Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1. Современные представления о роли иммунных механизмов в развитии атеросклероза .14
1.1. 1. Участие врожденного иммунного ответа в атерогенезе .15
1.1.2. Участие адаптивного иммунного ответа в атерогенезе .19
1.1.3. Роль цитокинов в атеросклеротическом воспалении 23
1.2. Значение молекул адгезии в развитии атеросклероза 26
1.3. Иммунотерапия в комплексном лечении пациентов с ОАСНК .30
Глава II. Контингент, материалы и методы исследования 38
Глава III. Особенности иммунного и цитокинового статуса у пациентов с ОАСНК
3.1. Характеристика состояния адаптивного клеточного иммунитета у пациентов с ОАСНК в зависимости от степени тяжести заболевания 51
3.2. Характеристика состояния адаптивного гуморального иммунитета у пациентов с ОАСНК в зависимости от степени тяжести заболевания 59
3.3. Характеристика состояния врожденного иммунитета у пациентов с ОАСНК в зависимости от степени тяжести заболевания 61
3.4. Характеристика состояния цитокинового статуса у пациентов с ОАСНК в зависимости от степени тяжести заболевания .63
Глава IV. Экспрессия молекул адгезии у пациентов с ОАСНК ... 70
4.1. Уровень растворимых молекул адгезии (sVCAM-1, sICAM-1, sP-selectin, sЕ-selectin) в сыворотке крови у пациентов с ОАСНК в зависимости от степени тяжести заболевания .70
Глава V. Иммунологические особенности системной воспалительной реакции у пациентов с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей
5.1. Использование плазменных уровней цитокинов для характеристики хронического системного воспаления с помощью интегральных критериев у пациентов с ОАСНК 74
Глава VI. Иммуно-патогенетическая эффективность применения полисахаридов бурой водоросли в комплексе с базисной терапией у пациентов с ОАСНК .81
6.1. Влияние Фуколама на показатели иммунного статуса у пациентов с ОАСНК 81
6.2. Влияние Фуколама на показатели цитокинового статуса у пациентов с ОАСНК 93
6.3. Влияние Фуколама на уровень растворимых молекул адгезии у пациентов с ОАСНК 96
6.4. Влияние Фуколама на состояние системы гемостаза и липидный обмен у пациентов с ОАСНК 98
6.5. Оценка эффективности терапии пациентов с ОАСНК с помощью интегральных критериев .105
Заключение 107
Выводы 131
Рекомендации для внедрения в медицинскую науку и практику 133
Список литературы 134
- Участие врожденного иммунного ответа в атерогенезе
- Контингент, материалы и методы исследования
- Характеристика состояния адаптивного гуморального иммунитета у пациентов с ОАСНК в зависимости от степени тяжести заболевания
- Уровень растворимых молекул адгезии (sVCAM-1, sICAM-1, sP-selectin, sЕ-selectin) в сыворотке крови у пациентов с ОАСНК в зависимости от степени тяжести заболевания
Введение к работе
Актуальность работы: Сердечно- сосудистые заболевания, вызванные развитием атеросклероза, являются главной причиной смертности в экономически развитых странах и России. Облитерирующий атеросклероз сосудов нижних конечностей (ОАСНК) - один из вариантов атеросклероза, при котором поражаются преимущественно крупные артерии. По данным эпидемиологических исследований число больных с ОАСНК в общей популяции составляет 2-3% населения в целом, распространённость заболевания у пациентов старше 50 лет - более 20%. При этом в действительности ОАСНК страдают гораздо большей число людей: субклинические (асимптомные) формы встречаются в 3-4 раза чаще, чем клинические проявления (перемежающаяся хромота) (Fowkes F. et al., 1996; Meijer W.T. et al., 1998). К 2015 году прогнозируется увеличение смертности от атеросклероза еще на 10% (Душкин М.И., 2006).
В настоящее время общепризнанно, что ведущим механизмом
формирования атеросклеротического поражения сосудов является
хроническое иммунное воспаление, на разных стадиях которого происходит
активация клеток иммунной системы (Нагорнев В.А. с соавт., 2000; Binder C.
et al., 2002; Hansson G. et al., 2006). Локальное воспаление протекает
непосредственно в артериях и определяет динамику процессов,
происходящих в атеросклеротической бляшке, прежде всего ее стабильность
и возможность разрушения. Системное воспаление, проявляющееся
накоплением в крови хемокинов и цитокинов, растворимых форм их
рецепторов, молекул адгезии, активацией клеточных элементов, в отличие от
локального, более демонстративно и доступно для исследования в условиях
клиники. Доказана, в частности, сопряженность манифестации клинических
симптомов атеросклеротической болезни и содержания активированных Т-
лимфоцитов, растворимых молекул адгезии и проатерогенных цитокинов при
ишемической болезни сердца, инфаркте миокарда, стабильной и
нестабильной стенокардии (J.Parissis et al., 2002; E. Zourdidakis et al., 2004).
