.
Все вышеизложенное определяет актуальность исследований, направленных на поиск молекулярно-биологических и иммунологических маркеров неопластической трансформации, что позволит усовершенствовать алгоритмы обследования и ведения женщин с патологическими процессами шейки матки, ассоциированными с ПВИ, а также индивидуально прогнозировать развитие цервикальных неоплазий.
Задачи исследования
-
Изучить распространенность и спектр генотипов вируса папилломы человека высокого риска у женщин, проживающих в г.Челябинске и Челябинской области.
-
Установить типоспецифические характеристики вируса папилломы человека высокого риска у женщин с хроническим цервицитом и цервикальной интраэпителиальной неоплазией I, II, III степени.
-
Исследовать иммунологические показатели цервикальной слизи у женщин с хроническим цервицитом и цервикальной интраэпителиальной неоплазией I, II, III степени, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией.
-
Изучить иммунологические показатели периферической крови у женщин с хроническим цервицитом и цервикальной интраэпителиальной неоплазией I, II, III степени, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией.
-
Оценить концентрацию вируса папилломы человека высокого риска у женщин с хроническим цервицитом и цервикальной интраэпителиальной неоплазией I, II, III степени, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией.
-
Провести анализ взаимосвязей между количеством вируса папилломы человека высокого риска и показателями системного и местного иммунитета у женщин с хроническим цервицитом и цервикальной интраэпителиальной неоплазией I, II, III степени, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией.
-
Определить маркеры прогрессии цервикальных интраэпителиальных неоплазий, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией.
Научная новизна
Впервые получены данные по частоте инфицирования и распространению высокоонкогенных типов ВПЧ у женщин амбулаторно-поликлинического приема, проживающих в г.Челябинске и Челябинской области. Установлено, что ВПЧ ВР идентифицируются у 43,9% обследованных женщин с преобладанием 16, 31, 51 типов и инфицированием одним генотипом в 60,6% случаев. Показано, что ВПЧ ВР обнаруживается в цервикальном канале 61% женщин с патологией шейки матки и 44,8% женщин без клинико-морфологических изменений на шейке матки и иной гинекологической патологии. Наиболее высокий показатель инфицированности при патологии шейки матки зарегистрирован у пациенток с ЦИН II - 92,8% , с ЦИН III – 77,1% и у больных с РШМ 1-3 стадии - 65,8%. ВПЧ ВР выявляется в цервикальном канале 58,8% женщин с наличием остроконечных кондилом шейки матки, 56,5% больных с ЦИН I и 53,3% пациенток с хроническим цервицитом. Реже ВПЧ ВР встречается у больных с лейкоплакией шейки матки - в 27,2% случаев. Впервые установлены особенности спектра и удельного веса 12 генотипов ВПЧ ВР у больных с хроническим цервицитом и ЦИН I, II, III. Показано, что при цервикальной патологии частота встречаемости генотипов ВПЧ ВР неодинакова, при этом инфицирование 16 и 33 типами ВПЧ ассоциировано с прогрессией цервикальных неоплазий.
Впервые дана комплексная оценка иммунологических показателей цервикальной слизи и периферической крови у больных с хроническим цервицитом и ЦИН I, II, III, ассоциированных с ПВИ. Установлено, что у пациенток с заболеваниями шейки матки и наличием ВПЧ-инфекции, наблюдаются однонаправленные изменения факторов местного иммунитета, характеризующиеся повышением активности лизосомальных ферментов нейтрофилов, уровней ИФН- и Th-2 цитокинов.
Показано, что развитие и прогрессирование ВПЧ-ассоциированных ЦИН сопровождается изменениями иммунной реактивности, выраженность и характер которых зависит от степени диспластического процесса. У больных с ЦИН I изменения иммунологических показателей характеризуются повышением sIg A, снижением фагоцитарных реакций нейтрофилов и уровней ИЛ-2, ИЛ-8 в цервикальной слизи. В системном иммунитете установлено повышение содержания нейтрофилов, концентрации Ig G, активности спонтанного НСТ-теста нейтрофилов при пониженном количестве лимфоцитов, CD3-19+ клеток и уровней ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-.
