Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Полиморфизм иммунокомпетентных генов хозяина как фактор риска развития различных клинических форм туберкулеза легких 11
1.2. Участие полиморфизмов генов системы HLA и их продуктов в развитии клинически активных форм туберкулеза легких 13
1.3. Роль факторов врожденного иммунного ответа в развитии туберкулеза 15
1.3.1.TLR (Toll-like receptor) 15
1.4. Участие полиморфизмов генов цитокинов и их продуктов в развитии клинических форм туберкулеза легких 18
1.4.1. IL1 19
1.4.2. IL10 21
1.4.3. TNF 22
Глава 2. Материалы и методы 26
2.1. Обследуемые лица 26
2.2. Статистическая обработка результатов 30
Глава 3. Результаты собственных исследований 34
3.1.Ассоциация полиморфизмов генов HLA с развитием активного туберкулеза легких и его фенотипов 34
3.2.Ассоциация полиморфизмов генов цитокинов IL1RА, IL1, IL10, TNFА и рецепторов врожденного иммунитета TLR4, TLR2 с развитием активного туберкулеза легких и его фенотипов 41
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 53
Заключение 64
Выводы 65
Список сокращений и условных обозначений 65
Список используемой литературы 68
Приложение 86
- Участие полиморфизмов генов системы HLA и их продуктов в развитии клинически активных форм туберкулеза легких
- Участие полиморфизмов генов цитокинов и их продуктов в развитии клинических форм туберкулеза легких
- Статистическая обработка результатов
- Ассоциация полиморфизмов генов цитокинов IL1RА, IL1, IL10, TNFА и рецепторов врожденного иммунитета TLR4, TLR2 с развитием активного туберкулеза легких и его фенотипов
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Туберкулез (ТБ) является одной из постоянных глобальных проблем здоровья населения планеты. Несмотря на широкомасштабную вакцинацию, использование современных лекарственных препаратов и осуществление национальных и межнациональных программ контроля за туберкулезом (Borgdorff MW. et al. The re-emergence of tuberculosis: what have we learnt from molecular epidemiology? European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 2013. Vol. 19, Is. 10. P. 889-901) ежегодно в мире регистрируется 10 млн. новых случаев первичного туберкулеза и около 1,7 млн. смертей в год (Walzl G. et al. Immunological Biomarkers of tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 2011. Vol. 11, Is.5. P. 43-54). Более того, по данным статистических исследований, 1/3 населения Земли инфицирована M.tuberculosis, но только 10% от всех инфицированных демонстрируют прогрессию к активным формам туберкулеза (Schuijt TJ. et al. The intestinal microbiota and host immune interactions in the critically ill. Trends in Microbiology. 2013. Vol. 21, Is.5. P.221-9, Walzl G. et al. Immunological Biomarkers of tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 2011. Vol. 11, Is.5. P. 43-54, Vannberg FO. et al. Human genetic susceptibility to intracellular pathogens. Immunological Reviews. 2011. Vol. 240, Is. 1. P. 105-16).
Представленные статистические данные порождают предположения о причинах и механизмах разнообразия в реализации ответа хозяина на возбудитель туберкулеза: 1) протективный иммунный ответ против M. tuberculosis с элиминацией возбудителя; 2) персистенция возбудителя на фоне клинического здоровья в течение нескольких лет (и даже в течение жизни); 3) конверсия асимптоматической инфекции в высоко контагиозную, клинически активную и потенциально смертельную форму заболевания (реактивацию) (Monack DM. Persistent bacterial infections: the interface of the pathogen and the host immune system. Nature Reviews Microbiology. 2004. Vol. 2, Is. 9- P. 747-65).
Характерной чертой персистентных инфекций, обусловленных
высокоадаптированными к человеку возбудителями (в частности МБТ), является состояние динамического баланса между партнерами - возбудителем и «хозяином», изменения в котором могут потенциально обладать риском манифестации активного туберкулеза и трансмиссии возбудителя (Blaser MJ. et al. The equilibria that allow bacterial persistence in human hosts. Nature. 2007. Vol. 449. P. 843-9).
В свете сказанного, важным направлением исследований является поиск информативных биомаркеров персистентной инфекции и маркеров прогрессии заболевания к клинической форме, т.е. маркеров доклинического прогнозирования заболевания, использование которых позволит своевременно осуществлять профилактические эпидемиологические мероприятия.
В настоящее время широкие возможности для изучения гомеостаза человека в норме и при патологии представляют современные технологии, особенно в области геномики. Изучение генома человека складывается из 2 основных направлений, каждое из которых имеет положительные стороны и, в тоже время, для каждого существует множество требований и ограничений.
1. Оценка транскриптомной активности широко используется при изучении
патогенеза заболеваний, в том числе инфекционной этиологии, и для идентификации биомаркеров конкретных состояний организма человека или динамических процессов. Однако, активность транскриптома во многом зависит от
окружающих факторов, от изменений, не имеющих отношения к изучаемой патологии, и может описываться профилями транскрипции генов, общими для многих заболеваний (Chaussabel D. et al. Assessing the human immune system through blood transcriptomics. BMC Biology. 2010. Vol. 8, Is. 84. P. 1-14).
