Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные аспекты иммунофиброгенеза при хроническом гепатите с (литературный обзор) 12
1.1. Особенности иммунных дисфункций в патогенезе хронического гепатита С 12
1.2. Ключевые звенья фиброзообразования печени .15
1.2.1. Локальные клеточные взаимодействия при фиброзе печени 19
1.2.2. Молекулярные механизмы фиброгенеза печени 22
1.2.2.1. Трансформирующий фактор роста- 22
1.2.2.2. Матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы .26
1.3. Факторы, способствующие прогрессированию фиброза печени при хроническом гепатите С 30
1.4. Возможности оценки фиброза печени 33
Глава 2. Контингент, материалы и методы исследования..40
2.1. Общая характеристика обследованного контингента пациентов 41
2.2. Направления, методы, объемы исследований .47
2.2.1. Инструментальные методы исследования 48
2.2.2. Исследование показателей систем трансформирующего фактора роста- и протеолиз/антипротеолиз в сыворотке крови и супернатантах гепатобиоптатов 50
2.2.3. Статистический анализ данных и разработка математической модели диагностики фиброза печени при хроническом гепатите С .51
Глава 3. Показатели системы трансформирующего фактора роста- при хроническом гепатите с и его исходах .53
3.1. Сывороточный профиль изоформ трансформирующего фактора роста- 54
3.2. Показатели семейства трансформирующего фактора роста- в супернатантах гепатобиоптатов .60
Глава 4. Состояние внеклеточного матрикса при hcv-ассоциированном фиброзе печени 67
4.1. Показатели системы протеолиз/антипротеолиз в сыворотке крови .67
4.2. Локальный статус системы протеолиз/антипротеолиз 74
Глава 5. Математическая модель диагностики фиброза печени при хроническом гепатите с 81
Заключение .99
Выводы .116
Рекомендации для внедрения в практическое здравоохранение 117
Список литературы
- Ключевые звенья фиброзообразования печени
- Факторы, способствующие прогрессированию фиброза печени при хроническом гепатите
- Исследование показателей систем трансформирующего фактора роста- и протеолиз/антипротеолиз в сыворотке крови и супернатантах гепатобиоптатов
- Локальный статус системы протеолиз/антипротеолиз
Ключевые звенья фиброзообразования печени
В настоящее время известно, что инфицирование HCV приводит к развитию острого или хронического гепатита [47, 114, 120, 175, 186]. При этом отмечено, что повреждение печени имеет как прямой цитопатический характер, так и иммуноопосредованный [34, 35, 51, 62, 171]. В современной литературе указано, что течение и исход HCV-инфекции, главным образом, зависит от иммунного ответа организма, который в свою очередь определяется взаимоотношением вируса и хозяина [6, 42, 56, 104, 105, 176].
Установлено, что ряд факторов со стороны вируса способствует персистенции и хронизации HCV-инфекции [16, 17, 18, 19, 23]. А именно, ключевым из них является феномен «ускользания» вируса из-под иммунного надзора макроорганизма [45, 141]. Это обусловлено высокой интенсивностью репликации возбудителя, которая составиляет 1011-1012/сут, а также мутационной изменчивостью его генома [16, 17, 206]. Данная вариабельность заключается в постоянном образовании, даже у одного и того же пациента, близкородственных, но иммунологически различных мутантных штаммов, так называемых «квазивидов» (quasi-species) или кажущихся разновидностей, которые в свою очередь поддерживают активную репликацию вируса [62]. Также значительное количество исследований демонстрируют, что ВГС подавляет клеточное звено иммунной системы, непосредственно «истощая» CD4+- и CD8+-лимфоциты [10, 36, 112, 141, 173]. Кроме того, он запускает апоптоз вирусспецифических Т-клеток [145, 163, 167], индуцирует пролиферацию регуляторных CD4+CD25+-лимфоцитов (Тreg), которые угнетают активность эффекторных Т-клеток [119, 138, 154, 199].