В то же время проявления системного воспаления, отражающие участие
иммунной системы в патогенезе ОАСНК, изучены недостаточно, а данные о
взаимосвязи количественного и функционального состояния циркулирующих
Т-лимфоцитов и проатерогенных медиаторов воспаления – цитокинов,
хемоадгезивных молекул, молекул адгезии, с тяжестью основного и
сопутствующих заболеваний при ОАСНК немногочисленны и
противоречивы. Проблематичной остается и оценка степени выраженности воспалительной реакции при этом заболевании, несмотря на обилие работ,
посвященных использованию маркеров воспаления в качестве
прогностических критериев при атеросклерозе.
В настоящее время основным методом лечения больных хроническими
облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей является
консервативная терапия. Доказана важность амбулаторного этапа, уточнена
стратегия консервативной терапии, в частности, необходимость ее
непрерывности для всех больных ОАСНК, независимо от стадии
артериальной недостаточности [Бырихин Н.И., 2002; Кошкин, В. М., 2005).
Ссовременный тактический подход к лечению больных с ОАСНК должен
обеспечивать рациональное сочетание комплекса методов направленных, в
числе прочего, на коррекцию липидного и углеводного обмена,
тромбоцитарного гемостаза и иммунных нарушений (Кошкин, В. М., 2005;
Баркаган, З. С., 2003). Однако на практике у большинства пациентов с
ОАСНК за рамками терапии остается терапия, направленная на подавление
активации Т-лимфоцитов, гиперпродукции цитокинов и свободных
радикалов. Реализация этих направлений становится возможной при
использовании фармакологических средств, обладающих
многокомпонентным действием. Среди природных соединений несомненный
интерес представляют гликаны морского происхождения, в частности
полисахариды из морских бурых водорослей, обладающие
противовоспалительными, антикоагулянтными, антитромботическими,
иммуномодулирующими, антиадгезивными, антидислипидемическими,
антиоксидантными свойствами H., 2014; Hart, G. et al.2010; Cumashi А. et al., 2007; Janet, H., 2011; 2007; Хотимченко М.Ю., 2011).
Настоящая работа посвящена исследованию возможности коррекции дисфункции иммунной и цитокиновой системы, эндотелия, липидного обмена и гемостаза у пациентов с ОАСНК при включении в комплекс терапевтических мероприятий полисахаридов из бурых водорослей, а также перспективности использования метода оценки хронического системного воспаления с помощью интегральных показателей для регистрации наличия и характера системной воспалительной реакции у пациентов с ОАСНК..
Цель исследования: на основании комплексной оценки иммунного статуса, цитокинового профиля и элементов гомеостаза пациентов с ОАСНК установить патогенетическую эффективность применения полисахаридов из бурых водорослей для оптимизации базисной терапии.
Задачи исследования: 1. Исследовать состояние врожденного и адаптивного иммунитета у пациентов с атеросклерозом сосудов нижних конечностей в зависимости от степени тяжести заболевания.
-
Изучить особенности функционирования системы цитокинов у пациентов с атеросклерозом сосудов нижних конечностей в зависимости от степени тяжести заболевания. Оценить перспективность использования плазменных уровней цитокинов для характеристики хронического системного воспаления у пациентов с ОАСНК, определения эффективности проводимой терапии и прогнозирования возможных осложнений.
-
Изучить состояние системы гемостаза, липидного обмена и адгезивной функции эндотелия у пациентов с атеросклерозом сосудов нижних конечностей в зависимости от степени тяжести заболевания.
4. Изучить влияние полисахаридов из бурых водорослей на состояние
иммунной и цитокиновой системы, липидного обмена, гемостаза и
адгезивной функции эндотелия у пациентов с ОАСНК
Научная новизна: установлены особенности дисфункции иммунной
системы у пациентов с ОАСНК II и III стадий ишемии по Фонтейну-
Покровскому, выражающиеся в изменении функциональной активности
нейтрофилов (усиление продукции АФК, снижение фагоцитарной
активности и функционального резерва), активации гуморальных и
клеточных факторов адаптивного иммунитета, усиливающихся по мере
прогрессирования заболевания. Установлено, что состояние цитокиновой
системы у пациентов с ОАСНК II и III стадий ишемии по Фонтену-
Покровскому характеризуется дисбалансом сывороточных цитокинов с
поляризацией иммунного ответа по Th1-типу (повышением уровня
проатерогенных интерлейкинов (IFN), снижением уровня
противовоспалительных цитокинов (IL-10 и IL-4), выраженным увеличением
хематтрактанта IL-8. Увеличение концентрации растворимых молекул
адгезии в сыворотке крови (sVCAM-1, sICAM-1, sЕ-selectin, sP-selectin)
отражает активацию адгезивной функции эндотелия у пациентов с ОАСНК.
Количественные параметры, характеризующие соотношение субпопуляций
лимфоцитов, уровень проатерогенных цитокинов, выраженность
активационных процессов Т-системы и эндотелия, нарушения системы
гемостаза зависят от степени тяжести основного и сопутствующих
заболеваний, и усиливаются по мере прогрессирования заболевания.
