Введение к работе
Актуальность исследования.
В настоящее время туберкулез приобретает все большее значение среди инфекционных заболеваний, приводящих к летальному исходу, что во многом связано с увеличением лекарственно устойчивых штаммов.
Туберкулез вызывают патогенные бактерии Mycobacterium tuberculosis при определенных условиях, и прежде всего, при снижении эффективности функционирования иммунной системы. M.tuberculosis как внутриклеточные патогены, способны выживать и размножаться в фаголизосомах макрофагов, уклоняясь от защитных иммунных механизмов. Развитие устойчивости микобактерий туберкулеза к основным противотуберкулезным препаратам является острой проблемой, диктующей необходимость разработки новых подходов к лечению туберкулеза, заключающихся как в прямом воздействии на возбудителя, так и опосредованном, через активацию внутриклеточных механизмов подавления микобактерий туберкулеза.
В последние годы большое внимание уделяют роли противомикробных пептидов (ПМП) в реакциях врожденного иммунитета. Известно, что ПМП служат первичной защитой от патогенов. В литературе описано более 1000 таких пептидов [Кокряков В.Н., 2007, Brogden K.A., 2005]. Они включают в себя молекулы многих тканей и клеток позвоночных, беспозвоночных растений и грибов. У млекопитающих охарактеризованы такие ПМП, как дефенсины, кателицидины и другие. Особое место среди кателицидинов занимают катионные ПМП свиньи нейтрофильного происхождения – протегрины. Протегрины впервые были открыты отечественными учеными во главе с Кокряковым В.Н [Кокряков В.Н., 1999].
ПМП вызывают прямое ингибирование метаболических процессов и нарушение целостности клеточной мембраны [Brogden K.A., 2005]. В работах зарубежных исследователей продемонстрировано антимикобактериальное действие ПМП. Роберт Лерер показал угнетение роста M.tuberculosis при воздействии ПМП (дефенсинов, выделенных из нейтрофилов человека и кролика, и протегринов свиньи) [R. I. Lehrer, Miyakawa Y., 2009]. Другие ученые исследовали прямое действия –дефенсина человека (HNP–1) на M.tuberculosis H37Rv и опосредованное в культуре зараженных макрофагов крысы. Результаты выявили бактерицидное действие в отношении M.tuberculosis [Sharma S., I. Verma, G.K. Khuller, 2000].
В связи с этим нам представлялось важным изучить антимикобактериальное действие комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат суперлимф).
Препарат суперлимф (молекулярная масса до 35 кД) представляет собой комплекс природных цитокинов: интерлейкинов (ИЛ–1, ИЛ–2, ИЛ–6), фактора некроза опухоли (ФНО–), фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (МИФ), трансформирующего фактора роста (ТФР). Наряду с цитокинами, в низкомолекулярной фракции суперлимфа идентифицированы пептиды, подобные катионным противомикробным пептидам – протегринам. В экспериментах in vitro было показано прямое антибактериальное действие суперлимфа в отношении Staphylococcus аureus, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes [Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Мороз А.Ф. и др., 2004],[Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Аведова Т.А. и др., 2006], а также противовирусное действие в отношении вируса простого герпеса [Ковальчук Л.В., Лавров В.Ф., Ганковская Л.В. и др., 2005].
Цель исследования.
Изучение действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат суперлимф) на M.tuberculosis и на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis.
Задачи исследования.
1. Выбор модели для изучения активности комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов.
2. Изучение действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на рост штаммов M.tuberculosis с различной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам в модели in vitro.
3. Оценка in vitro цитотоксического действия комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на интактные макрофаги мыши.
4. Изучение влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на рост M.tuberculosis H37Rv, фагоцитированных макрофагами, в модели ex vivo.
5. Изучение влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов на рост лекарственно-устойчивых M.tuberculosis, фагоцитированных макрофагами, в модели ex vivo.
6. Оценка протективной активности комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов в отношении макрофагов, инфицированных M.tuberculosis ex vivo.
Научная новизна.