Развитие ЦИН II сопровождается повышением показателей спонтанной НСТ-редуцирующей активности нейтрофилов, концентрации Ig G и уровней ИФН-, ИЛ-2 в цервикальной слизи. В периферической крови наблюдается повышение CD3+CD8+ клеток и снижение соотношения CD4+/ CD8+ при повышенном содержании лимфоцитов, снижение показателей функциональной активности нейтрофилов, ЦИК и С3 компонента комплемента, рост уровней РАИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-.
У больных с ЦИН III в системе локальной защиты зарегистрировано снижение показателей спонтанной НСТ-редуцирующей активности, количества жизнеспособных нейтрофилов и уровней ИФН-, ИЛ-4, ФНО-. Показатели системного иммунитета характеризуются уменьшением числа лимфоцитов, несущих CD3+CD16+56+ и CD3+HLA-DR+ рецепторы, снижением лизосомальной активности нейтрофилов и уровней ИФН-, ИЛ-2, ИЛ-10 и ФНО-, повышением функциональной активности нейтрофилов, концентрации Ig A, M, G и уровня РАИЛ-1.
Установлено значение вирусной нагрузки ВПЧ ВР, которое определяется выше порога клинической значимости (более 3 lg ВПЧ на 105 клеток человека) у пациенток с хроническим цервицитом и ЦИН независимо от степени поражения. Впервые выявлены взаимосвязи вирусной нагрузки ВПЧ ВР с показателями местного и системного иммунитета у больных с хроническим цервицитом и ЦИН I, II, III, подтверждающие влияние количества вирусной ДНК на иммунологические процессы, протекающие в ответ на ПВИ и обусловленную ей патологию.
Впервые с использованием ROC-анализа и метода логистической регрессии установлены иммунологические маркеры прогрессии ЦИН I, II и III, ассоциированных с ПВИ.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты комплексного исследования иммунологических факторов цервикальной слизи и периферической крови позволяют расширить представление о роли иммунной системы, в частности клеточного звена иммунитета, гуморальных факторов и системы цитокиновой регуляции, в развитии хронического воспалительного процесса и неопластической патологии шейки, ассоциированных с ПВИ. Нарушение функционирования иммунной системы может рассматриваться одним из факторов прогрессии цервикальных неоплазий.
Полученные сведения о взаимосвязи вирусной нагрузки, превышающей порог клинической значимости, с иммунологическими показателями цервикальной слизи и периферической крови свидетельствуют о дозозависимых отношениях между вирусом папилломы человека и различными параметрами иммунной системы, что вносит существенный вклад в понимание механизмов иммунного ответа и подтверждает значимость определения концентрации вирусной ДНК при патологических процессах шейки матки.
Результаты исследований по частоте встречаемости и изучению спектра высокоонкогенных типов ВПЧ определяют необходимость проведения молекулярного генотипирования у пациенток с хроническим цервицитом и ЦИН I, II и III для определения типоспецифического риска и прогнозирования неопластической патологии.
Выявленные иммунологические маркеры прогрессии цервикальных интраэпителиальных неоплазий, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией, позволяют сформировать группы риска по развитию неопластической патологии шейки матки в зависимости от степени тяжести патологических изменений эпителия шейки матки с целью ранней профилактики РШМ. Использование молекулярного генотипирования и количественного определения ДНК ВПЧ высокого риска, исследование иммунологических факторов цервикальной слизи и периферической крови расширяют возможность ранней диагностики цервикальных неоплазий, что в конечном итоге, позволит снизить заболеваемость РШМ.
Основные положения, выносимые на защиту
-
У женщин, проживающих в г.Челябинске и Челябинской области, определяется высокая частота инфицирования и широкий спектр генотипов (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59) вируса папилломы человека высокого риска. У пациенток с хроническим цервицитом и цервикальными интраэпителиальными неоплазиями I, II и III степени 16 тип является преобладающим в структуре генотипов вируса папилломы человека высокого риска. Другие типы вируса папилломы человека высокого риска выявляются в разном проценте случаев, из которых с наибольшей частотой идентифицируются 31, 33 и 56 типы. Частота выявления 16 и 33 типов возрастает по мере увеличения степени тяжести цервикальной интраэпителиальной неоплазии.