Доказана иммуно-патогенетическая эффективность применения
полисахаридов из бурых водорослей, применяемых в комплексе с базисной
терапией у пациентов с ОАСНК: снижение экспрессии активационных
антигенов на лимфоцитах, нормализация уровня IgG, сдерживание
продукции проатерогенных цитокинов, модуляция окислительно-
восстановительного потенциала и функционально-метаболических резервов
нейтрофилов, нормализация распределения холестерина между фракциями липопротеидов, снижение гиперкогуляционного потенциала крови. Практическая значимость: Обоснована целесообразность применения полисахаридов из бурых водорослей для коррекции иммунной дисфункции, нормализации свободнорадикальных процессов и липидного обмена, снижения гиперкогуляционного потенциала крови у пациентов с ОАСНК. Разработана и внедрена в практическое здравоохранение Приморского края (ГБУЗ Краевая клиническая больница № 1 и ГБУЗ Городская клиническая больница № 2 (г. Владивосток) методика применения полисахаридов из бурых водорослей в комплексе с базисной терапией у пациентов с ОАСНК, (методические рекомендации «Применение полисахаридов из бурых водорослей в комплексе с базисной терапией у пациентов с ОАСНК» (утверждены Департаментом здравоохранения администрации Приморского края). Определена возможность использования плазменных уровней цитокинов с помощью интегральных показателей для регистрации наличия и характера развития хронического системного воспаления у пациентов с ОАСНК, оценки риска развития осложнений и осуществления мониторинга проводимой терапии.
Апробация материалов работы: Результаты работы были представлены на
научно – практических конференциях и симпозиумах международного,
российского и регионального уровня: II Объединенном иммунологическом
форуме (Санкт-Петербург, 2008); IV Всероссийской конфренции по
клинической гемостазиологии и гемореалогии в сердечно-сосудистой
хирургии с международным участием (Москва,2009), VIII Конференции
иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010); VII Дальневосточном региональном
конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток,
2010). Методика применения полисахаридов из бурых водорослей в
комплексе с базисной терапией у пациентов с ОАСНК апробирована и
внедрена в практику в отделениях сердечно-сосудистой хирургии ГБУЗ
Краевая клиническая больница № 1 и ГБУЗ Городская клиническая
больница № 2 (г. Владивосток).
Публикации: Основные результаты диссертационной работы
опубликованы в 10 печатных работах, в том числе – 5 статьей - в журналах,
включенных в перечень рецензируемых научных журналов,
рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных
положений диссертации.
Объем и структура диссертационной работы: Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзор литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав
Участие врожденного иммунного ответа в атерогенезе
К настоящему времени накоплены доказательства того, что механизмы врожденного иммунитета могут участвовать в инициировании и прогрессировании атеросклероза [13,93,231,279,286]. Врожденная иммунная система состоит из эпителиально/эндотелиальных барьеров, циркулирующих клеток и неклональных наборов паттерн-распознающих рецепторов (pattern-recognition receptors (PRRS), которые связывают определенные молекулярные структуры (рathogen-associated molecular patterns (PAMP), характерные для больших групп патогенов [146]. Наиболее важными представителями семейства PRRS являются толл-подобные рецепторы (Toll-like receptors – TLR), экспрессирующиеся на клетках иммунной системы. Активация TLR эндогенными лигандами, сопровождающаяся быстрой дифференцировкой моноцитов в макрофаги и дендритные клетки, может быть одним из механизмов развития патологического повреждения тканей при атеросклерозе [89, 206, 270]. Выраженная экспрессия TLR наблюдается в эндотелиальных клетках и макрофагах в местах атеросклеротического поражения [89, 131], на моноцитах больных с острым коронарным синдромом и атеросклерозом коронарных артерий [128]. Растворимые TLRs обнаружены в атеросклеротических бляшках сонных артерий, гладкомышечных клетках и эндотелиальных клетках сосудов [129, 280]. Дендритные клетки, экспрессирующие сквенджер-рецепторы, рецепторы главного комплекса гистосовместимости (MHCII), лектиновые рецепторы С-типа (CLR), а также TLR и рецепторы для воспалительных цитокинов, играют связующую роль во взаимодействии врожденного и адаптивного иммунитета, обусловленную мощными антиген-представляющими свойствами ДК и способностью активировать Т-лимфоциты [270]. Незрелые и неактивированные ДК обнаруживаются в адвентиции [68] и интиме [213] кровеносных сосудов здоровых людей. Активированные дендритные клетки, экспрессирующие TLR, присутствуют вместе с Т-клетками н в атеросклеротических бляшках человека [124,130,133] и мышей [199,209], продуцируют большое количество IL-12p40, TNF- и ИФН-, но не IL-10 [270], а также мигрируют в лимфоидные органы, активируя там Т-клетки [93,98]. Кроме того данные ряда авторов указывают на определенную роль дендритных клеток в дестабилизации бляшки [92,124,272].