2. Изучение структуры генома – идентификация общих полиморфизмов или
редких мутаций, ассоциированных с заболеваниями. Параметры, измеряемые
этими исследованиями, в частности частоты распределения полиморфных генов,
генотипов, гаплотипов генов иммунного ответа, детерминируются наследованием
и не изменяются в течение жизни, поэтому могут выступать в качестве маркеров
потенциального риска развития заболевания и конкретных клинических фенотипов
с учетом этногеографических характеристик. Ассоциации между общими
вариантами генов, входящими и не входящими в ГКГС, и чувствительностью к
ряду инфекционных заболеваний установлены (Vannberg FO. et al. Human genetic
susceptibility to intracellular pathogens. Immunological Reviews. 2011. Vol. 240, Is. 1.
P. 105-16). Дальнейшие исследования по изучению полиморфизма генов региона
HLA и других, участвующих в развитии воспалительных ответов, позволят
выделить прогностические маркеры конверсии асимптоматической инфекции в
клинически активную форму туберкулеза; на их основе сформировать группы
потенциального риска и определить подходы к персонализированной
профилактике и терапии с использованием новых биотехнологий; выделить мишени для трансформации воспалительно-иммунных ответов хозяина на МБТ: от гиперпродуктивных к толерогенным, что даст возможность снизить деструкцию пораженного органа.
Цель исследования
Оценить особенности распределения вариантов и комбинаций генов, продукты которых участвуют в реализации иммунного ответа хозяина на встречу с возбудителем туберкулеза в русской популяции Челябинской области, у больных и здоровых лиц, с целью выделения маркеров потенциального риска развития активного туберкулеза легких и его клинических фенотипов.
Задачи исследования
-
Провести анализ связи аллелей и гаплотипов генов системы HLA с развитием клинически активного туберкулеза легких.
-
Определить варианты генов системы HLA и их гаплотипов, ассоциированные с клиническими фенотипами туберкулеза легких.
-
Оценить ассоциацию генов TLR2 и TLR4 и цитокинов IL1, IL1RA, IL10, TNFA, а также их генотипов и гаплотипов с клинически активным туберкулезом легких и его клиническими формами.
-
Установить распределение гаплотипов генов HLADRB1-TNFA(-308) у больных с активным туберкулезом и в контрольной группе.
-
Установить паттерны генов, включающие совокупность генов и их комбинаций системы HLA, цитокинов и TLR, соответствующие разным клиническим фенотипам.
Методология и методы исследования
Данное исследование проведено в рамках научной проблемы «Популяционная иммуногенетика», раздел «Гены иммунного ответа и болезни». При выполнении экспериментальной части мы использовали традиционный подход к изучению иммуногенетики инфекционных заболеваний:
1. Оценили частоты распределения аллелей, генотипов и гаплотипов генов,
продукты которых участвуют
1.1. в развитии воспаления:
–TLR – узнают микроорганизмы, их PAMPs (паттерны патоген-ассоциированных
молекул), и вызывают ответ на них клеток воспаления,
– цитокины - организаторы межклеточных взаимодействий, регуляторы иммунного
ответа;
1.2. в презентации микробных антигенов - молекулы HLA I и II классов АПК
(антиген представляющих клеток).
Гены перечисленных компонентов иммунной системы обладают высокой полиморфностью, особенно система HLA, и для них характерны как межиндивидуальные, так и популяционно-географические различия в частотах аллелей, генотипов и гаплотипов (Селицкая Р.П. О полиморфизме DRB1-локуса системы HLA и восприимчивости к туберкулезу. Иммунология. 2009. № 6. С. 338-341). Учитывая данный факт, мы провели исследование на уровне:
- внутрипопуляционной биологической гетерогенности. Для выделения
иммуногенетических маркеров потенциального риска развития активного
туберкулеза и его клинических форм проводили сравнительный анализ
распределения генов и их комбинаций между здоровыми лицами и больными
активными формами ТБ с использованием подхода случай-контроль.
- популяции – изучали популяцию русских, проживающих в Челябинске и
Челябинской области и имеющих наибольшее представительство среди других
народов на этой территории (84%) (Итоги Всероссийской переписи населения
[электронный ресурс]. Москва, 2010. Режим доступа: ).
Методы исследования В работе применен комплекс современных молекулярно-генетических методов исследования: ПДРФ-анализ (анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов) и аллель-специфическая ПЦР (полимеразно-цепная реакция).
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Для оценки статистической значимости рассчитывали показатели
непараметрической статистики: критерий Пирсона, критерий Пирсона с поправкой Йейтса для значений более, либо равных 5 и менее 10, точный критерий Фишера для значений менее 5 с применением пакета прикладных программ «Statistica 8.0». Для попарного сравнения трех групп больных использовали поправку Бонферрони (pc). Поправку на количество аллелей не применяли. Различающие возможности методов оценивали по критерию отношения шансов (OR) и их доверительным интервалам (CI) с помощью программы Ms Excel пакета Ms Office 2010. Для расчета величины неравновесного сцепления и частот гаплотипов методом максимального правдоподобия использовали программу Arlequin 3.5. Для графического представления распределения генотипов генов воспалительного ответа и пола больных относительно клинических фенотипов туберкулеза легких был использован метод канонического анализа соответствий (CCA – Canonical Correspondence Analysis) с помощью программного пакета PAST 2.17с.
Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на конференции зональной лаборатории иммунологического типирования тканей «Фундаментальное и прикладное значение оценки генов иммунного ответа» (г. Челябинск, 2008), Международной конференции «Физиология и патология
иммунной системы» (г. Москва, 2008), Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2009), IX конференции Иммунологов Урала (г. Челябинск, 2011), X конференции Иммунологов Урала (г. Тюмень, 2012), научно-практической конференции, посвященной 15-летию биологического факультета ФГБОУ ВПО «ЧелГУ» (г. Челябинск, 2013).
Основные цели, задачи, положения, выносимые на защиту, и выводы
сформулированы автором совместно с руководителем Бурмистровой А.Л.
Разработка дизайна исследования, научно-информационный поиск, анализ и
обобщение данных специальной литературы, определение необходимых
методологических подходов исследования, выполнение большей части
лабораторных исследований, математическая обработка полученных результатов
выполнены лично автором. Набор материала для исследования проводился на базе
ГБУЗ «Челябинский областной клинический противотуберкулезный диспансер»
под руководством заведующей 3-его стационарного фтизиатрического отделения
Ананьевой И.П. Обследование контрольной группы осуществлялось совместно с
коллективом отделения молекулярно-биологической диагностики ОГУП
«Челябинская областная станция переливания крови» (М.С. Чернова, М.Н. Вавилов, Д.С. Сташкевич, Е.О. Кошель) под руководством заведующей Сусловой Т.А.
Положения, выносимые на защиту
-
В качестве этногеографических маркеров потенциального риска развития активных форм туберкулеза у русских Челябинской области могут использоваться комбинации генов (в терминах изменения аллельных частот) системы HLA: A*02, A*24, DRB1*16, и гаплотипов A*24-DRB1*16, DRB1*16-DQA1*01:02-DQB1*05:02.
-
Гены DRB1*16 и DRB1*03, находящиеся в неравновесном сцеплении с аллелем TNFА(-308)*А, и расширенный анцестральный европеоидный гаплотип AH 8.1., в состав которого входит высокопродуктивный аллель TNFА(-308)*А, могут рассматриваться у русских Челябинской области в качестве маркеров потенциального риска развития активного туберкулеза легких и его тяжелых клинических форм (фиброзно-кавернозный, инфильтративный в фазе распада, экссудативный плеврит).
-
Варианты клинических фенотипов туберкулеза ассоциированы у русских Челябинской области с определенной совокупностью комбинаций генов, генотипов и гаплотипов системы HLA, цитокинов, и, в меньшей степени, TLR, что позволяет установить паттерны генов иммунно-воспалительного ответа хозяина, реализованного в конкретных клинических фенотипах с различным потенциалом поражения легких: фиброзно-кавернозном, инфильтративном и очаговом, которые можно использовать в качестве прогностических маркеров предрасположенности индивидуума к развитию тяжелой прогрессирующей или легкой формы заболевания.
Научная новизна
Впервые проведен анализ частот распределения генов системы HLA и их
сочетаний у больных активным туберкулезом легких русских Челябинской области
и установлено, что комбинации генов системы HLA - А*02, A*24, DRB1*16, и
гаплотипов A*24-DRB1*16, DRB1*16-DQA1*01:02-DQB1*05:02, можно
использовать в качестве этногеографических маркеров потенциального риска развития активной формы заболевания.
Впервые показано, что гаплотипы генов системы HLA, в составе которых присутствует высокопродуктивный аллель TNFА(-308)*А: HLADRB1*16-TNFА(-308)*А, HLADRB1*03-TNFА(-308)*А и анцестральный европеоидный AH 8.1., могут рассматриваться у русских Челябинской области в качестве маркеров потенциального риска развития активного туберкулеза и его тяжелых клинических форм: фиброзно-кавернозной, инфильтративной в фазе распада и экссудативного плеврита.
Впервые установлены особенности распределения у больных туберкулезом русских Челябинской области генов и их комбинаций: системы HLA, цитокинов и TLR, что позволило описать паттерны генов иммунно-воспалительного ответа хозяина, реализованного в конкретных клинических формах: фиброзно-кавернозной, инфильтративной и очаговой, и предложить их в качестве маркеров прогноза предрасположенности к тяжелому прогрессирующему или легкому течению заболевания, которые могут быть использованы при разработке новых направлений в создании основ персонализированной профилактики и лечения.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные данные могут быть использованы в научных исследованиях по направлениям биологии и медицины: «Молекулярная медицина», «HLA и болезни», «Инфекционные болезни». На основе полученных данных можно оценить индивидуальный риск развития активного туберкулеза легких и осуществить прогнозирование тяжести течения заболевания, что позволит разработать новые подходы к персонализированной профилактике и лечению.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты работы внедрены в учебный процесс: используются при преподавании отдельных тем курса иммунологии на биологическом факультете ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет». Полученные данные о распределении аллелей и гаплотипов HLA в контрольной группе русских Челябинской области внесены в международную базу данных Allele Frequency Net Database (AFND).