-
Наличие папилломавирусной инфекции у женщин с патологией шейки матки сопровождается изменением иммунной реактивности с преобладанием нарушений в клеточном звене и цитокиновом профиле локального иммунитета, выраженность и характер которых зависит от степени тяжести патологического процесса.
-
Концентрация вируса папилломы человека высокого риска у больных с хроническим цервицитом и цервикальными интраэпителиальными неоплазиями I, II, III определяется выше порога клинической значимости, и установлена ее взаимосвязь с параметрами местного и системного иммунитета.
-
Выявленные изменения иммунологических показателей цервикальной слизи и периферической крови позволяют определить маркеры прогрессии цервикальных интраэпителиальных неоплазий, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией, и сформировать группы риска по их развитию.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследований внедрены в клиническую практику женских консультаций МУЗ ГКБ №2 и МУЗ ГКБ №8 г.Челябинска, в НИИ иммунологии ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава и используются в педагогическом процессе на кафедрах микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, акушерства и гинекологии №2 ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы на: 1-ом Российско-Чешском медицинском форуме (Челябинск, 2006); конференции, посвященной, 25-летию ЦНИЛ ЧелГМА «Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека» (Челябинск, 2006); VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2007); научно-практической конференции «Репродуктивное женское здоровье. ВПЧ инфекция» (Челябинск, 2007); VII Российской конференции иммунологов Урала (Архангельск, 2009); Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009); VIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге - 2009» (Санкт-Петербург, 2009); Всероссийской научно-практической конференции «Амбулаторно-поликлиническая практика – платформа женского здоровья» (Москва, 2010); II-ом Ежегодном конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010); Российской научно-практической конференции «Стратегия развития онкорадиологической службы в регионах РФ» (Челябинск, 2010); VIII Российской конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010); межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010); VII Всероссийской научно-практической конференции c международным участием «Молекулярная диагностика -2010» (Москва, 2010); 4-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Современные аспекты дерматовенерологии» (Екатеринбург, 2010); школе-семинаре «Вирусная инфекция: ключевые вопросы» (Челябинск, 2011); научно-практической конференции «Пути развития онкогинекологической помощи в регионах РФ» (Челябинск, 2011); школе-семинаре «Алгоритмы диагностики и лечения инфекций, передающихся половым путем» (Челябинск, 2011).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 50 научных работ, в том числе 29 из перечня изданий, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 5-ти глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего работы 198 отечественных и 201 иностранных авторов. Диссертация изложена на 221 страницах компьютерного текста, включает 8 рисунков и 24 таблицы.
Патогенетические аспекты патологии шейки матки, ассоциированной с папилломавирусной инфекцией
Особенности этиопатогенеза патологических процессов шейки матки, ассоциированных с ПВИ, связаны со строением вирусных частиц. Вирусы папилломы человека являются широко распространенной и гетерогенной группой вирусов, относятся к семейству Papillomaviridae, группе Human Papillomavirus (HPV) и- входят в состав 5 родов, объединяющих различные типы вирусов. Это мелкие ДНК-содержащие вирусы, не имеющие внешней J оболочки и отличающиеся строгой эпителиотропностью, обладающие 5 способностью вызывать пролиферацию эпителия кожи? и слизистых оболочек і [Манухин И.Б., Минкина Г.Н., 2006; Кисина В.И., Кубанов А.А., 2005; Куевда 1 Д.А., Шипулина О.Ю., 2007; Clarke P. et al., 1996]. і : В настоящее время известно более 130 различных типов ВПЧ, 40 из них і вызывают поражения аногенитальной области [Евстигнеева И.П., 2007
Соколовский Е.В., Игнатовский А.В., 2005]. ВПЧ классифицированы на основании гомологии ДНК, где каждый серотип более чем на 10% отличается от ближайшего генетического родственника, с последующей корреляцией типирования, учитывающей биологическое поведение вируса и тканевый тропизм [Семенов Д.М. и др." , 2008; Ranst Van et al., 1996; Lizano M. et ah, 2009]. Все генитальпые серотипы ВПЧ относятся к роду alpha-papillomavirus и представлены на основе различий последовательностей генов Е6, Е7, L1 шестью филогенетическими группами: а5, аб, al, а8, а9, all, которые включают более 45 типов [Шипулина 0-Ю. и др., 2010].
