Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Характеристика и эволюция системы HLA 11
1.2. Значение HLA в антропологии и популяционной генетике 20
1.3. Популяции Челябинской области 25
Глава 2. Материалы и методы исследования 30
2.1. Контингент обследуемых лиц 30
2.2. Иммуногенетическое типирование 31
2.3. Статистическая обработка 32
Глава 3. Результаты 38
3.1. Русские ЧО. Распределение частот генов HLA-А и -В и их гаплотипов 38
3.2. Татары ЧО. Распределение частот генов HLA-А и -В и их гаплотипов 39
3.3. Башкиры ЧО. Распределение частот генов HLA-А и -В и их гаплотипов 40
3.4. Нагайбаки ЧО. Распределение частот генов HLA-А и -В и их гаплотипов 41
3.5. Неравновесное сцепление между локусами HLA A и В в популяциях Челябинской области 42
3.6. Генетические расстояния между популяциями ЧО и другими мировыми популяциями 43
3.7. Дерево популяций 45
3.8. Анализ соответствий 46
3.9. Корреляция между географическим и генетическим расстояниями 49
Глава 4. Обсуждение 51
Заключение 71
Список сокращений 74
Список литературы 75
Приложение 93
- Значение HLA в антропологии и популяционной генетике
- Иммуногенетическое типирование
- Башкиры ЧО. Распределение частот генов HLA-А и -В и их гаплотипов
- Корреляция между географическим и генетическим расстояниями
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Открытие первого лейкоцитарного антигена человека Жаном Досе в 1958 году (Dausset J. Iso-leuco-anticorps. Acta Hmat. 1958. V.20. P. 156-166) положило начало всестороннему изучению системы HLA (Human Leukocyte Antigen). Интенсивному развитию исследований в значительной мере способствовало тесное сотрудничество ученых из разных стран мира. Международные рабочие совещания, посвященные HLA и Иммуногенетике, сыграли важную роль в изучении главного комплекса гистосовместимости, разработке классификации и номенклатуры аллелей, а также помогли разработать стандарты для клинической практики.
На сегодняшний день система HLA представляет собой одну из самых изученных генетических систем организма человека. Это объясняется тем, что она является ключевым элементом в иммунной системе, позволяющим отличать «свое» от «чужого» (Amos D.B. Skin graft rejection between subjects genotyped for HL-A. Transplant. Proc. 1969. V.1, №1. P. 342-346; Ceppellini R. et al. Experimental allotransplantation in man. I. The role of the HL-A system in different genetic combinations. Proc. 1969. V.1, №1. P. 385-389; Knobloch C. et al. Self-nonself discrimination and repertoire selection of human T cells differentiated in an HLA-semiallogeneic environment following bone marrow transplantation for severe combined immunodeficiency. Eur. J. Immunol. 1991. V.21, №10. P. 2479-2487). По этой причине для успешной трансплантации органов и тканей необходимо максимальное совпадение донора и реципиента по антигенам HLA. Кроме этого, гены HLA играют важную роль в предрасположенности к ряду аутоиммунных и инфекционных заболеваний, определяя адекватность иммунного ответа (Amiel J. Study of the leucocyte phenotypes in Hodgkin’s disease. Histocompatibility testing 1967: report of a conference and workshop. Baltimore: Williams and Wilkins. P. 79–81; Blackwell J.M. et al. HLA and Infectious Diseases. Clin. Microbiol. Rev. 2009. V.22, №2. P. 370-385; HLA and disease - the molecular basis : Alfred Benzon Symposium 40 : proceedings of a symposium held at the Royal Danish Academy of Sciences and Letters, August 4-8, 1996. Copenhagen: Munksgaard, 1997. 440 p.; Pereyra F. et al. The Major Genetic Determinants of HIV-1 Control Affect HLA Class I Peptide Presentation. Science. 2010. V.330, №6010, P. 1551–1557; Schlosstein L. High Association of an HL-A Antigen, W27, with Ankylosing Spondylitis. N. Engl. J. Med. 1973. V. 288, №14. P. 704-706).
Помимо непосредственной практической значимости в медицине система HLA благодаря необычайному полиморфизму представляет большой интерес для антропологических исследований, изучения генетической истории человеческого вида и механизмов молекулярной эволюции (Meyer D. Signatures of Demographic History and Natural Selection in the Human Major Histocompatibility Complex Loci. Genetics. 2006. V.173, №4. P. 2121-2142; Panneerchelvam S. HLA Polymorphism in Anthropology. Abdel-Salam B. Histocompatibility. InTech, 2012. 196 p.; Sanchez-Mazas A. et al. Immunogenetics as a tool in anthropological studies. Immunology. 2011. V.133, №2. P. 143-164). Уже в 1980 году Жан Досе в своей нобелевской речи подчеркивал особую роль HLA в антропологических исследованиях (Dausset J. The Nobel Lectures in Immunology. The Nobel Prize for Physiology or Medicine, 1980. The major histocompatibility complex in man. Past, present, and future concepts. Scand. J.
Immunol. 1992. V.36, №2. P. 145-157). В настоящее время на ежегодных конференциях, посвященных иммуногенетике, значительное внимание уделяется исследованию профилей HLA различных мировых популяций, а гены системы HLA, наряду с другими генетическими маркерами (мтДНК, Y-хромосома, микросателлитные локусы), используются для исследований демографической истории популяций.