С другой стороны недавние данные свидетельствуют о критической роли ДК и TLR в подавлении иммунного ответа [287]. Показано, например, что стимуляция TLR2 зимозаном регулирует секрецию цитокинов в ДК и макрофагах, индуцируя иммунологическую толерантность (интенсивный синтез IL-10, незначительный - IL-6 и IL-12 (p70). Индукция IL-10 при этом зависит от TLR2-опосредованной активации ERK МАРК с помощью механизма, независимого от активации протеина 1 (AP-1) и фактора транскрипции с-Fos [287]. Ключевым моментом в атерогенезе является образование жировых полосок, состоящих из нагруженных липидами «пенистых клеток» - макрофагов, трансформированных из моноцитов, мигрировавших из кровотока в субэндотелиальный слой интимы [13, 191, 266]. В свою очередь, активированные макрофаги интимы секретируют в субэндотелиальное пространство более ста активных молекул (факторы комплемента, коагуляционные факторы, простагландины, лейкотриены, протеолитические энзимы), поддерживающих воспаление. В обзорах [244,286] детально рассматриваются вопросы взаимодействия макрофагов с липопротеидами, особенности их рецепторного аппарата, механизмы синтеза медиаторов воспаления. Нам представляется важным обратить внимание на работы, связанные с исследованием неоднородности циркулирующих моноцитов и тканевых макрофагов [145,245]. В обзоре [245] обобщены сведения о роли «классически активированных» (M1) и «альтернативно активированных» (M2) макрофагов, присутствующих в атеросклеротических бляшках. Показано, что человеческие атеросклеротические бляшки содержат, помимо классически активированных M1, макрофаги, экспрессирующие маннозный рецептор - маркер альтернативных макрофагов М2, которые менее склонны к преобразованию в пенистые клетки [158]. Сообщается, что классическая активация моноцитов Th1-лимфоцитами в макрофаги М1, которые вырабатывают провоспалительные цитокины, может переключаться на «альтернативную» активацию, индуцируемую Th2 и формирующих пул М2. М2 снижают воспаление, синтезируя IL-10, IL1, (TGF)-. Интересно, что макрофаги, выделенные из жировой ткани мышей, находящихся на постной диете, экспрессируют маркеры, характерные для "альтернативных" М2 фенотипов, в отличие от макрофагов, изолированных из жировой ткани получавших гиперхолестериновую диету и характеризующихся фенотипом "классически активированых» М1 клеток [200]. Приведенные выше данные интересны с точки зрения возможности использования подходов, связанных с активацией макрофагов "альтернативных" М2-фенотипов, а также дендритных клеток и субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов в терапевтическх стратегиях при атеросклерозе.
Нейтрофилы также участвуют в инициации и поддержании воспаления сосудистой стенки, путем адгезии на мембране эндотелиальных клеток с последующей активной инфильтрацией в интиму. Активированные нейтрофилы участвуют в образовании супероксид-радикалов и активных форм кислорода, усиливающих перекисное окисление белков и липидов, денатурирующих белки и повреждающих ДНК [236]. Нейтрофилы обладают гранулами, загруженными протеазами, способными к разложению фагоцитированного материала и разрушению компонентов внеклеточного матрикса, приводящему к расплавлению ткани [116]. Сведения об изменениях функциональной активности циркулирующих нейтрофилов у больных атеросклерозом немногочисленны и противоречивы [7, 47, 48]. Так, в работе [47] установлено повышение активности циркулирующих нейтрофилов при ишемической болезни сердца, связанное с увеличением в крови концентрации ИЛ-1b, ФНО-a, накоплением продуктов перекисного окисления липидов. М.В. Даниленко с соавт. [109] показали, снижение фагоцитарной активности нейтрофилов на фоне увеличения способности к продукции активных форм кислорода у пациентов с атеросклерозом артерий нижних конечностей в стадии II. Умеренное снижение фагоцитарной активности нейтрофилов у больных с атеросклерозом брюшной аорты и артерий нижних конечностей в предоперационном периоде документировано в исследовании [7]. Новицкий В.В. и др. [48], напротив установили, что течение ИБС сопровождается стимуляцией продукции нейтрофилами АФК и переваривающей способности клеток, угнетением экспрессии CD18-, Fcy- и С3b-рецепторов на неитрофилах и выраженной деструкцией эндотелия.