Онкогенный потенциал папилломавирусов существенно варьирует. По данным Европейского отделения Международного общества по изучению инфекции в акушерстве и гинекологии I-IDSOG-EUROPE и других исследователей ВПЧ подразделяются на генотипы высокого и низкого онкогенного риска. [Бочкарев Е.Г,, Сергеев Ю.В., 2007, Куевда Д.А. и др., 2007]. Генотипы низкого риска (6, 11, 42, 43, 44) являются причиной остроконечных кондилом, и крайне редко связаны с карциномами. Генотипы высокого риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) выявляются в различных соотношениях при дисплазиях и злокачественных опухолях шейки матки [Роговская СИ., Прилепская В.Н., 2005; Профилактика рака..., 2007; MunozN,etal.,2004J,
Геном вирусов папиллом .представляет собой кольцевую (эписомальную)-ДНК, содержащую до 8000 пар нуклеотидов, и состоит из восьми рамок. считывания, кодирующих ранние «early» Е6, Е7, El, Е2, Е4, Е5 и поздние «late» — L1- и Ь2-функции. Поздние геныГЛ и L2 кодируют структурные белки вириона, гены Е1, Е2, Е4 контролируют функции, необходимые для репродукции вируса, гены Е5, Е6 и Е7 обладают активностью, стимулирующей пролиферацию и трансформацию клеток [Кисина В,И., Кубанов А.А., 2005; Молочков А.В., 2009]. Наличие генов Е6 и Е7 определяется в геноме всех генотипов ВПЧ, в том числе 6 и 11 типов, но способствовать раковой трансформации эпителиоцитов могут лишь гены Е6 и Е7 ВПЧ высокой онкогенности. В здоровых клетках, содержащих ВПЧ, существуют факторы, контролирующие экспрессию генов Е6 и Е7, к которым относятся цитокины, внутриклеточные сигнальные медиаторы (протеинфосфатаза РР2А) и фактор транскрипции YY1. Врожденные или приобретенные нарушения в одном из этих трех факторов защиты являются одним из основных моментов в инициации транскрипции ДНК ВГГЧ [Аполихина И.А., 1999, Бебнева Т.Н., Прилепская В.Н., 2001].
Жизненный цикл вируса тесно связан с дифференцировкой клетки-хозяина. Заражение ВПЧ происходит путем инфицирования базального слоя эпителия, причем наиболее уязвимым участком является зона перехода многослойного плоского эпителия в цилиндрический [Бебнева Т.Н., Прилепская В.Н., 2001; Минкина Г.Н. и др., 2001; Профилактика рака.,., 2007; Семенов Д-М. и др. , 2008]. При дифференцировке эпителиальных клеток происходит репликация ДНК и экспрессия ранних белков вируса [Wentzensen N. et aL, 2002). Зрелая вирусная частица образуется в ядре только на последней стадии дифференцировки эпителиальной клетки. В процессе генерации вируса геном ВПЧ образует от 8 до 10 белковых продуктов: LI, L2 кодируют структурные белки вириона, Е1 — Е7 ранние вирусные гены, которые контролируют функции, необходимые для репродукции [Молочков А.В., 2009]. Последовательное1 размножение ВПЧ представляет собой особый случай тесного сопряжения жизненного цикла вируса с физиологическим процессом дифференцировки и смены эпителиальных клеточных элементов, слизистых оболочек соответствующей локализации [Castle Р.Е. et aL, 20021.