Публикации
Автор имеет 28 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 14 работ общим объемом 1,9 печатных листа, в том числе 9 работ в научных журналах, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций (3 статьи) и 4 работы в научных журналах, входящих в базу РИНЦ. Соискателем опубликовано 7 работ в материалах конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 104 страницах компьютерного текста, проиллюстрирована 18 таблицами, 3 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием клинического материала и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 156 источников, в том числе 28 отечественных и 127 зарубежных.
Участие полиморфизмов генов системы HLA и их продуктов в развитии клинически активных форм туберкулеза легких
Широкомасштабные геном-ассоциированные исследования, продемонстрировали наличие высокой, даже доминирующей роли (в некоторых случаях) вариантов генов и гаплотипов системы HLA в прогрессии ряда таких инфекционных заболеваний, как ВИЧ-инфекция, лепра, гепатит В и незначительной в отношении гепатита С, малярии, туберкулеза [144]. Комплекс генов HLA расположен на коротком плече 6-й аутосомной хромосомы и содержит более 220 генов [122]. Со времени открытия системы гистосовместимости распределение генов HLA у больных ТБ исследовалось в различных популяциях. Несмотря на масштабность проведенных исследований, высокую полиморфность системы HLA, у представителей многих национальностей выявлено повышение частоты HLA-DR2 -серологической специфичности у больных туберкулезом, в которую входят гены HLADRB1 15 и 16 [21, 91].
Но изучение проблемы ассоциации генов HLA с чувствительностью к активным формам туберкулеза не ограничивается только поиском генетических маркеров. Одним из основных и, по-видимому, чрезвычайно перспективных ее аспектов является установление механизмов, лежащих в этих основе ассоциаций [20]. Существует ряд предположений о связи конкретных HLA - специфичностей с развитием предрасположенности к клиническим формам ТБ. Во-первых, полиморфизм системы HLA влияет на экспрессию HLA на клетках, что отражается на качестве презентации микобактериальных антигенов [48]. Во-вторых, определенные полиморфные варианты HLA вызывают супрессию иммунного ответа на микобактерии, стимулируя формирование Th2-типа иммунного ответа [75], что приводит к гиперфункции гуморального звена иммунитета, преобладание активности механизмов которого при туберкулезе, можно рассматривать как один из прогностически неблагоприятных факторов иммунопатогенеза основного заболевания [13].
Известны исследования, указывающие на ассоциацию полиморфизмов HLA с силой связывания антигенного пептида: связывание микобактериального пептида зависит от строения 57 цепи Р9-связывающего кармана. В своих исследованиях Delgado et al. установили ассоциацию легочного туберкулеза с HLA DQB1 05:03 в Камбоджи и выяснили, что этот ген кодирует аспарагиновую кислоту в HLA-DQ 57 вместо аланина. Презентация ESAT46-6o (основного антигена МБТ) HLA-DQ с 57-Asp по сравнению с HLA-DQ с 57-Ala способствует значительно меньшей секреции IFNy CD4+ Т-клетками и существенному различию в эффекторном ответе Т-клетки [56]. Эти результаты объясняют функциональные различия в ассоциации с генетическими данными, показывая, что личности, гомозиготные по HLA-DQ 57-Asp, более восприимчивы к прогрессированию легочного туберкулеза.
Следующим механизмом ассоциации полиморфизма HLA с развитием клинически активного туберкулеза легких является взаимосвязь полиморфизмов генов HLAII и секреции цитокинов. У больных туберкулезом легких с DRB1 12 геном повышена продукция IL10 и снижена продукция IFNy [59], - с DRB1 03 - повышена продукция IFNy, - с DRB1 10 - повышена продукция IL12p40, - с DRB1 04 - повышена продукция IL6 [135].
Особый интерес представляет накопление данных об эффективном использовании терапии с учетом индивидуальных полиморфных сайтов генов HLA у больного. Для носителей маркерных специфичностей (DRB1 16, DRB1 12), на основании анализа снижения уровня IFN и дисбаланса параметров бактерицидности нейтрофилов, считают целесообразным включение в комплексную терапию при ТБ селективных иммуномодуляторов [14]. Результаты такого рода разработок многообещающи в плане использования генотипирования по системе HLA с целью индивидуального подбора адекватной терапии для больных клинически активным туберкулезом.