В-клетки, NK-клетки) и Т-клетками [237]; выделением целого ряда цитокинов из активированных Т-клеток, которые, в свою очередь, опосредуют дальнейшую атаку атеросклеротической бляшки; продукцией антител B-клетками Т- зависимым или Т- независимым образом [74, 157, 245]. Т-лимфоциты являются ключевыми иммунорегуляторными клетками, вовлеченными в атерогенез [98, 114, 169, 259, 264, 275, 285]. Они присутствуют на эндотелии среди фиксированного пула Т-клеток и среди лимфоцитов в зоне скопления в интиме мЛПНП [259]. До недавнего времени основное внимание исследователей было сосредоточено на роли Th1-типа ответа при атеросклерозе, о доминировании которого свидетельствуют субпопуляционный состав клеток и спектр Th1-цитокинов [237], мРНК и белок ИФН в зоне атеросклеротических поражений [159]. Непосредственное участие Th1 в развитии заболевания было определено и на модели атеросклеротически восприимчивых мышей, дефицитных по рецепторам для IFN- или самому IFN- [284], а также при введении IFN- апоЕ-/-мышам [127]. Обнаружено также, что отсутствие функциональных Т- и В-клеток на 70% редуцирует атеросклероз, а восстановление функциональных CD4+ клеток способствует его развитию [274]. Роль Th2 в атерогенезе остается не до конца ясной. Увеличение концентрации Th2-цитокинов в лимфоидных органах и защитных анти-IgM антител в сыворотке крови против мЛПНП, блокирующих поглощение мЛПНП скевенджер-рецепторами на макрофагах и тем самым уменьшающих образование пенистых клеток, сопутствуют значительному сокращению атеросклеротической бляшки и свидетельствуют об антиатерогенной направленности действия Th2 [82]. Однако [180] нашли, что у мышей, дефицитных по IL-4, атеросклероз был менее тяжелым, чем у IL-4+ мышей.
Помимо высокополяризованных подтипов Т-лимфоцитов - Тh1 и Тh2, обеспечивающих эффективный клеточный или гуморальный иммунный ответ, в атеросклеротических бляшках артерий обнаруживают Тh0-клетки, продуцирующие цитокины, характерные как для Тh1, так и для Тh2 лимфоцитов, а также особые субпопуляции CD4+-Т-клеток, включая Th17-клетки [267] и варианты Т-регуляторных лимфоцитов Тreg (CD4+CD25+) [234, 265], включая Th3, обладающих противооспалительными и супрессорными свойствами [170, 211]. Суммирующие сведения о ведущей роли Тreg-клеток в противодействии дебюту атеросклероза и его прогрессированию, представлены в обзоре Mallat Z, et al. [202].
Контингент, материалы и методы исследования
Клиническая часть работа выполнена на базе кафедры госпитальной хирургии ТГМУ в отделении сосудистой хирургии ГБУЗ Приморская Краевая больница №1 г. Владивостока (заведующий кафедрой д.м.н, профессор, главный сосудистый хирург Приморского края Раповка В.Г.).
Иммунологические исследования выполнены в лаборатории иммунологии ФГБУ «НИИЭМ имени Г.П.Сомова» СО РАМН. Все исследования проведены с разрешения Комитета по биомедицинской этике ФГБУ «НИИЭМ им. Г.П.Сомова» СО РАМН (протокол №5 от 05.12.2007 г.) Нами проведен анализ клинико-лабораторных и инструментальных данных пациентов, находящихся на стационарном лечении в отделении сосудистой хирургии ГБУЗ ПККБ №1 в период с 2008-2010г. Дизайн исследования. Исследование было открытым контролируемым проспективным сравнительным рандомизированным. Методом простого случайного отбора (Простая случайная выборка- Simple Random Sampling — SRS) было обследовано 60 мужчин с дигнозом: облитерирующий атеросклероз сосудов нижних конечностей; ишемия нижней конечности II-III степени по Фонтену – Покровскому. Критериями включения в исследование явились: мужской пол, возраст от 40 до 65 лет, облитерирующий атеросклероз сосудов нижних конечностей ишемия конечности II- III степени по Фонтену - Покровскому. Критериями исключения из исследования были: сахарный диабет, системное инфекционное заболевание, почечная или печёночная недостаточность, злокачественное новообразование любой локализации.
Диагноз ОАСНК выставлялся на основании клинической картины заболевания в соответствии с классификацией Фонтейна-Покровского (табл.1) с учетом клинической картины, данных лабораторных исследований (клинический анализ крови, биохимический анализ крови, анализ свёртывающей и антисвёртывающей системы), а также результатов инструментальных методов (аускультация, термометрия, измерение лодыжечного-плечевого индекса, ультразвукового дуплексного исследования сосудов). Таблица Классификация хронической ишемии по Фонтейну-Покровскому
Стадия Название Клиническая картина Лодыжечно плечевой индекс I Начальные проявления Зябкость, чувство похолодания, бледность, повышенная потливость, нарушение чувствительности 0,75-1,0 II Перемежающаяся хромота В покое болей нетIIА - боли при прохождении более 200 метровIIБ - боли при прохождении менее 200 метров 0,35-0,9 III Боли в покое Ночные боли, боли появляются при прохождении 50 и менее метров Менее 0,4 IV Появление язв Сильные боли, язвы Менее 0,25 Длительность заболевания по данным анамнеза составила от 1 до 6 лет (в среднем 3,2±1,3 года). У 16 пациентов (26,7%) стаж заболевания составил менее 1 года, у 27 пациентов (45%) – от 1,5 до 3 лет, у 17 пациентов (28,3%) – от 3 до 6 лет. Основными жалобами пациентов были боль и онемение в конечности, усиливающияся при физической нагрузке. Боль носила приступообразный характер и локализовалась чаще всего в икроножных мышцах, стопе. При объективном осмотре пациентов наблюдалось изменение окраски кожныех покровов стоп и голеней пораженной конечности (бледность с мраморным оттенком), сухость и истончение её. Конечности были холодными на ощупь, волосяной покров отсутствовал. Пульсация на артериях нижних конечностей была ослаблена, либо отсутствовала. Функциональные пробы недостаточности артериального кровообращения (проба Мошковича, проба Самюэлса, проба Ратшова, проба Оппеля) были положительными. Лодыжечно-плечевой индекс (ЛПИ) снижался у пациентов с заболеванием II степени до 0,35-0,9, у пациентов с заболеванием III степени до 0,4 и ниже, свидетельствуя о наличии обструктивного поражения артериального русла. Дистанция безболевой ходьбы у пациентов с II стадией ишемии составляла не более 200 метров, у пациентов с III стадией ишемии - не более 50 метров. При ультразвуковом дуплексном сканировании артерий регистрировалось снижение скорости кровотока или его отсутствие, утолщение стенок (стеноз) сосудов, выявлялись атеросклеротические бляшки, стенозирующие просвет сосуда, локализующиеся в бедренно - подколенном сегменте.