В настоящее время в ряде отечественных и зарубежных работ показано, что репликация вируса происходит не только в гепатоцитах, но и в лимфоцитах и моноцитах, а также в клетках таких органов, как костный мозг, селезенка, лимфатические узлы, поджелудочная железа, почки, сердце, щитовидная железа, кишечник и др. [8, 82, 105, 106, 139, 200]. Вышеописанный факт рассматривается не только как резервуар вируса, а, следовательно, источник реинфицирования гепатоцитов, но и способность его к поражению других органов и систем, что в свою очередь обуславливает развитие внепеченочных проявлений HCV-инфекции [18, 19, 22, 23].
Что касается факторов хозяина, то установлено, что реакция врожденного и адаптивного (приобретенного) иммунитета имеет ряд характерных особенностей, препятствующих элиминации HCV-инфекции [102, 192, 206]. Так, несмотря на немедленную активацию первичного звена иммунного ответа при взаимодействии вируса с антигенпредставляющими клетками, многие отечественные и зарубежные авторы отмечают наличие иммунологического сбоя, который проявляется нарушением презентации вирусных антигенов, связывая это с низкой способностью распознавать их недавно обнаруженными Toll-like и лектиновыми рецепторами типа С (CD209+) [16, 62, 135, 172]. С другой стороны, HCV индуцирует различные активные и комплементарные механизмы, снижающие эффективность врожденного иммунитета [36, 101, 211]. В частности, результаты исследований свидетельствуют о том, что блокируется ряд этапов внутриклеточных сигнальных каскадов необходимых для продукции интерферона I типа [101, 197, 206]. Несостоятельность врожденого иммунного ответа в свою очередь может приводить к дисбалансу эффекторных клеток и экспрессии ими цитокинов, осуществляющих адаптивный иммунитет [44, 102, 224]. Известно, что ведущая роль в противовирусной защите принадлежит Т клеточному звену приобретенного иммунитета [4, 103, 141]. А именно, субпопуляции CD4+-лимфоцитам: Т-хелперам 1-ого типа (Th1), которые не только стимулируют цитотоксическую активность CD8+-клеток и макрофагов, но и усиливают экспрессию антигенов I-го класса гистосовместимости на клетках-мишенях, что лежит в основе иммунопатогенеза повреждения печени и клиренса вируса [1, 21, 43]. Ряд работ указывают, что хронизация HCV-инфекции сопровождается нарастающим снижением количества и развитием функциональной ареактивности участвующих в иммунных реакциях Т-клеток [10, 30, 86, 127, 194]. Так, при ХГС была выявлена низкая экспрессия CD3+-пан-Т-клеточного маркера [70]. А недавно опубликованные данные D. Ciuffreda и соав. (2011) демонстрируют, что у большинства HCV-позитивных пациентов преобладали клетки CD8+- над CD4+-лимфоцитами относительно здоровых лиц [141]. Эти результаты подтверждают ранее проведенные исследования других авторов, которые также свидетельствуют об увеличении HCV-специфических CD8+-лимфоцитов, однако их цитотоксический ответ недостаточен для клиренса вируса [62, 127, 153]. Кроме того, иммунный дисбаланс наблюдается среди субпопуляции CD4+-лимфоцитов, который характеризуется преобладанием Т-хелперов 2-ого типа (Th2) над Th1 [30, 73, 97, 141]. Th2, индуцируя синтез интерлейкинов (ИЛ) таких, как ИЛ -4, -5, -6, -9, -10 и -13, стимулируют главным образом активность В-клеток, отвечающих в организме за гуморальный иммунный ответ [58, 83, 104, 168].
Установлено, что иммунные нарушения при ХГС затрагивают не только клеточное, но и гуморальное звено иммунитета [10, 48]. Имеются результаты исследований, которые указывают, что продукция HCV-специфических антител происходит спустя продолжительный интервал от момента инфицирования и в невысоких концентрациях [36, 206]. Кроме того, антитела к антигенам HCV характеризуются снижением их эффекторных функций, что проявляется в недостаточности вируснейтрализующих свойств, которая по данным литературы связана с крайне низкой иммуногенностью вируса [12, 16, 62]. В то же время следует отметить, что в работах многих авторов показана тесная связь гуморального звена иммунитета и иммунокомплексных реакций, которые развиваются в результате образования циркулирующих иммунных комплексов, что является предпосылкой для запуска аутоиммунных процессов при ХГС [8, 18, 23, 76, 82].