Большинство эпидемиологических данных поддерживают роль врожденного иммунного ответа в развитии туберкулеза [145], т.к. адекватное сетевое взаимодействие его факторов в большинстве случаев приводит к элиминации патогена. Однако гиперактивация или угнетение механизмов врожденного иммунитета может вызвать развитие патологического процесса [7]. Если действие адаптивного иммунного ответа основано на распознавании индивидуальных антигенов (и в этом ведущая роль принадлежит HLA), то формирование врожденного иммунного ответа основано на распознавании образов патогенности - консервативных в эволюционном отношении молекул, присущих одновременно большим систематическим группам микроорганизмов [26]. Взаимодействия между Toll-подобными рецепторами и другими рецепторами, распознающими образы патогенности на МБТ, такими как маннозный рецептор, DC-SIGN и NOD, может привести к нескольким возможным биологическим результатам, включая секрецию цитокинов, модуляцию адаптивного иммунного ответа, быструю клеточную дифференцировку, апоптоз и прямую антимикробную активность [86, 98].
Участие полиморфизмов генов цитокинов и их продуктов в развитии клинических форм туберкулеза легких
Цитокины играют ключевую роль в защите против МБТ [115]. Макрофаги инициируют фагоцитоз МБТ и регулируют иммунные реакции опосредовано через провоспалительные цитокины, такие как TNF. Эффекторные Т-лимфоциты и ЕК секретируют IFN , который активирует альвеолярные макрофаги и повышает продукцию ими реактивных соединений азота и кислорода [90]. IL12 секретируется главным образом макрофагами и дендритными клетками, играет ключевую роль в иммунной реакции на МБТ, объединяя врожденный и адаптивный иммунитет. Кроме того, IL12 индуцирует Т-клетки и ЕК для продукции провоспалительных цитокинов, таких как IFN и TNF, а также регулирует выработку IL17 [80]. Синергическое действие IFN, IL12, TNF и IL17 активирует макрофаги и усиливает внутриклеточный киллинг патогенов, действуя в качестве основных эффекторных механизмов клеточного иммунного ответа [127], однако, уровни продукции определенных цитокинов, таких как TNF, способны модифицировать антибактериальный эффект и создавать неадекватный разрушительный для тканей хозяина ответ [145].
Среди цитокинов, играющих важную роль в координации иммунологических реакций при туберкулезе значительное место отводится IL1, который является главным медиатором LPS-индуцированного воспаления в легких [11]. Недостаточная продукция цитокина ведет к снижению эффективности иммунного ответа на микобактерии [12]. Гиперпродукция IL1 вызывает избыточное воспаление и, как результат, повреждение тканей [92]. Существуют различия в продукции IL1 в группах с разными клиническими фенотипами заболевания [25].
Семейство IL1 включает два агониста - IL1a и IL1 и их специфический антагонист IL1RА [12]. Гены, кодирующие IL1a, IL1 и IL1RА, картированы на длинном плече хромосомы 2 в области q14. IL1a и IL1 кодируются разными генами, но имеют гомологию в аминокислотной последовательности 26 % и обладают практически одинаковой биологической активностью [11]. IL1Rа, кодируемый геном IL1RА, является эндогенным ингибитором IL1 [34.].
В промоторном регионе гена IL1 показаны точечные замены в позициях -35 и -511. В кодирующей части гена описан полиморфизм в пятом экзоне в позиции +3953 [16]. У лиц, гомо- или гетерозиготных по высокопродуцирующему аллелю IL1(+3953) T, продуцируется, соответственно, в 4 и 2 раза большее количество этого цитокина, чем у лиц, гомозиготных по немутантному варианту этого гена (+3953 С) [10].
В гене IL1RA известен минисателлитный полиморфизм -вариабельность по числу 86-членных тандемных повторов (VNTR) во 2-м интроне, для которого известно существование пяти аллелей [49]. Согласно данным популяционных исследований, вариант IL1RA 2R чаще встречается в ассоциации с нормальным вариантом гена IL1(+3953) (IL1(+3953) C) и редко присутствует совместно с высокопродуцирующим вариантом - IL1(+3953) T. Феномен такого наследования объясняется тем, что эти варианты генов, расположенных близко друг к другу, наследуются, как правило, совместно [10]. Чаще всего встречается аллель IL1RА 2R (21% населения), носительство которого связано с повышенной секрецией IL1RA во время воспаления [150] и IL1RА 4R (74% населения), на остальные приходится только 5% случаев [39]. Широкая распространенность аллеля 2R гена IL1RA среди популяций позволяет гетерозиготам 4R/2R быть наиболее устойчивыми к туберкулезу легких. Гомозиготы 2R/2R намного чаще подвергаются различным инфекционным и воспалительным заболеваниям [81].
Анализ полиморфизма кластера генов IL1 (IL1B, IL1RN) показал противоречивые результаты. У африканцев развитие клинически активного туберкулеза ассоциировано с аллелем IL1RА 2R [37], у башкир с генотипом IL1RА 4R/4R [11], у русских с IL1RА 2R и IL1(+3953) С/T [23]. В других исследованиях не было найдено различий в частотах генотипов IL1RN и ILl между выборками больных легочным туберкулезом и группой сравнения [102, 150]. Фрейдин М.Б. и соавт. обнаружили ассоциацию IL1RА 2R/IL1P(+3953) Т гаплотипа с низкой экспрессией IL1RА и повышенным уровнем ILip, что проявляется в провоспалительном фенотипе и сильной реакцией Манту [23]. Несмотря на то, что механизм подобной ассоциации остается малоизученным, генотипирование IL1 может иметь диагностическое и прогностическое значение при целом ряде заболеваний.