На сегодняшний день Российская Федерация является одним из наименее изученных регионов мира в плане установления HLA-профиля популяций. Это связано как с е размерами, так и с чрезвычайно большим числом народностей, проживающих на е территории. В связи с этим, этническое разнообразие нашей страны не было использовано в полной мере для исследования полиморфизма генов HLA. Однако в последние годы, благодаря распространению в России методов ДНК-типирования, такая возможность появилась. (Хромова Н. А. Полиморфизм системы HLA у представителей разных славянских этнических групп: русской, белорусской и украинской автореф. дис. ... канд. мед. наук. Москва, 2006. 29 с.).
Южный Урал представляет собой один из наиболее многонациональных и
поликонфессиональных регионов России. С глубокой древности на территории
края сталкивались народы, пришедшие с Востока и с Запада. В результате их
взаимодействия происходило не только взаимное проникновение культурных
влияний, но также генетическое смешение и формирование новых этносов. На
сегодняшний день Челябинская область насчитывает более 20 национальностей, из
которых, согласно Всероссийской переписи населения 2010 г., 83,8 % составляют
русские, 5,36 % – татары и 4,81 %– башкиры. Кроме того, на территории
Челябинской области проживает 7679 нагайбаков, что составляет 90% от общей
численности этой популяции (Итоги Всероссийской переписи населения
[Электронный ресурс]. – Москва, 2010. Режим доступа: ).
Неизбежный процесс глобализации, активно начавшийся в XX веке, неумолимо стирает границы между ранее обособленными популяциями. Свобода перемещения и исчезновение необходимости выбора брачного партнера в пределах своей популяции приводят к обмену генами между ранее изолированными народами, что в значительной мере затрудняет популяционно-генетические исследования. Эти обстоятельства объясняют необходимость проведения подобных исследований в настоящее время.
Цель исследования
Установить иммуногенетический профиль популяций Челябинской области (русские, татары, башкиры и нагайбаки) по генам HLA I класса (HLA-A и -B) и определить их место в структуре мировых популяций.
Задачи исследования
-
Охарактеризовать распределение генных частот локусов HLA-А и -В, а также их гаплотипических сочетаний в 4-х популяциях Челябинской области: русские, татары, башкиры, нагайбаки.
-
Исходя из полученных частот локусов HLA-А и -В рассчитать генетические расстояния между популяциями Челябинской области и другими мировыми популяциями, и на их основе построить дерево популяций.
-
На основе частот локусов HLA-А и -В провести анализ соответствий для последующего разделения популяций на группы и установления места популяций Челябинской области в структуре мировых популяций.
-
Рассмотреть корреляцию между генетическим и географическим расстояниями для популяций Челябинской области в сравнении с другими мировыми популяциями.
Методология и методы исследования
Исследование проведено в рамках научной проблемы «Популяционная иммуногенетика». Выборка представителей 4-х национальностей, проживающих на территории Челябинской области, проводилась среди доноров Челябинской областной станции переливания крови. Принадлежность к определенной этнической группе определялась согласно рекомендациям 8-го Международного Уоркшопа 1980 года.
В ходе экспериментальной части исследования установлено распределение генных частот локусов HLA A и B. Типирование проводилось при помощи полимеразной цепной реакции с сиквенс-специфическими праймерами.
Для проведения аналитической части исследования был произведен поиск данных о распределении генных частот HLA локусов А и В в мировых популяциях, в результате чего была сформирована выборка из 22-х популяций, проживающих на Евразийском континенте. При выборе популяций особое внимание уделялось тому, чтобы генные частоты были определены с помощью молекулярно-генетических методов. Матрица распределения генных частот, включающая 26 популяций, легла в основу расчета генетических расстояний по Нею, которые, в свою очередь, стали основой для построения популяционного дерева методом объединенных соседей.
Для визуализации информации, заключенной в генных частотах, проведен анализ соответствий, который позволяет представить взаимное положение популяций на графике, построенном по двум первым осям инерции. Исходя из расположения популяций на графике анализа соответствий, популяции были разделены на группы.
Расстояния между популяциями, рассчитанные на основе их координат на графике анализа соответствий, сопоставлены с физическими расстояниями между популяциями для определения корреляции между генетическим и географическим расстояниями.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Результаты молекулярно-генетического типирования получены при помощи праймеров, успешно проходящими ежегодный контроль на качество типирования EPT (External Proficiency Testing), организованный Европейской Федерацией Иммуногенетики (EFI). Анализ результатов проводился методами, используемыми для обработки данных в популяционной иммуногенетике. Результаты, полученные на основе генов HLA, в целом согласуются с данными, представленным для мтДНК. В работе использованы современные методы получения и обработки исходной информации с использованием прикладных компьютерных программ: Arlequin 3.5, Phylip 3.68, R-статистика.
Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на российских и зарубежных научных конференциях, посвященных HLA и иммуногенетике: конференция зональной лаборатории иммунологического типирования тканей
«Фундаментальное и прикладное значение оценки генов иммунного ответа» (г. Челябинск, 2008), Всероссийская конференция с международным участием «Главный комплекс гистосовместимости – к 50-летию открытия» (г. Санкт-Петербург, 2009), 5th East-West Immunogenetics Conference (Чехия, 2010), 25th European Immunogenetics and Histocompatibility Conference (Чехия, 2011), 8th East-West Immunogenetics Conference (Австрия, 2014).