Вирус обладает целым набором механизмов, подчиняющих своим интересам жизнедеятельность инфицированной клетки. ВПЧ способен существовать как в свободной эписомальной (неинтегрированной), так и интегрированной формах. Неинтегрированная форма является продуктивной инфекцией, она весьма контагиозна и характеризуется наличием выраженных клинических проявлений (остроконечных кондилом), которые имеют очень низкую вероятность развития в предрак или рак [Роговская С.И., Прилепская В.Н., 2005, Трушина О.Н., Новикова Е.Г., 2005, Gross G. Е., 1997]. При включении вирусной ДНК в ядерный материал клетки развивается интегрированная форма ВПЧ, которая сопровождается делецией гена Е2, сверхэкспрессией генов Е6 и Е7 и способна к злокачественной трансформации [Минкина Г.Н. и др., 2001; Мазуренко М.М., 2003; Сопко Н.И., Максимов В.В., 2006; Семенов Д.М. и др.2, 2008; Киселева В.И. и др.2,2010].
Однако эта закономерность не является абсолютной, так как в ряде с л у чае в (до 40%) в злокачественных опухолях идентифицируется эписомальная форма ДРПС ВПЧ, либо комбинация эписомальной и интегрированной форм [Киселев Ф.Л. и др., 2001; Савичева А.М., 2006; Kulmala S.M., 2006]. Определяющим для развития опухоли является транскрипционная активность вирусного генома и синтез РНК, кодируемых генами Е6 и Е7, которые могут происходить как с интегрированной, так и с эписомальной формами [Уразова Л.Н., Видяева И.Г., 2009].
При взаимодействии Е6 и Е7 с эндогенными клеточными регуляторными протеинами (р53 и pRb), которые индуцируют апоптоз, происходит дерегуляция цикла клеточной прогрессии, что является критической ступенью- цервикального канцерогенеза [Минкина Г.Н и др., 2001; Мазуренко М.М:, 2003; Cripe Т. Et aL, 1995; Kisseljov F. et ah, 2008; Lizano M. et al., 2009]. Прочность образованной связи, степень инактивации супрессорных белков определят выраженность дальнейшей трансформации клетки. Отмечено, что чем прочнее установлена связь и выше степень инактивации, тем более вероятно перерождение папилломы в злокачественное новообразование [Молочков В.А. и др., 2005].
Клинические инструментальные и морфологические методы исследования
Общеклиническое гинекологическое исследование включало осмотр наружных половых органов, влагалища и шейки матки с помощью зеркал, а также влагалищное бимануальное исследование половых органов. Особое внимание обращали на состояние кожных покровов аногенитальной области, слизистой влагалища и шейки матки, наличие или отсутствие остроконечных кондилом.
Ультразвуковое исследование органов малого таза проводилось по методикам, описанным в руководстве «Ультразвуковая диагностика в акушерской и гинекологической практике» (1990),
Простая и расширенная кольпоскопия проводились по общепринятой методике [Прилепская В.Н. и соавт., 1997] с помощью видеокольпоскопа «Sensitcc-SLC» (Китай). Данные кольпоскопических картин интерпретировали согласно Международной кольпоскопической терминологии, обновленной Международной Ассоциацией по патологии шейки матки и кольпоскопии (Барселона, 2003).
Цитологическое исследование мазков-соскобов с влагалищной части шейки матки и из цервикального канала проводилось после тщательного высушивания и фиксации клеточного материала 96% этиловым спиртом в течение 15 минут. Окраску препаратов производили по Романовскому-Гимзе. Для интерпретации результатов цитологического исследования была использована классификация-Папаниколау. Согласно классификации, для I-ого класса характерна цитограмма с нормальным клеточным составом; II класс включает: незначительные клеточные изменения; неспецифическую плоскоклеточную атипию, папилломавирусные изменения (койлоцитоз); III класс характеризуется слабой, умеренной, выраженной дисплазией; IV класс - carcinoma in situ; мазки V класса расцениваются как положительные в отношении инвазивного рака шейки матки.
Всем пациенткам с наличием ненормальной кольпоскопической картиной проводили прицельную биопсию. Полученный на 9—10 день менструального цикла биоптат фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и заливали в парафин. С каждого парафинового блока изготовлялись серийные плоскопараллельные срезы толщиной в 5-7 мкм. Для проведения гистологических исследований после предварительного депарафинирования срезы окрашивались по общепринятым методикам [Меркулов Г.А., 1961; Лили Р., 1969; Автандилов Г.Г., 1994]. Для проведения обзорной ми кроскопии тканевые срезы окрашивались гематоксилином и эозином.