IL10 является противовоспалительным цитокином, который предотвращает альтерацию тканей при избыточном воспалении в ответ на МБТ [119], подавляя производство IFN, секрецию TNFA и оксида азота [140]. Гиперпродукция IL10 детерминирует гуморальный иммунный ответ, малоэффективный в отношении МБТ [59], блокирует созревание фагосом в макрофагах[111] и препятствует формированию гранулемы, тем самым способствует диссеминации туберкулезной инфекции[18].
Различия в продукции IL10 при туберкулезе связаны с полиморфностью гена IL10. Ген IL10 локализован на первой хромосоме в участке 1q31-32 [47], содержащем 5 экзонов [142]. В результате секвенирования были выявлены полиморфные участки промотора этого гена, в том числе IL10G и IL10R из 5 -фланкирующего региона, различающиеся количеством СА-повторов [63, 64, 65]. Установлены варианты точечных замен в 5J-фланкирующем регионе гена IL10: А-3533Т, А-2769G, A-2739G, A-2013G, A-1349G, С-1255Т, A-815G, A-657G [54]. Среди восьми новых аллельных вариантов гена аллели -2769G и -1255Т очень редки. В 1997 году описаны шесть полиморфизмов гена IL10 в позициях -819, - 592, -652, -127, -41 относительно транскрипционного сайта [142]. Показаны аллельные варианты в позиции Т-854С и С-627А, а также полное сцепление аллелей -854Т и -627А.
Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку результатов исследований проводили на персональном компьютере с применением пакета прикладных программ «Statistica 8.0 for Windows», в котором использовали модули: «непараметрические критерии» (критерий Пирсона, критерий Пирсона с поправкой Йейтса, точный двусторонний критерий Фишера), программы Ms Excel пакета Ms Office 2010 для расчета критериев отношения шансов, относительного риска и поправки Бонферрони[8], компьютерной программы Arlequin 3.5. для расчета частот гаплотипов и неравновесного сцепления (D ) методом максимального правдоподобия, программного пакета PAST 2.17с для многомерной ординации SNP полиморфизмов методом канонического анализа соответствий (ССА).
Прежде чем анализировать вклад генов HLA, IL1RА, ILi, IL10, TNFА и TLR2 и TLR4 в предрасположенность и клинические варианты туберкулеза проверяли соответствие частот их генотипов в каждой группе равновесию Харди-Вайнберга с помощью процедуры «сравнение наблюдаемых и ожидаемых частот» для расчета критерия 2 и уровня значимости (р): модуль «непараметрическая статистика», раздел «наблюдаемые частоты в сравнении с ожидаемыми». При р 0,05 нулевая гипотеза о совпадении наблюдаемой и ожидаемой частот не отклоняется, а при р 0,05 - нулевая гипотеза отклоняется и принимается альтернативная гипотеза о различии в частотах. Достоверность различий в частотах аллельных вариантов и генотипов оценивалась с помощью критерия Пирсона (2), точного двухстороннего критерия Фишера для одной степени свободы. Для попарного сравнения трех групп больных использовали поправку Бонферрони (pc) [8]. Поправку на количество аллелей не применяли.
Расчет частот гаплотипов (HF) и величины неравновесного сцепления (linkage disequilibrium, D , отражает превышение или дефицит гаплотипа в популяции по сравнению с произведением частот двух генов) проводился методом максимального правдоподобия с помощью компьютерной программы Arlequin 3.5 [66].