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии во всех этапах диссертационного исследования, в планировании научной работы, наборе популяционных выборок, проведении молекулярно-генетического типирования, углубленном анализе отечественной и зарубежной научной литературы, анализе и интерпретации экспериментальных данных, их систематизации, статистической обработке с описанием полученных результатов, написании и оформлении рукописи диссертации, основных публикаций по выполненной работе.
Положения, выносимые на защиту
-
Русские Челябинской области являются типично европеоидной популяцией, не демонстрирующей признаков монголоидного влияния. Русская популяция – единственная из рассмотренных нами мировых популяций, для которой отсутствует корреляция между генетическим и географическим расстояниями.
-
Башкиры Челябинской области примерно в равной степени включают в себя как европеоидные, так и монголоидные характеристики распределения генов HLA. Среди популяций Челябинской области они демонстрируют наибольшую корреляцию между генетическим и географическим расстояниями. По всей видимости, башкиры не только первыми из исследованных популяций, появились на Южном Урале, но и сформировались как этнос на его территории.
-
Татары и нагайбаки Челябинской области располагаются среди популяций Юго-Восточной Европы (хорватов, македонцев, болгар, турок), в непосредственной близости друг от друга. В то же время, в обеих популяциях обнаружено аллельное семейство В*46, не встречающееся в европейских популяциях, а, следовательно, указывающее на присутствие монголоидного вклада в генофонд данных популяций.
-
Нагайбаки Челябинской области, несмотря на сходство с татарами, своими предполагаемыми предками, имеют ряд особенностей в распределении генов HLA. В нагайбакской популяции присутствует аллельное семейство В*45, не обнаруженное в других популяциях Челябинской области, и крайне редко встречающееся в других мировых популяциях. Кроме того, нагайбаки отличаются от других популяций Челябинской области наличием наибольшего количества уникальных гаплотипов HLA А-В, большинство из которых не характерно ни для одной другой мировой популяции.
Научная новизна
В ходе нашего исследования впервые методом молекулярного типирования получены данные о распределении частот генов HLA A и HLA B, а также их гаплотипов, в 4-х популяциях Челябинской области: русские, татары, башкиры, нагайбаки. Впервые, исходя из генных частот HLA I класса, рассчитаны генетические расстояния между исследованными и мировыми популяциями, и на их основе построено неукорененное дерево объединенных соседей. Кроме того, впервые на основе генов HLA I класса проведен анализ соответствий для
популяций Челябинской области (русские, татары, башкиры, нагайбаки), благодаря чему установлено их место в структуре мировых популяций.
Проведенные исследования демонстрируют уникальные особенности HLA-профиля популяций, проживающих на территории Южного Урала. Полученные генные частоты вошли в международную базу данных The Allele Frequency Net Database и представлены на сайте Результаты работы помогают понять закономерности распределения генов HLA в мировых популяциях, представляют интерес для изучения генетической истории человеческого вида, а, кроме того, создают основу для развития клинической трансплантологии, позволяя составить более эффективные алгоритмы поиска совместимого неродственного донора стволовой клетки.
Теоретическая и практическая значимость работы
Данные о распределении частот генов HLA A и HLA B, а также их гаплотипов в 4-х популяциях Челябинской области имеют самостоятельное популяционно-генетическое значение. В 2011 году они были включены в международный проект Analysis of HLA Population Data (AHPD), результаты которого отражены в международной базе данных популяционной иммуногенетики The Allele Frequency Net Database
Полученные данные могут быть использованы в качестве контроля для исследований по проблеме «HLA и болезни» в соответствующих популяциях, а также найти применение в оптимизации поиска неродственного донора гемопоэтических стволовых клеток.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты типирования представителей 4-х национальностей вошли в состав Регистра доноров стволовой клетки Челябинской областной станции переливания крови.
Данные о распределении генных частот HLA используются в качестве контроля при исследовании связи HLA с заболеваниями.
Результаты работы внедрены в учебный процесс: используются при преподавании отдельных тем курса иммунологии на биологическом факультете ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет».
Публикации
Автор имеет 25 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 16 научных работ общим объмом 2,7 печатного листа, в том числе 5 публикаций в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 6 работ в зарубежных научных изданиях. Соискателем опубликовано 5 работ в материалах всероссийских и международных конференций.
Структура и объем диссертации
Значение HLA в антропологии и популяционной генетике
Анализ геномного разнообразия современных популяций человека на основе полиморфных ДНК-маркеров является мощным инструментом для описания генетических особенностей народов, реконструкции их исторических взаимоотношений, а также становления человека как биологического вида в целом. Система HLA относится к «классическим» иммунологическим маркерам популяционной генетики [28]. Возможность определения полиморфизма антигенов серологическими методами позволила изучить распределение локусов HLA в популяциях еще до появления молекулярно-генетического типирования. Кодоминатность маркеров HLA позволяла отличить гетерозигот от гомозигот, определять генотипы индивидуумов и устанавливать аллельные частоты. На сегодняшний день система HLA продолжает занимать важное место в изучении популяционных взаимоотношений. При этом благодаря необычайному полиморфизму даже ограниченный набор локусов является достаточно информативным. Неравновесное сцепление, наблюдаемое между локусами, отражает процессы миграции и генетического дрейфа и в условиях отсутствия отбора может указывать на количество поколений прошедшее со времени разделения близких популяций [133].