В работе впервые в одной модели проведено изучение влияния комплекса природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат суперлимф) на рост M.tuberculosis с различной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам и на макрофаги, инфицированные M.tuberculosis. Впервые показано ингибирующее действие препарата суперлимф на рост in vitro лабораторного вирулентного штамма M.tuberculosis H37Rv. Впервые выявлено, что обработка макрофагов суперлимфом до инфицирования микобактериями туберкулеза, приводит к снижению роста чувствительного штамма M.tuberculosis H37Rv и штамма M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, фагоцитированных макрофагами, а также уменьшает цитопатогенный эффект, оказываемый ими на макрофаги.
Действие КПЦ и ПМП на микобактерии туберкулеза опосредуется двумя путями. Прямой антимикобактериальный эффект обусловлен низкомолекулярной фракцией, содержащей протегрин–подобные пептиды. Основой другого механизма является регуляция функции макрофагов, фагоцитировавших микобактерии туберкулеза. В этом случае бактерицидная активность фагоцитов стимулируется цитокинами, что приводит к усилению выработки ими активных форм кислорода и азота, продукции аутологичных цитокинов, способствуя, таким образом, разрушению патогенов.
Полученные результаты расширяют представления о механизмах врожденного иммунного ответа на микобактерии туберкулеза. Что может служить основой для разработки новых методов иммунокоррекции на основе противомикробных пептидов и цитокинов.
Практическая значимость.
Практическая значимость работы определяется важностью поиска новых лекарственных средств на основе биотехнологических продуктов для лечения туберкулезной инфекции. Изучение влияния КПЦ и ПМП на модели макрофагов, инфицированных микобактериями туберкулеза, позволит лучше понять механизмы протективного иммунного ответа на возбудителя болезни. Полученные данные об антимикобактериальном эффекте препарата суперлимф обосновывают клиническую перспективность этого лекарственного средства.
Положения, выносимые на защиту.
1. Сочетание экспериментов in vitro и ex vivo позволяет оценить активность препарата не только в отношении возбудителя туберкулеза, но и определить действие, оказываемое им на эффекторные клетки, играющие центральную роль в противотуберкулезной защите.
2. Комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов при воздействии in vitro и ex vivo ингибирует рост M.tuberculosis H37Rv. Степень угнетения роста зависит от дозы препарата. Максимальный эффект оказывает препарат в концентрации 5 мкг/мл.
3. На рост штамма M.tuberculosis с МЛУ комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов оказывает ингибирующее влияние только на микобактерии, фагоцитированные макрофагами в модели ex vivo.
4. Комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов не оказывает цитотоксического действия на интактные МФ и проявляет протективный эффект в отношении МФ, инфицированных M.tuberculosis, снижая цитопатогенный эффект микобактерий на МФ.
5. Антимикобактериальная активность МФ повышается при предварительной 24–часовой инкубации (до инфицирования) с комплексом природных цитокинов и противомикробных пептидов, что подтверждается снижением подавляющей рост концентрации препарата до 1 мкг/мл в отношении чувствительного штамма M.tuberculosis H37Rv и появлением ингибирующего эффекта на рост M.tuberculosis с МЛУ.
Внедрение результатов исследования.
Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедре иммунологии ГОУ ВПО Российского Государственного медицинского университета Росздрава.
Апробация работы.
Диссертация апробирована на совместной научной конференции кафедры иммунологии, кафедры эндокринологии, отдела иммунологии ГОУ ВПО «РГМУ Росздрава», отдела микробиологии Центрального научно-исследовательского института туберкулеза РАМН 24 июня 2010 г.
Материалы диссертационной работы докладывались на научных заседаниях кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГОУ ВПО «РГМУ Росздрава», на заседаниях секции микробиологии и иммунологии туберкулеза Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007), на 4 конгрессе Международного союза борьбы против туберкулеза и легочных болезней (Латвия, Рига, 2007), на 20 европейском конгрессе клинической микробиологии и инфекционных болезней (Австрия, Вена, 2010г.).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендуемых ВАК Российской Федерации.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа изложена на 100 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 11 отечественных и 124 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 13 рисунками.