При оценке липидного обмена у обследуемых пациентов с ОАСНК выявлены нарушения, выражающиеся в неблагоприятном распределении ОХС между атерогенными и антиатерогенными фракциями липопротеидов накоплении его в ЛПОНП и ЛПНП, что приводило к увеличению индекса атерогенности, значимо отличавшегося от такового у здоровых доноров. Уровень общего холестерина, в сыворотке крови пациентов с ОАСНК, варьировал от нормальных значений ( 5,2 ммоль/л) до высоких (6,2 ммоль/л), средние значения в группах до начала исследования находились в пределах 4,2-6,4 ммоль/л Уровень триглицеридов находился в границах значений нормы, однако значимо отличался от средних значений в группе здоровых доноров (табл.2).
Исследование свёртывающей и антисвёртывающей системы у пациентов с ОАСНК выявило нарушения гемостаза, сопровождающиеся активацией внутреннего каскада прокоагулянтного звена системы гемостаза (снижение АПТВ, увеличение концентрации фибриногена, укорочение ТВ по сравнению с показателемя у здоровых доноров) (табл.3).
Каждому пациенту в доступной форме была объяснена цель предстоящей работы, возможные побочные явления и преимущества, связанные с его участием в этом исследовании. Распределение пациентов проводилось в два этапа: первоначальное разделение на группы по степени тяжести заболевания с последующей рандомизацией вручную с помощью метода “запечатанных конвертов” (история болезни каждого из пациентов вкладывалась в конверт, конверты перемешивались, нумеровались и случайным образом делились на 4 блока). В результате были сформированы 4 группы пациентов .
Пациенты контрольной группы получали только базисное лечение, включающее охранительный режим, лечебное питание, дезинтоксикационную терапию, антикоагулянты, антигипоксанты антиагреганты, ангиопротекторы, средства, улучшающие трофику тканей. Инфузионная программа составляла в среднем от 10 до 15 мл/кг/сутки, включая средства для разведения, полиионные растворы.
Пациенты опытной группы в комплексе с базисной терапией получали БАД «Фуколам» по 1 капсуле, содержащей 100 мг фукоидана из Fucus evanescens и 400 мг солей альгиновых кислот из бурых водорослей, внутрь два раза в сутки в течение 28 дней. БАД «Фуколам» на основе полисахаридов из бурой водоросли Fucus evanescens (фукоидан, альгиновые кислоты) (капсулы по 0,5 г) разрешена к применению (Свидетельство Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека о государственной регистрации (№77.99.23.3.У.739.1.06 от 30.01.06. Нормативная документация: ТУ 9284-065-02698170-2005 «Фуколам» Биологически активная добавка к пище»; СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов", СанПиН 2.3.2.1290-03 "Гигиенические требования к организации производства и оборота биологически активных добавок к пище (БАД)".
С целью сравнения исследуемых показателей использовали кровь 30 условно здоровых доноров, полученную из Краевой станции переливания крови. Забор венозной крови для биохимических и иммунологических исследований проводили в равных условиях (утром, натощак, в количестве 12-15 мл). Исследования выполнялись дважды: до начала лечения и после его окончания.
Характеристика состояния адаптивного гуморального иммунитета у пациентов с ОАСНК в зависимости от степени тяжести заболевания
Как мы уже отмечали в обзоре литературы, развитие атеросклероза ассоциируется с признаками активации В-клеток. У людей и животных в атеросклеротических поражениях обнаруживаются В-лимфоциты и иммуноглобулин-продуцирующие клетки [67], а также IgG, некоторые из которых могут быть специфическими для антигенов, присутствующих в тканях [221].