Проводимые исследования доказывают эффективность использования генетических маркеров HLA в филогенетике. Serjeantson et al. [154] на основе генных частот и неравновесного сцепления локусов HLA А и В установили взаимоотношения и направления миграций в 16-ти популяциях Тихоокеанских островов. Shaw et al. [155] использовали частоты генов HLA-A, -B, -DR и -DQ, а также их гаплотипы для демонстрации того, что тайваньские аборигены имеют генетический профиль отличный от китайских популяций, а их ближайшие родственники проживают на острове Ява. Используя распределение аллелей в HLA I (A и B) и II (DRB1 и DQB1) классов, неравновесное сцепление и кластерный анализ Arnaiz-Villena et al. [43] показали, какие из американских индейцев являются первыми коренными жителями Америки, а какие пришли с более поздними волнами миграции. Не так давно Buhler и Sanchez-Mazas [54] при помощи секвенирования семи генов HLA у 23,500 индивидуумов из 200 популяций обнаружили значительную корреляцию между генетическим и географическим расстояниями, что совпадает с более ранними исследованиями HLA, основанными на генных частотах. Они также пришли к выводу, что география играет определяющую роль в оценке генетического разнообразия [133]. При этом следует отметить, что для популяций, близко расположенных друг по отношению к другу, генетическое и географическое расстояния имеют высокую корреляцию (рисунок 3). Однако с увеличением географического расстояния в большинстве случаев данная корреляция пропадает [60].
Не следует забывать о том, что почти все классические локусы HLA находятся под влиянием тех или иных форм естественного отбора [141]. Однако еще в самом начале применения полиморфизма HLA в популяционной генетике было отмечено, что естественный отбор не является единственным механизмом, участвующим в эволюции данной системы, а основным фактором, влияющим на эволюцию HLA разнообразия по всему миру являются миграции [147, 149]. Исследования, цель которых была определить коэффициент отбора для локусов HLA, показали, что антигенсвязывающий участок молекул HLA находится лишь под небольшим давлением отбора, не превышающим нескольких процентов [63, 151], в то время как другие полиморфизмы, подвергающиеся отбору, достигают значительно больших значений, например, 10–20% для G6PD/A- связанный с малярией [152]. Кроме того, интенсивность отбора по локусам HLA может различаться в зависимости от региона, в зависимости от патогенной нагрузки. А для некоторых регионов давление отбора может вообще отсутствовать, как это было показано для Юго-Восточной Европы по сравнению с Северо-Западной Африкой [63]. Таким образом, разнообразие гаплотипов, вариация аллельных частот и анализ неравновесного сцепления генов HLA предоставляют важную информацию для антропологических исследований, и исключать использование полиморфизма HLA для изучения миграций человечества по причине действия отбора было бы неразумно. Популяционно-иммуногенетическая характеристика европеоидов и монголоидов на уровне HLA I класса. Исследование разнообразия генов HLA в этнических группах и популяциях, принадлежащих к различным расам, является одним из основных направлений изучения главного комплекса гистосовместимости. Важным этапом в определении основных иммуногенетических характеристик мировых популяций стали коллективные исследования, выполненные в 1987-1991гг. в рамках программы XI Международного рабочего совещания по исследованию HLA [97], в так называемом антропологическом разделе, в котором участвовало 1000 научных центров. Участники программы изучили распределение HLA-антигенов в 80 популяциях и этнических группах, относящихся к европеоидной, монголоидной и негроидной расам [97]. В последующие 20 лет в связи с появлением молекулярно-генетического типирования данные об HLA разнообразии мировых популяций были расширены и стали более точными. В настоящее время существует профессиональный сайт – http://www.allelefrequencies.net – база данных, содержащая информацию о распределении антигенов, генов и гаплотипов HLA среди мировых популяций. В 2008 году Solberg et al. [159] составили таблицу наиболее распространенных аллелей для 10 мировых регионов по 8 локусам HLA. В соответствии с этими данными, для европеоидной популяции характерно следующее: в локусе HLA-А наиболее распространенным является аллель А 02:01:01G, который считается филогенетически самым старым. С высокой частотой представлены также гены А 01:01:01G, А 03:01 и А 24:02:01G. Их суммарная частота составляет 0,63. В локусе НLA-В наиболее распространенны гены HLA B 07:02, B 08:01, B 44:02 и B 51:01. Их суммарная частота составляет около 0,36. Наиболее распространенным HLA гаплотипом для европейских популяций является HLA A 01:01-B 08:01, встречающийся с частотой от 0,02 до 0,14 в зависимости от популяции. Расширенный гаплотип AH8.1 A 01:01 Cw 07:01-B 08:01-DRB1 03:01-DQA1 05:01-DQB1 02:01, в состав которого он входит, включает 4,7 миллиона нуклеотидных оснований и представляет собой второй самый длинный гаплотип в геноме человека [99, 140]. Длинна и частота данного гаплотипа необычна для системы HLA, уровень эволюции которой приводит к быстрой деградации столь длинных гаплотипов. Предполагается, что он появился в Иберии или Африке, а современные носители восходят к единому общему предку [140]. Другой европейский гаплотип, также включающий частые аллели – HLA A 03:01-B 07:02 – распространен в основном в западной и центральной Европе. Он также входит в состав расширенного гаплотипа AH7.1 A 0301-C 0702- B 0702- DRB1 1501-DQA1 0102-DQB1 0602. В настоящее время данный гаплотип считается самым протяженным в человеческом геноме (4,8 миллиона пар оснований). Следует отметить, что в составе данного гаплотипа вместо аллеля HLA A 03:01 может стоять HLA А 02:01.