Подводя итог вышесказанному, можно сделать вывод, что несостоятельность иммунного ответа, обусловленная характером взаимодействия HCV и организмом хозяина, сопровождается многолетней репликацией вируса, что поддерживает некровоспалительные процессы в органе-мишени, тем самым способствуя хронизации и прогрессированию HCV-инфекции с формированием фиброза и цирроза печени.
Факторы, способствующие прогрессированию фиброза печени при хроническом гепатите
По мнению отечественных и зарубежных авторов одним из ключевых звеньев иммуноморфогенеза печени являются активные клеточные кооперации [69, 134, 150, 159]. При этом к основным клеткам, непосредственно задействованным в патологическом процессе, относят гепатоциты и холангиоциты, клетки Ито, портальные фибробласты, мезенхимальные стволовые клетки крови и моноциты [7, 151, 165, 190, 209].
Согласно недавним работам к запуску фиброзообразования печени приводит гибель её паренхиматозных клеток, а именно гепатоцитов и холангиоцитов, что сопровождается формированием апоптотических и/или некротических телец, которые фагоцитируются антигенпредставляющими клетками, роль последних преимущественно выполняют клетки Купфера и ЗКП [157, 177, 189, 190]. Результатом фагоцитоза является продукция спектра «заинтересованных» цитокинов, АФК, а также хемокинов - класса малых хемотаксических молекул с цитокинопобными функциями, которые хорошо известны как участники воспалительной реакции в различных органах [83, 152, 229]. При этом в исследованиях отмечено, что среди синтезируемых цитокинов имеются два основных профиброгенных фактора роста такие, как ТФР- и тромбоцитарный фактор роста (ТцФР) [171, 189]. Указанные ростовые факторы – мощные митогены ЗКП, оказывают паракринное влияние на данные клетки Ито [43, 96, 134, 177, 201, 210].
Клетки Ито – ключевые эффекторные клетки, регулирующие синтез и одновременно деградацию внеклеточных протеинов в ткани печени при физиологических и патологических состояниях [2, 69, 150, 151, 157]. Кроме того, в значительном количестве исследований отмечено влияние клеток Ито на поддержание гомеостаза организма человека, а именно на метаболизм десмина и витамина А, который они аккумулируют до 80% в виде ретинойдов [55, 105, 129, 130, 159, 190].
Имеются отечественные и зарубежные работы, которые свидетельствуют, что клетки Ито подвергаются радикальным изменениям в ответ на фиброгенные стимулы [2, 160, 190, 193, 220]. Установлено, что в роли последних могут выступать биологически активные вещества, выделяющиеся в результате воздействия ВГС на ткань печени, а также ряд медиаторов, в особенности ИЛ-1, фактор некроза опухоли- (ФНО-), ТФР-, ТцФР, оксид азота, эндотелин, хемокины, экскретирующиеся активированными клетками Купфера [49, 63, 91, 174, 189, 195]. В исследованиях показано, что активация клеток Ито сопровождается их трансформацией в миофибробласты [126, 129, 150, 157, 193]. С.В. Айдагулова и соавт. (2008) описывают ряд морфологических признаков, свойственных новообразованным коллаген-продуцирующим клеткам, а именно уменьшение числа и последующее исчезновение липидных гранул, наличие выраженного белоксинтезирующего компартмента и формирование в цитоплазме контрактильных фибриллярных структур [2]. Таким образом, многие авторы характеризуют миофибробласты, как пролиферирующие, контрактильные, подвижные, воспалительные и фиброгенные, т. е. способные к продукции компонентов ВКМ, в том числе коллагена и протеогликанов [55, 69, 151, 159, 160]. Кроме этого, зарубежные работы свидетельствуют, что трансформированные клетки Ито непосредственно и/или через полипептидные медиаторы межклеточного взаимодействия способствуют миграции иммунокомпетентных клеток из периферической крови в печень и предотвращают их апоптоз, что поддерживает стойкий некровоспалительный процесс в органе-мишени [165, 166, 182, 210].
Исследования, посвященные изучению фиброгенеза печени, указывают на значительную роль в данном процессе портальных фибробластов. Они активируются при повреждении паренхиматозных клеток, преимущественно холангиоцитов, приобретают фенотипические свойства миофибробластов и, таким образом, выполняя их функции, принимают участие в процессе накопления и отложения компонентов ВКМ в пространстве Диссе [7, 134, 171, 223].