При патогистологическом исследовании изучалась активность воспалительного процесса в шейке матки. При установлении степени активности воспалительного процесса при хроническом цервиците были использованы критерии, предложенные В.П. Евтушенко (2002).
Морфологические исследования биоптатов шейки матки проводились в отделении патологической анатомии МУЗ ГКБ № 8, МУЗ ГКБ №1 и ГЛПУ Челябинском окружном клиническом онкологическом диспансере. Гистологический диагноз патологического процесса включал в себя описание клеточных элементов, состояние слоев эпителиального пласта, протяженность измененного участка, степень дифференцировки клеток.
Микробиологические методы исследования У всех женщин проводилось обследование на генитальнуго инфекцию. Микробиологическое исследование проводилось в бактериологической лаборатории МУЗ ГКБ № 8, МУЗ ГКБ №1 и ГЛПУ Челябинском окружном клиническом онкологическом диспансере.
Для определения пейзажа микрофлоры половых путей пациенткам осуществлялось микробиологическое исследование согласно рекомендациям МЗ РФ «О совершенствовании контроля за заболеваниями, передающимися половым путем» (Приказ № 286 от 07.12.1993 г.).
Бактериологическое исследование материала из цервикального канала выполняли в соответствии с приказом Министерства здравоохранения СССР № 535 от 22.04.1985 г. Идентификацию выделенных культур микроорганизмов проводили по морфологическим, культуральным и биохимическим признакам.
Молекулярно-биологические методы Определение урогенитальных инфекций и ВПЧ ВР в цервикальных соскобах проводилось в лаборатории противоинфекционного иммунитета НИИ иммунологии ЧелГМА методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекдией в режиме «реального времени» (Realime).
Забор материала проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики», разработанными Центральным НИИ эпидемиологии МЗ РФ и утвержденными МЗ РФ (Москва, 2005 г). Соскоб эпителиальных клеток получали из цервикального канала при помощи одноразовых стерил ьн ых генитал ьных зондов (цитощеток), предварительно удалив слизистую пробку стерильным ватным тампоном. Вращательными движениями зонда проводили соскоб на глубине 0,5—1 см цервикального канала, затем цитощетку извлекали и ершик зонда опускали в пробирку с транспортной средой в объеме 0,5 мл. Рабочую часть цитощетки, обломив, оставляли в пробирке с транспортной средой.
Распространенность вируса папилломы человека высокого риска у женщин, проживающих в г.челябинске и челябинской области
Данные о региональных эпидемиологических особенностях инфицированности населения ВПЧ, вариациях встречаемости различных генотипов при патологии шейки матки малочисленны и разноречивы. Однако именно эти сведения крайне важны для организации целевых мероприятий по ранней диагностике ВПЧ-инфекции, профилактике ее персистенции и, следовательно, потенциальной возможности снижения риска развития диспластических и злокачественных трансформаций цервикального эпителия [Современные подходы , 2009]. Современные методы молекулярной диагностики ПВИ, к которым относится полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяют, используя технологию ПЦР в режиме реального времени, не только обнаружить ДНК ВПЧ, но и провести молекулярное генотипирование — одновременное выявление 12 наиболее распространенных генотипов ВПЧ ВР (16, 18, 31, 33, 35, 39,45, 51, 52,56, 58, 59 типы). Для решения первой задачи нашего исследования было проведено определение ДНК ВПЧ ВР методом ПЦР в режиме реального времени у 2520 пациенток амбулаторно-поликлинического приема лечебно профилактических учреждений гинекологического профиля г.Челябинска. Все женщины проживали в г.