Иммуногенетическое типирование
В качестве материала для исследования использовалась венозная кровь, взятая в пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА). Выделение ДНК из представленных образцов проводили с использованием реагентов Axygen (Quiagen, Германия) согласно инструкции
производителя. Генотипирование осуществляли методом полимеразной цепной реакции с сиквенс-специфическими праймерами (PCR-SSP). Из праймеров согласно методике описанной в статье Downing et al. [70] были приготовлены 30 смесей праймеров для локуса HLA-A и 46 смесей для локуса HLA-B. Для проведения полимеразной цепной реакции использовались «Терцик», производитель НПФ «ДНК-Технология» и амплификатор GeneAmp 9700 Applied Biosystems (США). Детекцию результатов проводили в 2,5% агарозном геле.
Определение абсолютного количества аллельных семейств (X) локусов HLA A и B проводилось путем прямого подсчета полученных результатов. Генная частота (gf), представляющая собой долю определенного аллельного семейства среди всех аллельных семейств в исследуемой популяции, вычислялась по формуле: где Х – абсолютная частота аллельного семейства, N – удвоенное количество человек в исследуемой выборке. Для каждого значения генной частоты проводилось вычисление ее стандартной ошибки (se) [9]:
Соответствие наблюдаемого распределения аллельных семейств равновесию Харди-Вайнберга определялось в компьютерной программе Arlequin 3.5 [89, 75]. Кроме того, в программе Arlequin 3.5 проводилась оценка частот двухлокусных гаплотипов HLA A-B и определение гаметной фазы методом максимизации ожидания (Expectation-Maximization algorithm) [68, 75, 170]. Данный алгоритм представляет собой многократно повторяющуюся процедуру, целью которой является установление ассоциации между аллелями двух локусов и определение наиболее вероятных частот двухлокусных гаплотипов.
Оценка неравновесного сцепления – неслучайной ассоциации двух аллелей в прилегающих локусах – проводилась после определения гаметной фазы. На основе классического коэффициента, измеряющего отклонение частоты наблюдаемого гаплотипа от случайного сочетания аллелей разных локусов (D), было рассчитано стандартизованное значение (D ). Данная величина в отличие от D, не зависит от относительной частоты аллеля, вследствие чего высокие значения неравновесного сцепления наблюдаются не только для частых, но и для редких аллелей.
Сходства и различия в частотах встречаемости аллелей использовались для выяснения эволюционных взаимосвязей. Расчт генетических расстояний и построение неукорененных деревьев проводили при помощи компьютерной программы Phylip 3.68 [76]. Среди множества мер генетического расстояния было выбрано наиболее широко используемое – генетическое расстояние по Нею [76, 128], которое, по данным компьютерного моделирования, является наиболее эффективным среди методов, основанных на матрицах расстояний [146].
Генетическое расстояние по Нею предполагает, что различия в частотах обусловлены генетическим дрейфом и применяется в случае бесконечной изоаллельной модели мутаций, в которой присутствует определенная частота нейтральных мутаций, а каждый мутант несет новый аллель. Предполагается также, что все локусы имеют равные частоты нейтральных мутаций и изначальное генетическое разнообразие в популяции находится в равновесии между мутацией и генетическим дрейфом, а эффективный размер каждой популяции остается постоянным.
В качестве метода конструирования деревьев был выбран метод объединенных соседей (NJ, Nieghbor-joining), разработанный Сейто и Неем [76, 145]. Метод объединенных соседей относится к методам матриц расстояний и зависит от измерения генетического расстояния между изучаемыми популяциями. Данный метод не требует допущения гипотезы молекулярных часов и позволяет объединить разные скорости эволюции в разных линиях происхождения. Это особенно важно для локусов, находящихся под действием естественного отбора, к которым относится HLA. В результате получается неукорененное дерево.
Для графического представления распределения локусов HLA А и В в популяциях Челябинской области в сравнении с другими мировыми популяциями был проведен анализ соответствий (Сorrespondence Аnalysis) Он представляет собой разведочно-описательный метод, позволяющий визуально и численно исследовать структуру таблиц сопряженности большой размерности. Основная цель анализа соответствий состоит в том, чтобы перейти от исходной матрицы данных к новой, более простой матрице, потеряв при этом как можно меньше информации. Получаемые двумерные карты представляют собой наилучшую возможную аппроксимацию исходного расположения профилей точек. Мерой качества полученного решения выступает процент инерции, объясненной двумя осями. Эффективность анализа соответствий проявляется также в том, что данные о строках и столбцах матрицы накладываются на одну плоскость и могут интерпретироваться одинаковым способом [30]. После проведения анализа соответствий, популяции были разделены на группы. Для этого применялся наиболее популярный метод кластеризации – метод k-средних (k-means). Он разбивает множество элементов векторного пространства на заранее известное число кластеров k. Действие алгоритма таково, что он стремится минимизировать среднеквадратичное отклонение на точках каждого кластера. Основная идея заключается в том, что на каждой итерации перевычисляется центр масс для каждого кластера, полученного на предыдущем шаге, затем векторы разбиваются на кластеры вновь в соответствии с тем, какой из новых центров оказался ближе по выбранной метрике. Алгоритм завершается, когда на какой-то итерации не происходит изменения кластеров.