Накопление IgG (мРНК иммуноглобулина и растворимых IgG) в области атеросклеротических поражений может быть связано как с увеличением фильтрации через почки, так и с возможностью местного синтеза плазматическими клетками [67,150]. Так или иначе, вовлеченность иммунной системы в атерогенез отражается в изменении факторов гуморального звена, в том числе и в общем уровне сывороточных иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgА), в частности, увеличении IgG и IgA и накоплении патологических иммунных комплексов [82,201]. Вместе с тем, данные о состоянии гуморального иммунитета у пациентов с ОАСНК достаточно разноречивы [14,26,61]. В этой связи мы сочли необходимым исследовать показатели гуморального звена иммунитета у данной группы пациентов - относительное содержание и абсолютное количество субпопуляции CD19+ -лимфоцитов и уровень иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgА) в сыворотке крови, позволяющие оценить потенциал гуморального (антительного) иммунного ответа без учета антигенной специфичности. Полученные данные анализировали с учетом нормальных иммунологических параметров здоровых доноров.
Сравнительный анализ средних значений относительного содержания и абсолютного количества субпопуляции CD19+ у пациентов с ОАСНК во всей выборке находился в пределах широкой границы вариабельности нормальных значений (± два стандартных отклонений) и значимо не различался по сравнению с соответствующим показателем в группе здоровых доноров (табл. 4). Значимые различия относительного содержания и абсолютного количества субпопуляции CD19+ -лимфоцитов (16,00 (12,00-21,00)%) по сравнению с таковыми у здоровых доноров выявлены лишь у пациентов с заболеванием III стадии.
Повышенное содержание В–лимфоцитов у пациентов с заболеванием III стадии сопровождалось значимым увеличением уровня IgG в сыворотке крови (16,3±3,8 г/л), превышающим средние значения показателя среди всех обследованных пациентов (14,2±3,7 г/л, p=0,029). Концентрация IgA и IgM в сыворотке крови пациентов с ОАСНК как во всей выборке, так и у пациентов с II и III стадией значимо не отличалась от таковой у здоровых доноров (табл. 9).
Увеличение концентрации IgG отражает участие В-системы иммунитета в развитии хронического воспалительного процесса у пациентов с ОАСНК и может быть связано с усилением продукции анти-мЛПНП аутоантител.
Таким образом, результаты, представленные в этих разделах, позволили установить, что у пациентов с атеросклерозом сосудов нижних конечностей II – III стадии по Фонтейну - Покровскому показатели, характеризующие структуру основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови, находятся в границах значений, констатирующих удовлетворительную функцию иммунной системы. В то же время у пациентов выявлены признаки хронической Т-клеточной активации, сопряженной с увеличением количества циркулирующих Т-лимфоцитов, экспрессирующих ранние и поздние активационные антигены. Выраженность активационных процессов циркулирующих активированных Т-лимфоцитов зависит от степени тяжести заболевания. Признаки активации гуморального иммунитета документированы у пациентов с III стадии по Фонтейну – Покровскому.
Фагоцитарная система является важным звеном врожденного иммунитета, направленного на уничтожение экзогенных и эндогенных факторов, нарушающих постоянство внутренней среды макроорганизма.
Нейтрофилы и моноциты участвуют в инициации и поддержании воспаления сосудистой стенки, адгезируя на мембране эндотелиальных клеток с последующей активной инфильтрацией. При этом активированные нейтрофилы участвуют в образовании активных форм кислорода, супероксид-радикалов, усиливающих перекисное окисление липидов и белков. В то же время, нейтрофилы играют важную роль в элиминации модифицированных липопротеинов, которые не могут поступать в ткани рецепторным путем, а начинают удаляться фагоцитирующими клетками. Исследование изменений функциональной активности нейтрофилов позволяет составить представление о потенциальнй способности фагоцитировать мЛПНП, а также о состоянии кислородзависимого метаболизма в клетках и связанной с ним генерации активных форм кислорода.
Проведеннные нами исследования функциональной активности нейтрофилов крови пациентов с ОАСНК выявили признаки одновременной активации и истощения функций клеток по мере прогрессирования заболевания. Было установлено, что у пациентов с ОАСНК (вся выборка) до начала терапии показатели активности спонтанного НСТ-теста, отражающего уровень продукции нейтрофилами супероксидного аниона и степень функционального раздражения клеток in vivo, а также активность индуцированного НСТ-теста были повышены по сравнению с таковыми у здоровых доноров, индекс функционального резерва нейтрофилов снижен. Фагоцитаный показатель (% клеток, участвующих в фагоцитозе), а также способность Нф поглощать частицы латекса, снижен (табл. 10). Таблица 10
Нарушения эффекторных функций нейтрофилов были более выраженным у пациентов с заболеванием III стадии. Мы полагаем, что эти изменения свидетельствуют о развивающейся недостаточности эффекторных функций нейтрофилов и связаны с истощением функциональных резервов клеток на фоне длительной активации.