Челябинске и Челябинской области более 5 лет, а также не проходили ранее тестирование на ДНК ВПЧ. Результаты лабораторного скрининга показали, что ВПЧ ВР обнаруживался у 1106 женщин, что составило 43,9% от всех обследованных. При изучении частоты инфицирования ПВИ в различные возрастные периоды (рис.3.1) установлено, что высокоонкогенные типы ВПЧ встречались у 42,3% (п=46) девушек в возрасте 16-18 лет и 51,8% (п=790) женщин в возрасте 19-34 лет, тогда как отсутствие в цервикальном канале определяемых вирусов регистрировалось у 57,7% (п=62) и 48,2% (п=734) пациенток данных возрастных групп, соответственно. У женщин в возрасте от 35 до 44 лет ДНК ВПЧ ВР в цервикальном канале определялась у 38,2 % (п=170) обследованных, а 61,8% (п=275) женщин оказались ВПЧ-негативные. В возрастной группе женщин 45 лет и старше показатель инфицирования ВПЧ ВР составил 22,5% (п=100), у 77,5% (п=343) женщин данный вирус не идентифицировался. ВПЧ - позитивные D ВПЧ - негативные
Проведенное молекулярное генотипирование среди 1106 ВПЧ-позитивных женщин установило, что 16 тип ВПЧ встречался в 27,8 %, Зітип - в 11,2 % и 51 тип - в 8,6 % случаев (рис.3.2). Остальные генотипы ВПЧ ВР распределились следующим образом: 52 тип - 8,3%, 56 тип — 7,4%, 18 тип — 7,0%, 39 тип - 6,0%, 33 тип - 5,6%, 45- 4,9%, 58 тип - 4,8%, 35 тип - 4,5% и 59 тип — 3,9%. Суммарный показатель частоты встречаемости ВПЧ 16 и 18 типов составил 34,8%, в то время как 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов - 65,2 % случаев. При исследовании количества генотипов ВПЧ ВР один тип был выявлен у 60,6% (п=670), два типа - у 26,3 % (п=291), три типа - у 7,8 % (п=86), 4 типа и более - у 5,3 % (п=59) обследованных женщин (рис.3.3). Общая частота встречаемости микстинфекции (два и более генотипа) составила 39,4 % (п=436) от всех ВПЧ-позитивных женщин. В заключении можно отметить, что проведенный лабораторный скрининг методом ПЦР в режиме реального времени у женщин, проживающих в г.Челябинске и Челябинской области, показал высокую частоту встречаемости ВПЧ ВР — 43,9% от всех обследованных с максимальным уровнем инфицированности в возрастной группе 19-34 лет. В структуре генотипов ВПЧ ВР преобладали 16, 31 и 51 типы. У большинства ВПЧ-позитивных женщин выявлялся один тип вируса. Для дальнейшего решения поставленных задач из 2520 пациенток амбулаторно-поликлинического приема лечебно-профилактических учреждений гинекологического профиля г.Челябинска в дальнейшее исследование включено 773 женщины, среди которых у 639 пациенток диагностирована следующая патология шейки матки: у 17 женщин - ОКК шейки матки, у 298 женщин - хронический» цервицит, у 11 женщин -лейкоплакия шейки матки, у 234 женщин — ЦИН I, II и III- степени, у 79 женщин - РШМ 1-3 стадии. У 134 женщин не выявлено клинико-морфологических изменений на шейке матки и иной гинекологической патологии. Из 639 пациенток с патологией шейки матки в- 61% (п=390) случаев в цервикальном канале идентифицировался ВПЧ ВР при этом, частота встречаемости высокоонкогенных вирусов варьировала в зависимости от характера и тяжести патологического процесса шейки матки (табл.4.1). Так, наличие ВПЧ ВР в цервикальном канале регистрировалось у 58,8% женщин с ОКК шейки матки, у 53% пациенток с хроническим цервицитом и у 27,2% женщин с лейкоплакией шейки матки. При ЦИН частота встречаемости ВПЧ ВР была различной в зависимости от степени тяжести: у 56,5% больных с ЦИН І, у 92,8% пациенток с ЦИН II и у 77,1% больных с ЦИН III определялось присутствие ДНК ВПЧ- ВР в цервикальном канале. При РШМ 1—3 стадии ВПЧ ВР встречался в 65,8% случаев. был выявлен хронический воспалительный процесс шейки матки. У 13,3% женщин с зарегистрированной ВПЧ-инфекцией был диагностирован РШМ 1, 2, 3 стадии. У 2,6% ВПЧ-позитивных женщин выявлялась клиническая форма ПВИ — ОКК шейки матки. И только в 0,8% случаев среди женщин с ПВИ встречалась лейкоплакия шейки матки.