Анализ соответствий и кластеризацию производили при помощи статистической программы R пакета ade4 [175].
Башкиры ЧО. Распределение частот генов HLA-А и -В и их гаплотипов
Распределение генных частот и их стандартных ошибок в популяции башкир Челябинской области представлено в таблицах 1 и 2 (приложения 1 и 2). Для локуса HLA А в выборке башкир ЧО было обнаружено 14 аллельных семейств. При этом два из них (А 02 и А 24) относятся к часто встречающимся (gf 0,1) и их совместная генная частота составляет 0,5. С частотой менее 0,01 встречается только А 66. Остальные аллельные семейства локуса А (А 29, А 34, А 36, А 43, А 69, А 74, А 80) в данной выборке не представлены.
Локус HLA В в популяции башкир ЧО представлен 26 аллельными семействами, среди которых В 13 и В 51 встречаются с частотой более 0,1. К редко встречаются аллельным семействам (gf 0,01) относятся В 37, В 54, В 56, В 73. Не представлены следующие семейства: В 42, В 45, В 47, В 53, В 59, В 67, В 78, В 81, В 82, В 83.
Среди 133 представителей башкирской национальности было обнаружено 93 различных двухлокусных гаплотипа HLA A-B, из них 33 встречались с частотой hf 0,010 (таблица 3 в приложении 3). Наиболее распространенным гаплотипом в башкирской популяции является A 02-B 48, встречающийся с частотой hf=0,060. Помимо башкирской популяции данный гаплотип был обнаружен в татарской и нагайбакской популяциях, однако полностью отсутствовал среди русских. Второй и третий по частоте встречаемости гаплотипы – A 02-B 13 (hf=0,056) и A 02-B 40 (hf=0,053) – присутствуют во всех 4-х популяциях, но именно в башкирской популяции их частоты достигают наибольших значений. При этом один из частых гаплотипов (hf 0,010) башкирской популяции A 24 41 B 46 (hf=0,011) не был обнаружен ни в одной из оставшихся популяций Челябинской области.
Генные частоты и их стандартные ошибки в популяции нагайбаков Челябинской области приведены в таблицах 1 и 2 (приложения 1 и 2). В локусе HLA А представлено 14 аллельных семейств, наиболее часто встречающимися из которых (gf 0,100) являются А 02, А 24 и А 03. При этом все остальные представленные семейства встречаются с частотой от 0,010 до 0,100. К аллельным семействам отсутствующим в данной выборке относятся А 34, А 36, А 43, А 66, А 69, А 74 и А 80.
В локусе HLA В в популяции нагайбаков встречается 25 аллельных семейств, среди только для В 35 частота превышает 0,1. 5 аллельных семейств (В 38, В 52, В 54, В 56, В 58) имеют частоту менее 0,01. А такие семейства как В 42, В 47, В 55, В 59, В 67, В 73, В 78, В 81, В 82 и В 83 не встречаются вовсе.
Общее количество различных двухлокусных гаплотипов HLA A-B у 112 представителей нагайбакской популяции составило 82 (таблица 3 в приложении 3). При этом частота встречаемости 32-х из этих гаплотипов превышала 0,010. Наиболее распространенный среди нагайбаков HLA A-B гаплотип – A 03-B 35 (hf=0,058) встречается также в русской и татарской популяции Челябинской области (hf=0,049 и hf=0,046, соответственно), однако полностью отсутствует у башкир. Два других частых гаплотипа – A 02-B 44 (hf=0,049) и A 01-B 08 (hf=0,049) – характерны для всех 4-х исследованных популяций, а их наибольшие значения наблюдаются у русских.