Патогенетическая значимость цитокинов при атеросклерозе определяется проявляемыми ими эффектами - либо проатерогенными (провоспалительные цитокины), либо атеропротекторными (противовоспа-лительные цитокины) [143]. Возможность выявления и одновременного измерения различных цитокинов в периферической крови подчеркивает их потенциал в качестве биомаркеров атеросклероза. Это обстоятельство определило увеличение количества исследований в области сосудистой медицины для идентификации групп повышенного риска развития артериостеноза или аневризмы артерий. Большое количество исследований посвящено оценке прогностической значимости цитокинов при ишемической болезни сердца и аневризме аорты. Доказана сопряженность манифестации клинических симптомов атеросклеротической болезни и содержания активированных Т-лимфоцитов, растворимых молекул адгезии и проатерогенных цитокинов при ишемической болезни сердца, инфаркте миокарда, стабильной и нестабильной стенкардии [49,69,122,126]. Однако эти данные не могут быть напрямую экстраполированы на атеросклероз сосудов нижних конечностей, что связано с различными условиями развития воспаления.
Уровень растворимых молекул адгезии (sVCAM-1, sICAM-1, sP-selectin, sЕ-selectin) в сыворотке крови у пациентов с ОАСНК в зависимости от степени тяжести заболевания
Молекулы клеточной адгезии, опосредующие адгезию циркулирующих лейкоцитов к стенке кровеносных сосудов и их последующую миграцию в субэндотелиальное пространство, играют важную роль на всех стадиях атеросклероза. Растворимые формы молекул появляются в сосудистом русле в результате протеолитического шеддинга, их концентрация в сыворотке крови увеличивается параллельно с усилением экспрессии на поверхности клеток [84,95,125]. Уровень растворимых форм молекул адгезии является чувствительным индикатором степени атеросклеротического повреждения артерий [33,34]. Рост уровня растворимых молекул адгезии косвенно указывает и на усиление деструкции клеток, где они экспрессируются [54] . К настоящему времени показана роль растворимых молекул адгезии при ишемической болезни сердца, инфаркте миокарда, стабильной и нестабильной стенкардии [126,129]. Исследования уровня молекул адгезии в сыворотке крови пациентов с ОАСНК проводились разными авторами [90,156,168], однако, полученные результаты достаточно противоречивы. На сегодняшний день отсутствует единое мнение и о выраженности изменений показателей, характеризующих адгезивные свойства эндотелия при прогрессировании заболевания, дискутируется вопрос о прогностической ценности молекул адгезии и потенциальном значении в клинической практике. Повышенный уровень растворимых форм молекул адгезии в сыворотке и плазме может быть ассоциирован с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний, атеросклеротическими проявлениями, в том числе ОАСНК, а также прогрессированием заболевания [70, 95, 167].
Для уточнения механизмов дисфункции эндотелия при ОАСНК проведено изучение уровня растворимых молекул адгезии (sVCAM-1, sICAM-1, sP-selectin, sЕ-selectin) в зависимости от тяжести заболевания.
Установлено, что до начала терапии у пациентов с ОАСНК концентрация молекул межклеточной адгезии в сыворотке крови значимо превышала показатели у здоровых доноров (табл.15), отражая процессы активации эндотелия. При этом изменения касались как селектинов, принимающих участие в каскаде процессов адгезии клеток на этапе атаки и активации, так и молекул межклеточной адгезии 1го типа (ICAM1) и молекул адгезии сосудистого эндотелия 1го типа (VCAM1), реализующих свой потенциал на этапе прикрепления и трансэндотелиальной миграции лейкоцитов. Таблица 15
Так, концентрация sICAM-1 в сыворотке крови пациентов ОАСНК контрольной и опытной групп составляла 349,8±230,2 нг/мл и 389,4±127,1 нг/мл соответственно, превышая уровень молекул у здоровых доноров 212,3±73,2 нг/мл (р=0,000; р=0,003). Исходный уровень sVCAM-1 у пациентов, которым проводилась базовая терапия, составлял 433,3±65,4 нг/мл. Показатели концентрации sP-селектина в контрольной и опытной группе значимо не различались между собой и составляли 241,8±108,0 нг/мл и 232,3±124,0 нг/мл соответственно, значимо отличаясь при этом от уровня молекулы в сыворотке крови здоровых доноров (184,6±82,9 нг/мл, p=0,000; p=0,048). Уровень sE-селектина у пациентов обеих групп значимо отличался от такового в крови здоровых доноров (p=0,000).
При анализе уровней sP-селектина и sE-селектина выявлена схожая закономерность: концентрация молекулы sP-селектина (284±121,7 нг/мл) и sE-селектина (59,5±9,7) у пациентов с III стадией ишемии была значимо выше, чем у пациентов с II стадией (216,3±111,0 нг/мл, р=0,027) и 52,3±14,0 (p=0,025). Таким образом, полученные данные, документирующие различия между показателями растворимых молекул адгезии у пациентов с ОАСНК II и III стадий, подтверждают связь этих маркеров с прогрессированием атеросклероза, отражая степень воспаления в стенке артерий.