Многомерная ординация SNP полиморфизмов у больных с разными клиническими фенотипами туберкулеза легких выполнена методом канонического анализа соответствий (CCA – Canonical Correspondence Analysis) с помощью программного пакета PAST 2.17с. Анализ соответствий - это разведочно-описательный метод анализа, позволяющий представить на одном графике объекты и переменные и визуализировать структуру таблиц. Принципиально значимыми являются возможность наложения на одну плоскость показателей таблиц и интерпретация их одинаковым способом. В ходе исследования получаются двумерные карты, с помощью которых можно провести аппроксимирование исходного расположения совокупности точек [27]. Глава 3. Результаты собственных исследований
Данная часть исследования посвящена оценке вариантов генов и гаплотипов генов системы HLA I и II классов, способных внести вклад в реализацию ответа хозяина на возбудитель M.tuberculosis. Исследование ассоциации полиморфизма генов HLA велось по следующему плану: 1. Проверка частот генотипов на соответствие равновесию Харди-Вайнберга. 2. Анализ распределения частот вариантов генов и гаплотипов системы HLA I и II класса в группах больных туберкулезом и практически здоровых лиц русской популяции Челябинской области. 3. Анализ распределения вариантов генов и гаплотипов системы HLA в группах больных с различными клиническими фенотипами туберкулеза легких. Тестирование на соответствие наблюдаемых частот генов в группе больных туберкулезом равновесию Харди-Вайнберга показало соответствие частоты генов исследуемых генов равновесию Харди-Вайнберга. Распределение генов HLA в группе больных туберкулезом легких На 1 этапе мы предприняли поиск генов HLA I и HLA II классов, которые могли бы использоваться в качестве маркеров потенциального риска развития активных форм туберкулеза легких. С этой целью мы оценили частотные распределения выриантов генов HLA A, B, DRB1, DQA1, DQB1 у больных туберкулезом легких и условно здоровых лиц. При проведении сравнительного анализа распределения полиморфизмов генов HLA обнаружены различия в распределении генов HLA А 24, A 02, DRB1 16. Частотные распределения вариантов генов HLAA, B, DRB1 у больных туберкулезом и в группе контроля представлены в таблице 4 и таблице 12 (приложение 1). Таблица 4 - Распределение частот наиболее значимых вариантов генов HLAA, B, DRB1 у больных туберкулезом и здоровых русских Челябинской области HLA Больные ТБ, Ax % Группа контроля,Ax % p-Value,t OR CI А 01 23,3 29,3 0,28 0,73 0,41 1,30 A 02 37,2 52,7 0,01 0,53 0,32 0,88 А 03 22,1 29,7 0,176 0,67 0,38 1,20 А ll 10,5 9,2 0,733 1,15 0,51 2,61 A 24 30,2 17,6 0,01 2,03 1,15 3,58 B 07 24,4 26,4 0,72 0,90 0,51 1,59 B 08 16,3 13,8 0,58 1,21 0,62 2,39 B 15 8,1 15,9 0,09 0,54 0,24 1,21 B 35 14,0 18,8 0,308 0,70 0,35 1,39 B 40 11,6 11,3 0,934 1,03 0,48 2,23 DRB1 01 26,7 28,0 0,82 0,94 0,54 1,63 DRB1 03 22,1 17,2 0,29 1,39 0,75 2,56 DRB1 04 20,9 21,8 0,911 0,97 0,53 1,77 DRB1 07 22,1 24,7 0,63 0,87 0,48 1,56 DRB1 10 0 3,3 0 0 0 0 DRB1 11 27,9 19,2 0,09 1,62 0,92 2,87 DRB1 15 18,6 27,6 0,11 0,61 0,33 1,12 DRB1 16 13,9 6,3 0,03 2,42 1,08 5,39 Примечание - - p-value 0,05 При сравнительном анализе генов HLA А у больных туберкулезом и группы контроля была выявлена достоверно высокая частота гена HLAA 24 (30,2% и 17,6% соответственно, р=0,001, OR=2,03 и 95% CI 1,153,58), наличие которого в генотипе может являться маркером потенциального риска развития клинических активных форм туберкулеза. У больных туберкулезом по сравнению с контрольной группой реже встречается ген HLAА 02 (37,2% и 52,7% соответственно, р=0,01, OR=0,53 и 95% CI 0,320,88). В популяции русских Челябинской области ген HLAА 02 характеризуется наиболее высокой частотой в локусе HLAA.
При сравнительном анализе распределения специфичностей локуса HLA DRB1 установлено достоверное повышение частоты редкого гена HLA DRB1 16 в группе больных туберкулезом по сравнению с контрольной группой (13,9% и 6,3% соответственно, р=0,03, OR=2,45 и 95% CI 1,105,46), который, вероятно, можно выделить в качестве маркера потенциального риска развития клинических активных форм туберкулеза. Ген HLADRB1 10 в группе больных туберкулезом не обнаружен, что, возможно, связано с низкой частотой встречаемости данного гена в русской популяции (3%). На уровне тенденции у больных туберкулезом снижена частота гена HLADRB1 15 и повышена частота гена HLADRB1 11. При сравнительном анализе распределения генов локусов HLA DQA1 и DQB1 достоверные различия не обнаружены (таблица 12 (приложение 1)).
Ассоциация полиморфизмов генов цитокинов IL1RА, IL1, IL10, TNFА и рецепторов врожденного иммунитета TLR4, TLR2 с развитием активного туберкулеза легких и его фенотипов
Данная часть исследования посвящена изучению распределения генов и комбинаций генов воспалительного ответа - цитокинов IL1RА, IL1, IL10, TNFА и рецепторов врожденного иммунитета TLR2 и TLR4, а также анализу их вклада в потенциальный риск развития определенных клинических фенотипов активного туберкулеза легких у русских Челябинской области. Исследование ассоциации полиморфизма генов IL1RА, IL1, IL10, TNFА, TLR2 и TLR4 велось по следующему плану: 1. Проверка частот генотипов на соответствие равновесию Харди-Вайнберга. 2. Анализ распределения аллелей, генотипов и гаплотипов IL1RА, IL1, IL10, TNFА у больных туберкулезом легких русской популяции, сравнение с выборкой условно здоровых лиц Челябинской области. 3. Анализ распределения аллелей, генотипов и гаплотипов генов системы воспаления в группах больных туберкулезом легких с различным клиническими формами туберкулеза легких. 4. Анализ распределения гаплотипов HLADRB1NFA(-308) у больных туберкулезом легких русской популяции, сравнение с выборкой условно здоровых лиц Челябинской области. 5. Оценка влияния полиморфизма генов TLR на развитие активного туберкулеза легких и его фенотипов. 6. Установление генетических комбинаций, участвующих в формировании воспалительного ответа, методом канонического анализа соответствий.