Отличительной чертой нагайбаков от 3-х других популяций ЧО, является присутствие сразу шести уникальных гаплотипов с частотой hf 0,010: A 25-B 13 (hf=0,031), A 29-B 14 (hf=0,022), A 29-B 45
После определения гаметной фазы двухлокусных гаплотипов HLA A-B была определена стандартизованная степень неравновесного сцепления (D ). В таблицах 4-7 (приложения 4-7) показана степень неравновесного сцепления для всех теоретически возможных двухлокусных гаплотипов в популяциях русских, татар, башкир и нагайбаков, соответственно. Статистически значимые значения отмечены звездочкой. При этом наибольшие величины неравновесного сцепления между локусами А и В (D 0,50) в популяции русских ЧО наблюдаются для следующих гаплотипов: A 01-B 08 (D =0,83), A 01-B 37 (D =0,79), A 33-B 58 (D =0,75), A 24-B 48 (D =0,72), A 29-B 44 (D =0,72), A 66-B 41 (D =0,66), A 25-B 18 (D =0,57), A 30-B 13 (D =0,55). В популяции татар степень неравновесного сцепления двухлокусных гаплотипов HLA A-B приведена в таблице. Отмечено 7 гаплотипов, у которых D больше 0,5: A 01-B 08 (D =0,67), A 02-B 50 (D =0,83), A 02-B 46 (D =1), A 23-B 44 (D =0,58), A 25-В 18 (D =0,64), A 29-B 07 (D =1), A 30-B 73 (D =1). В башкирской популяции неравновесное сцепление между локусами HLA A и B представлены в таблице. Наибольшие значения D наблюдается в следующих случаях: A 01-B 08 (D =0,73), A 01-B 37 (D =1), A 03-B 38 (D =0,64), A 02-B 48 (D =0,64), A 11-B 52 (D =0,73), A 11-B 55 (D =0,73), A 25-B 56 (D =1), A 32-B 73 (D =1), A 33-B 14 (D =1), A 66-B 49 (D =1). В популяции нагайбаков гаплотипы HLA A-B с неравновесным сцеплением (D ) больше 0,5 следующие: A 01-B 08 (D =0,50), A 01-B 37 (D =0,63), A 02-B 41 (D =0,74), A 02-B 44 (D =0,73), A 23-B 49 (D =0,59), A 24-B 15 (D =0,70), A 24-B 39 (D =0,52), A 29-B 14 (D =1), A 29-B 45 (D =1), A 30-B 50 (D =0,79), A 31-B 52 (D =0,50). С целью визуализации информации, заключенной в генных частотах рассматриваемых популяций, на втором этапе нашего исследования проведен анализ генетического родства между популяциями Челябинской области и другими мировыми популяциями. 3.6. Генетические расстояния между популяциями ЧО и другими мировыми популяциями На основании частот локусов HLA A и B были рассчитаны генетические расстояния между исследованными популяциями Челябинской области и другими мировыми популяциями. Кроме исследуемых популяций Челябинской области (русские, татары, башкиры, нагайбаки) использовались данные о распределении генных частот в 22-х других мировых популяциях, приведенных в таблице 8: южные ирландцы, валлийцы, французы, бельгийцы, чехи, финны, немцы, южные саамы Швеции, поляки, чуваши, северные саамы Швеции, македонцы, хорваты, болгары, турки, уйгуры, тувинцы, монголы, китайцы, японцы, корейцы (37, 40, 41, 42, 46, 64, 72, 74, 77, 86, 106, 110, 118, 120, 123, 131, 136, 150, 171, 172, 173). Для удобства представления полученные значения генетических расстояний умножены на 100. Генетические расстояния по Нею для 4-х популяций Челябинской области по отношению к другим мировым популяциям приведены в таблице 8. Полная матрица генетических расстояний представлена в таблице 9 (приложение 8).
Корреляция между географическим и генетическим расстояниями
Общий коэффициент корреляции между двумя матрицами расстояний полученный в результате теста Мантеля проведенного в 999 повторах составила r=0,77 с уровнем значимости p=0,001.
На рисунке 4 в порядке возрастания представлены коэффициенты корреляции Спирмана между географическим и генетическим расстоянием для каждой из 26-ти рассматриваемых популяций. Звездочки обозначают степень достоверности полученного значения.
В ходе обсуждения полученные результаты о распределении генов и гаплотипов HLA в 4-х популяциях Челябинской области сопоставлены с частотами для других мировых популяций. Далее рассмотрены генетические расстояния по отношению к другим мировым популяциям и дерево объединенных соседей, построенное на основе этих расстояний. Кроме того, проведен анализ взаимного расположения популяций на графике анализа соответствий. Наконец, рассмотрена корреляция между генетическим и географическим расстояниями для популяций Челябинской области в сравнении с показателями для мировых популяций.
Русские ЧО. Распределение генов и гаплотипов HLA. В популяции русских Челябинской области распределение аллельных групп в локусе A является характерным для типичных центрально- и западноевропейских популяций. Так наиболее распространенной аллельной группой стала A 02 (gf=0,319), за ней следуют A 01 (gf=0,148) и A 03 (gf=0,158). Присутствие аллельного варианта А 23, одного из сплитов А9, с частотой 0,023 также отражает близость с европеоидами, поскольку в азиатских популяциях он практически не встречающегося. Интересно, что для подавляющего большинства как европейских, так и азиатских популяций характерно преобладание А 26 над А 25, однако если в Европе эти значения сопоставимы, то в Азии А 26 встречается в несколько раз чаще, чем А 25. У русских ЧО наблюдается обратная ситуация и А 25 (gf=0,046) встречается в полтора раза чаще А 26 (gf=0,033), что достаточно редко наблюдается среди мировых популяций. Данная особенность характерна и для других славянских популяций, так как отмечена не только у других популяций русских из Москвы, Самары и Санкт-Петербурга [82, 167] и у западных славян – поляков и чехов [131, 173]. Кроме того, эта черта присутствует у некоторых других народов Российской Федерации, таких как поморы [74], чуваши [42] и нагайбаки. Распределение частот остальных аллельных семейств локуса HLA A также типично для европеоидов.