E. Mormone и соавт. (2011) показали, что мезенхимальные стволовые клетки крови способны дифференцироваться в гепатоциты, эпителиальные клетки желчных протоков и клетки Купфера при наличии соответствующих стимулов и факторов, что обуславливает их вклад в процесс фиброзообразования печени [190].
Известно, что моноциты (CD14+), происходящие из костного мозга, демонстрируют свою значительную динамичность и пластичность [119, 158, 165]. В пользу этого свидетельствуют данные, которые указывают, что при воспалительных процессах эти клетки устремляются в очаг повреждения печеночной ткани и трансформируются в фиброциты (CD34+), поддерживая в ней клеточную инфильтрацию [133, 209]. Кроме того, имеются работы, которые отмечают, что под воздействием ТФР-, преимущественно первой фракции, образованные клетки CD34+ способны дифференцироваться в коллаген-синтезирующие сократительные клетки с характеристиками миофибробластов, тем самым участвуя в ремоделировании ткани печени [7, 130, 165, 231].
Таким образом, локальные клеточные взаимодействия между иммунными эффекторными клетками и клетками печени как паренхиматозными, так и стромальными, определяют развитие и характер иммуновоспалительной реакции в органе-мишени, которая приводит к формированию фиброза печени и в конечном итоге неразрывно связанного с ним цирроза и/или ГЦК.
Исследование показателей систем трансформирующего фактора роста- и протеолиз/антипротеолиз в сыворотке крови и супернатантах гепатобиоптатов
Как упоминалось в обзоре литературы, в настоящее время признано, что иммунологические механизмы являются одними из ведущих в патогенезе ХГС и его исходах [31, 48, 57, 74, 76, 85]. Имеются убедительные данные о роли дисбаланса цитокинов на системном и локальном уровнях в вирусной персистенции и хронизации HCV-инфекции [32, 56, 84, 104, 107, 113]. Многие авторы считают, что определение содержания цитокинов в сыворотке крови и других биологических средах может свидетельствовать о функциональной активности различных иммунокомпетентных клеток, а, следовательно, о патологическом процессе в целом, его течении и исходе [5, 34, 39, 42, 43, 64].
Мы исследовали состояния системы ТФР-, его изоформ ТФР-1, ТФР-2 и ТФР-3, в сыворотке крови и супернатантах гепатобиоптатов у пациентов ХГС в проекции на лабораторные и морфологические параметры. Выбор исследуемых цитокинов связан с их биологическими эффектами. А именно иммуносупрессивное влияние, проявляющееся количественной и качественной недостаточностью иммунокомпетентных клеток, которое способствует «ускользанию» вируса из-под иммунного надзора организма, а, следовательно, персистенции HCV-инфекции [80, 109, 170, 209, 228]. Кроме того, ТФР- оказывает провоспалительное действие, связанное с вовлечением эффекторных клеток в очаг повреждения печеночной ткани, а также с повышением устойчивости их к апоптозу, тем самым поддерживая иммуновоспалительный процесс в печени, способствует развитию и прогрессированию структурных изменений в органе-мишени при данной гепатотропной вирусной инфекции [125, 133, 155, 190, 216, 232]. Важно отметить профиброгенный эффект ТФР-, который заключается в активации клеток, участвующих в ремоделировании ткани печени, прежде всего клеток Ито [130, 150, 160, 177, 185, 195]. А также изучаемые цитокины принимают участие в формировании дисбаланса в системе протеиназ/антипротеиназ, которая является одним из основных звеньев фиброгенеза печени [117, 128, 157, 171, 188, 191].