Тестирование на соответствие наблюдаемых частот генотипов в группе больных туберкулезом равновесию Харди-Вайнберга показало соответствие частоты генотипов исследуемых генов равновесию Харди-Вайнберга. Анализ распределения частот аллелей, генотипов и гаплотипов генов IL1RА, IL1, IL10, TNFА у больных туберкулезом легких и условно здоровых лиц русской популяции Челябинской области Мы предприняли поиск аллелей, генотипов и гаплотипов генов цитокинов IL1RА, IL1, IL10, TNFА, которые могли бы быть маркерами потенциального риска развития клинических активных форм туберкулеза. При проведении сравнительного анализа распределения аллелей и генотипов генов IL1RА, IL1, IL10, TNFА обнаружены отличия в распределении аллелей и генотипов гена TNFА(-238), а также гаплотипов TNFА(-308)NFA(-238). Результаты представлены в таблицах 7 и 8.
Сравнительный анализ распределения частот гаплотипов TNFА(-308) TNFA(-238) показал достоверное повышение частоты встречаемости гетерозиготного гаплотипа TNFA(-308) GNFA(-238) A, отвечающего за низкую продукцию цитокина, у больных туберкулезом по сравнению с контрольной группой (HF 0,093 и 0,027 соответственно, р=0,030, OR=2,80, 95% СІ 1,07-7,33). У больных туберкулезом легких в сравнении с контрольной группой достоверно снижена частота гомозиготного гаплотипа TNFA(-308) GNFA(-238) G (HF 0,727 и 0,843, р=0,015, OR=0,52, 95% СІ 0,31-0,89). Гаплотип TNFA(-308) ANFA(-238) A обнаружен не был.
Распределение аллелей и генотипов генов цитокинов IL1RA, ILlp, IL10, TNFA в группах больных туберкулезом легких с различными клиническими формами заболевания Существует широкий диапазон клинических фенотипов туберкулеза, свидетельствующий о том, что разные наборы генов участвуют в патогенезе различных клинических фенотипов. Мы провели сравнение распределения аллелей и генотипов генов IL1RA, ILlp, НЛО, TNFA у больных с инфильтративной, очаговой и фиброзно-кавернозной формами туберкулеза легких, в результате которого выявлены достоверные различия в распределении аллелей и генотипов генов ПЛр(+3953) и TNFA(-308) у больных с различными клиническими фенотипами туберкулеза легких. Полученные результаты представлены в таблицах 9 и 17 (приложение 7).
У больных тяжелой фиброзно-кавернозной формой туберкулеза в сравнении с группой больных с инфильтративной формой обнаружена высокая частота высокопродуктивного аллеля ILip(+3953) T (45,5% и 20,75%, соответственно, р=0,015, OR=2,7 и 95% CI 1,04-6,97) и низкая частота среднепродуктивного аллеля ILip(+3953) C (54,55% и 79,25% соответственно, р=0,015, OR=0,31 и 95% CI 0,12-0,82). Высокопродуктивный генотип ILlp(+3953) T/T встречается только в группе больных с фиброзно-кавернозной формой.
Больные с очаговой формой характеризуются высокой частотой низкопродуктивных аллеля TNFA(-308) G в сравнении с больными с фиброзно-кавернозной (96,2% и 72,73% соответственно, рс =0,050, OR =9,38 и 95% CI 1,03 -84,73) и инфильтративной (96,2% и 79,2% соответственно, рс =0,050, OR =6,55 и 95% CI 1,01-50,72) формами, и генотипа TNFA(-308) G/G также в сравнении с больными с фиброзно-кавернозной (92,3% и 45,5% соответственно, р=0,039, OR =14,4 и 95% CI 1,36 -151,39) и инфильтративной (92,3% и 60,4% соответственно, рс =0,050, OR =7,88 и 95% CI 1,01 -64,74) формами. Кроме того, у больных с очаговой формой туберкулеза достоверно снижена частота встречаемости аллеля гена TNFА(-308) А в сравнении с группами с фиброзно-кавернозной (3,85% и 27,27% соответственно, рс =0,023, OR=0,11 и 95% CI 0,01 0,97) и инфильтративной формами (3,85% и 20,8% соответственно, рс =0,045, OR =0,15 и 95% CI 0,02 0,99) и гетерозиготного генотипа гена TNFА(-308) G/A в сравнении с группами с фиброзно-кавернозной (7,7% и 54,6%, рс =0,023, OR=0,069 и 95% CI 0,010,74) и инфильтративной (7,7% и 37,7%, рс =0,048, OR =0,138 и 95% CI 0,020,99) формами. Генотип TNFА(-308) А/A обнаружен в единичном случае у больного с инфильтративной формой туберкулеза легких в фазе распада.