Иммунологические показатели цервикальной слизи у женщин с хроническим цервицитом и цервикальными интраэпителиальными неоплазиями I, II, III степени, ассоциированными с папилломавирусной инфекцией
Одной . из задач нашего: исследования: явилось изучение иммунологических факторов, цервикальной слизи у больных с хроническим цервицитом. и ЦИИ I,. И, III,. так каку патологические изменения, обусловленные: ВПЧ; BPj, локализуются? в эпителии и тканях шейки матки [Роговская СИ-, 2008; Вакцины-для профилактики..;,_2009]. Согласно данным Семенова1 ДШ.. -. (2008); местные: нарушения, антигенпрезентирующей способности эпителия, цервикального каналас при1 БГОК сопровождаются активацией клеточного звена иммунной системы, которая может выражаться как в интенсивности лимфопролиферативного ответа мононуклеарных клеток периферической: крови;. шщ и привлечением: в очаг инфекций, клеток: воспалительного инфильтрата.
Ранее было показано, что ведущее значение в иммунной защите. репродуктивного тракта женщины принадлежит иейтрофилам цервикального секрета, поскольку по количеству и функциональной- активности они превосходят гранулоциты других секретов гениталий и являются- мощными эффекторами воспаления, обеспечивая первую- линию- защиты, против вторгшейся инфекции [Долгушина В.Ф., 199 І; Телешева Л.Ф., 2000]. Продуцируя цитокины, иейтрофилы модулируют баланс между гуморальными и клеточно-опосредованными иммунными. реакциями через активацию ТЫ- или ТЬ2гклеточного ответа, обеспечивая взаимодействие врожденного и адаптивного иммунитета [Тотолян А,А.5 Фрейдлин И.С., 2000; Кривохижина Л.В., Осиков М.В., 2005; Di Carlo Е. et ah, 2003].
Изучены следующие показатели функциональной активности нейтрофилов цервикальнои слизи: общее количество и жизнеспособность нейтрофилов» способность клеток к апоптозу; функциональная активность — кислородзависимый метаболизм на модели спонтанного и индуцированного НСТ-теста, способность к поглощению частиц латекса и лизосомальная активность, представленные в таблице 5.1.
При сравнении с контрольной группой у больных с хроническим цервицитом установлено повышение апоптозных клеток, лизосомальной активности, НСТ-редуцирующей активности, как спонтанной, так и индуцированной, а также активности фагоцитоза нейтрофилов.
У больных с ЦИН I по отношению к контрольной группе наблюдалась аналогичная тенденция в изменении большинства показателей — повышение лизосомальной активности и кислородзависимого метаболизма полиморфноядерных лейкоцитов с сохранением повышенного количества апоптозных нейтрофилов. Та же закономерность в некоторых показателях сохранилась и при ЦИН II: повышение лизосомальной и НСТ-редуцирующей активности но уже на фоне повышенного относительного количества жизнеспособных нейтрофилов. При ЦИН III было зарегистрировано только достоверное повышение лизосомальной активности нейтрофилов по сравнению с группой контроля. Во всех группах больных не было установлено достоверных изменений функционального резерва нейтрофилов по сравнению с контрольными значениями.
Межгрупповой сравнительный анализ показал снижение активности и интенсивности фагоцитарной реакции нейтрофилов у больных с ЦИН I при сравнении с изучаемыми показателями больных с хроническим воспалительным процессом шейки матки. У больных с ЦИН II по сравнению с ЦИН I были выше показатели спонтанной НСТ-редуцирующей активности,
Развитие ЦИН III относительно пациенток с ЦИН II сопровождалось снижением активности и интенсивности спонтанного и индуцированного НСТ-теста, относительного количества жизнеспособных нейтрофилов.
В гуморальном звене иммунитета у пациенток с хроническим цервицитом и ЦИН III отмечалось снижение slg А относительно контрольной группы (табл.5.2). У больных с ЦИН II при сравнении с контрольными значениями наблюдалось повышение концентрации Ig А и G в цервикальной слизи. Не установлено достоверных различий с контрольной группой в гуморальном звене иммунитета только у больных с ЦИН I.