Результаты исследований сывороточного уровня изоформ ТФР- представлены в таблице 3.1. Следует отметить, что среди представителей фактора роста преобладает ТФР-1, который
Выявленные в ходе работы данные свидетельствуют о снижении показателей семейства ТФР- при ХГС в сравнении с контрольной группой, за исключением сывороточного уровня ТФР-2. Так, для ТФР-1 они составили 20,7±0,9 нг/мл против 21,2±0,4 нг/мл (р 0,05), а для ТФР-3 -31,3±3,3 пг/мл против 131,6±7,3 пг/мл (р 0,001). Полученные результаты не согласуются с некоторыми исследованиями отечественных и зарубежных авторов, в которых показано, что у пациентов с HCV-инфекцией увеличена концентрация ТФР-1 в сыворотке крови в несколько раз, превышая аналогичный показатель у здоровых лиц [12, 99, 113, 136, 219, 220]. В то же время Е.А. Путилова (2013) отмечает тенденцию к снижению продукции указанного цитокина у пациентов с ХГС, что согласуется с нашими данными [77]. Как видно из таблицы 3.1, наблюдается повышенный синтез ТФР-2 при HCV-инфекции: 167±3,7 пг/мл против 124,8±5,8 пг/мл в норме (р 0,01), что, вероятно, имеет компенсаторный характер по отношению к другим изоформам белка, сывороточные уровни которых, как было сказано выше, снижены.
Для определения патогенетического значения дисбаланса в системе ТФР- при HCV-инфекции нами проанализировано сывороточное содержание его изоформ у обследуемых пациентов во взаимосвязи с биохимической активностью крови, биологическими свойствами HCV и выраженностью фиброзных изменений в печени. В результате проведенного исследования в группах пациентов с разной выраженностью цитолиза между уровнями изучаемых цитокинов обнаружены статистически значимые отличия (р 0,05) (табл. 3.2).
При анализе профиля ТФР- в сыворотке крови в зависимости от уровня ГГТ было установлено, что отсутствие или наличие маркеров холестаза не оказывало существенного влияния на показатели изучаемых цитокинов (табл. 3.3).
Локальный статус системы протеолиз/антипротеолиз
Жалобы при поступлении на периодический дискомфорт в правом подреберье, возникающий после погрешности в диете, общую слабость, повышенную утомляемость. Считает себя больной с июня 2006 г., когда впервые выявлены маркеры вирусного гепатита С. В анамнезе неоднократная экстракция зубов. Употребление наркотических веществ и алкоголя отрицает. Объективно: состояние удовлетворительное, субиктеричность склер, отмечается увеличение печени - выступает из-под правого края реберной дуги на 1-2 см (размеры по Курлову 12-10-8 см), при пальпации печень: плотно-эластической консистенции, с гладкой поверхностью, чувствительна. Селезенка не пальпируется. По другим органам и системам без особенностей. Биохимический анализ крови: общий билирубин – 15,3 мкмоль/л (прямой – 3,7 мкмоль/л), ACT – 2N, АЛТ – 3N, тимоловая проба – 2 ЕД, ЩФ - 245 EД/л, ГГТ – 43 ЕД/л, общий белок – 68,6 г/л, глюкоза - 4,4 ммоль/л. УЗИ органов брюшной полости: Печень: контуры ровные, эхоструктура мелко- и среднезернистая, эхогенность повышена с линейной эхогенной исчерченностью. Нижний край острый, выступает из-под реберной дуги на 1,0 см. Правая доля – 11,9 см. Левая доля – 7,3 см. Диаметр портальной вены – 1,0. Желчный пузырь: 7,72,7 см. Стенка уплотнена, содержимое однородное, деформации нет, конкрементов нет. Поджелудочная железа: 2,41,82,3 см. Контуры ровные, эхоплотность диффузно усилена. Структура изменена, вирсунгов проток нормальный. Селезенка: 8,64,2 см. Структура обычная. ФГДС: Слизистая пищевода не изменена, кардия сомкнута. В желудке небольшое количество жидкости. Складки в желудке обычной высоты, расправляются воздухом. Слизистая желудка бледно-розовая. Привратник округлый. Луковица 12 перстной кишки обычной формы, слизистая ее истончена, сосудистый рисунок усилен. Заключение: косвенные признаки дискинезии желчевыводящих путей. Эластометрии печени с перерасчетом по шкале Метавир: проведено обследование на аппарате FibroScan 502. Медиана эластичности печени по 12 измерениям составляет 8,7 КPа; IQR 1,5 КРа, размах значений 5,5 – 11,6 КПа. Общий результат измерений может соответствовать фиброзу стадии F2 по METAVIR. Гистологическое исследование печени: гепатоциты с умеренной белковой дистрофией и внутридольковыми некрозами. Портальные тракты коллагенезированы, встречаются неполные септы. В портальных трактах лимфоцитарная инфильтрация с единичными ступенчатыми некрозами. Ядерный полиморфизм в гепатоцитах не выражен.Активность купферовских клеток повышена умеренно. Заключение: описанная морфологическая картина не противоречит диагнозу хронического вирусного гепатита С со слабовыраженной активностью. ИГА по Knodell = 7 баллов. METAVIR : А – 1, F – 2.