В локусе HLA B генные частоты с небольшими отклонениями соответствуют среднеевропейским. При этом в ряде случаев значения оказываются ближе к показателям для Западной, а не для Восточной Европы. Так, например, частота B 15 (gf=0,083) значительно превышает соответствующие частоты для других славянских восточноевропейских популяций [36, 131, 173] и чаще встречается в западноевропейских популяциях [37, 46, 64, 71]. С другой стороны, подобная частота B 15 типична для азиатских популяций, но, следует отметить, что в других, a priori «более монголоидных» популяциях ЧО, частоты B 15 существенно ниже по сравнению с русскими. Маловероятно, что повышение частоты данной аллельной группы в русской популяции свидетельствует о смешении с монголоидами. Скорее это может указывать на присутствие финно-угорской компоненты, поскольку у финно-угорских народов наблюдаются высокие ( 0,1) частоты B 15 [74, 90, 107,148].
Другая аллельная группа, не вписывающаяся в градиент частот между Европой и Азией – B 07. Е частота в западной Европе колеблется в пределах 0,070-0,248 [36, 131, 173], в то время как в Восточной снижается и варьирует от 0,024 до 0,080 [37, 46, 64, 71]. У русских ЧО данный показатель снова увеличивается и составляет 0,151, снижаясь затем у восточноазиатских народов [110, 118, 136, 172], где его частота не превышает 0,100. В то же время рекордных мировых значений (gf=0,35) B 07 достигает в Индии [166]. В России, в отличие от Западной Европы, В 07 входит в состав наиболее часто встречающегося двухлокусного гаплотипа: А 03-В 07 (hf=0,061; D =0,29). Самый распространенный западноевропейский гаплотип A 01-В 08 оказался в русской популяции только на третьем месте (hf=0,052), однако именно для него характерен наибольший показатель неравновесного сцепления (D =0,83). Что касается остальных частых гаплотипов, то они встречаются практически в любой европейской популяции.
Таким образом, русские ЧО представляют собой типично европейскую популяцию, в которой не наблюдается достоверной монголоидной примеси. Данный факт подтверждает данные антропологии, согласно которым средние антропологические показатели русских или совпадают со средними западноевропейскими величинами, или отклоняются от них, оставаясь, однако, в пределах колебаний западных групп. Так было установлено, что для русского населения характерна крайне редкая встречаемость эпикантуса (12 случаев среди 8,5 тысяч обследованных) [6], что сопоставимо со значениями, наблюдаемыми в Германии [29]. С появлением современных технологий исследования генома эти данные нашли свое подтверждение и на генетическом уровне [1]. На основе данных мтДНК, с одной стороны, была показана высокая гетерогенность русской популяции, однако с другой стороны, «усредненный» русский генофонд находился в непосредственной близости от стран Центральной Европы (Германия, Австрия, Польша). Исследования профиля HLA в разных городах России, проведенные еще серологическим методом [52], также указывают на неоднородность русской популяции, но, как и в случае мтДНК, в целом полученные значения соответствуют показателям для Европейских популяций.
Татары ЧО. Распределение генов и гаплотипов HLA. Распределение генов HLA А и В у татар во многом сходно с русской популяцией, и, следовательно, европеоидами, однако наблюдается небольшое, но явное монголоидное влияние.
Наиболее распространенными генами в локусе А являются типичные для европеоидов А 01 (gf=0,127), А 02 (gf=0,26) и А 03 (gf=0,156). Еще одним частым вариантом является А 24 (gf=0,107), частота которого в Европе повышается в направлении с северо-запада на юго-восток, наибольших значений достигая в Азии. В целом показатели для локуса А находятся в пределах колебаний европейских частот. В локусе В различия с западноевропейскими популяциями более выражены, хотя колебания для каждой отдельной аллельной группы незначительны. Так наблюдается небольшое понижение частот В 07 (gf=0,107) и В 08 (gf=0,045) по сравнению с западноевропейскими популяциями [37, 46, 64, 71], однако их значения остаются выше, чем в странах Юго-Восточной Европы [40, 41, 106] и Азии [110, 118, 136, 172]. Татарскую популяцию, как и другие популяции ЧО, отличает достаточно высокая частота В 13 (gf=0,107) не встречающаяся у европеоидов, и не характерная для монголоидов. В большинстве случаев данный вариант встречается в составе гаплотипа А 02-В 13 (hf=0,039) без достоверного неравновесного сцепления. Еще одной особенностью является повышенная частота В 35 (gf=0,120) и соответствующего ему гаплотипа А 03-В 35 (hf=0,045; D =0,26), который наряду с А 03-В 07 (hf=0,045; D =0,32) является самым распространенным в татарской популяции. Подобная частота В 35 не характерна ни для азиатских, ни для западноевропейских популяций, однако близка к значениям для популяций юго-востока Европы [40, 41, 86, 106]. Небольшие показатели для В 44, также сближают татар с этими популяциями.
Основным показателем монголоидного вклада в этногенез татар служит В 46, обнаруженный в татарской популяции. Данный вариант встречается в популяции только в составе гаплотипа А 02-В 46 (hf=0,009; D =1), который, вероятно, является наиболее распространенным гаплотипом на Земле [82]. Сильное неравновесное сцепление говорит об относительно недавнем появлении В 46 в татарской популяции и свидетельствует о присутствии на одном из этапов становления татарского этноса монголоидных популяций. В то же время, небольшие частоты данного гена, а также совокупные частоты других аллельных семейств локусов HLA А и В указывают на то, что монголоидное участие было незначительным.