Исследуемые диагностические показатели: ГГТ – 43 ЕД/л, ТФР-1 – 36,7 нг/мл, ТИМП-1 – 237,6 нг/мл, ММП-9/ТИМП-2 – 24,8 пг/мл. РНФП = 100 %, PСФП = 0,01 %. Следовательно, с помощью разработанной модели у пациентки исключен HCV-ассоциированный фиброз печени 3-4 стадии, что совпадает с данными гистологического исследования печени. Клинический пример 3.
Пациент С., 49 лет. Клинический диагноз: Цирроз печени в исходе хронического гепатита С, умеренная активность (ИГА по Knodell = 11 баллов), генотип 1в, низкая вирусная нагрузка (7,5104 МЕ/мл). F4 по Metavir при ПБП. Класс А по Чайлд-Пью (5 баллов). Гепатоспленомегалия с синдромом гиперспленизма (тромбоцитопения). Синдром печеночно-клеточной недостаточности: латентная печеночная энцефалопатия. Синдром холестаза. Хронический панкреатит с внешнесекреторной недостаточностью, ремиссия. Гипертоническая болезнь II ст., риск 3. ХСН IIA, ФК II. Жалобы на момент осмотра на дискомфорт и чувство тяжести в правом подреберье, не связанные с приемом пищи, выраженную слабость, повышенную утомляемость и снижение работоспособности. Из анамнеза: Считает себя больной с сентября 2008 г., когда впервые выявлены маркеры вирусного гепатита С при плановом медицинском обследовании. Работает врачом. Холецистэктомия в 2006 г. При объективном обследовании: состояние удовлетворительное, субиктеричность склер, отмечается увеличение печени выступает из-под правого края реберной дуги на 2-3 см (размеры по Курлову 13-11-9 см), при пальпации печень: плотно-эластической консистенции, с гладкой поверхностью, безболезнена. Размеры селезенки 104 см. По другим органам и системам без особенностей. Клинический анализ крови: Нв - 139 г/л; тромбоциты 135109/л; Биохимический анализ крови: общий билирубин –24,5 мкмоль/л (прямой – 9,7 мкмоль/л), ACT – 1,5N, АЛТ – 3,5N, тимоловая проба – 3,8 ЕД, ЩФ - 200 EД/л, ГГТ – 116 ЕД/л, общий белок – 75,5 г/л, глюкоза – 5,5 ммоль/л. САСС: ПТИ – 93%, фибриноген – 4,4 г/л. УЗИ органов брюшной полости: Печень: контуры ровные, эхоструктура среднезернистая, эхогенность повышена. Нижний край острый, выступает из под реберной дуги на 2 см. Правая доля – 12,0 см. Левая доля – 8,8 см. Диаметр портальной вены – 0,8 см. Желчный пузырь отсутствует.
Поджелудочная железа: 2,22,02,1 см. Контуры ровные, эхоплотность диффузно усилена. Структура изменена, вирсунгов проток нормальный. Селезенка: 12,03,5 см. Структура обычная. ФГДС: Слизистая пищевода розовая. Блестящая, сосуды не видны. Розетка кардии сомкнута. Слизистая в желудке розовая, эластичная. Привратник свободно проходим. В 12-перстной кишке слизистая белесая, с умеренно выраженным феноменом «манной крупы». Заключение: косвенные признаки хронического панкреатита. Эластометрии печени с перерасчетом по шкале Метавир: проведено обследование на аппарате FibroScan 502. Медиана эластичности печени по 15 измерениям составляет 16 КPа; IQR 2,6 КРа, размах значений 12,0 – 21,8 КПа. Общий результат измерений может соответствовать фиброзу стадии F4 по METAVIR.
