Содержание к диссертации
Введение
Часть 1 .Обзор литературы 10
Глава 1. Роль цитокинового каскада в регуляции иммунного ответа при вирусных гепатитах В и С 10
Глава 2. Характеристика иммунного ответа при хронических вирусных гепатитах В и С 21
Глава 3. Характер морфологических изменений и роль иммунных клеток печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С 24
Часть 2. Собственные наблюдения 32
Глава 1. Материал и методы исследования 32
Глава 2. Общая клиническая характеристика больных хроническим вирусным гепатитом В и С 42
Глава 3. Сопоставление цитокинового профиля с уровнем гистологической активности и с отдельными параметрами, характеризующими гистологическую активность при хронических вирусных гепатитах В и С 53
Глава 4. Сопоставление показателей иммунного статуса с уровнем гистологической активности и с отдельными параметрами, характеризующими гистологическую активность при хронических вирусных гепатитах В и С 84
Глава 5. Особенности лейкоцитарной инфильтрации ткани печени у больных с хроническими вирусными гепатитами В и С 99
Заключение 127
Практические рекомендации 143
Список литературы
- Характеристика иммунного ответа при хронических вирусных гепатитах В и С
- Характер морфологических изменений и роль иммунных клеток печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С
- Сопоставление цитокинового профиля с уровнем гистологической активности и с отдельными параметрами, характеризующими гистологическую активность при хронических вирусных гепатитах В и С
- Сопоставление показателей иммунного статуса с уровнем гистологической активности и с отдельными параметрами, характеризующими гистологическую активность при хронических вирусных гепатитах В и С
Введение к работе
Парентеральные вирусные гепатиты, среди которых доминирующее место занимают гепатиты В и С, - одна из наиболее серьезных и актуальных проблем здравоохранения во всем мире. Заболевания распространены повсеместно и по данным ВОЗ в мире насчитывается около 400 млн. и 170 млн. инфицированных вирусом гепатита В и С соответственно. Прогрессирование в хронический гепатит может наблюдаться более чем у 60% больных острым гепатитом Сиу 10% больных острым гепатитом В. Эти инфекции являются доминирующими в развитии хронических заболеваний печени, включая цирроз и гепатокарциному[ 1,14,25,29,35,112].
Ключевую роль в патогенезе нарушения элиминации вируса и
хронизации при вирусных гепатитах играют изменение состава и
нарушение функции иммунокомпетентных клеток, что приводит к
развитию иммуносупрессорных и иммунопатологических реакций.
Основой развития иммунокомплексных реакций являются нарушения
цитокинового статуса, поскольку именно цитокины принимают
непосредственное участие в развитии воспаления, иммунного ответа и
регенерации печени [17,20,28,59,92,132]. Известно, что цитокины
осуществляют регуляцию межклеточных взаимодействий, но в ряде случаев выходят за рамки чисто медиаторных функций и, приобретая системный характер, запускают каскад патологических реакций [17, 23,145,148]. Таким образом, дефекты цитокиновой сети отражаются на эффективности противоинфекционного иммунитета. Нарушение баланса Thl/Th2 цитокиновой продукции и является одним из механизмов неадекватного иммунного ответа, играющего ключевую роль в развитии и прогрессировании заболевания [37,47,61,67,78,96]. Нарушения продукции медиаторов ведут к дефектам Т- лимфоцитов,
фагоцитирующих клеток и NK, которые отвечают за гибель вирусинфицированных гепатоцитов при хронических вирусных гепатитах В и С.
Напряжение местных реакций иммунной системы проявляется в виде гиперплазии лимфоидной ткани в ткани печени. Показана четкая корреляция между тяжестью течения процесса и выраженностью лимфоцитарной инфильтрации. Вслед за развитием воспалительного процесса в печени наблюдаются дистрофические и дегенеративные процессы, некроз гепатоцитов, а затем коллагенизация стромы на месте гибели участков паренхимы и в стенках сосудов [2,14,19,25,35,49].
Иммунная система печени включает в себя большинство компонентов врожденной иммунной системы (натуральные киллеры (NK), натуральные киллеры-Т-клетки (NKT-клетки), дендритные клетки, макрофаги и др.) и эффекторы специфического иммунитета (Т-клетки) [35,42,56,]. Взаимодействие Купферовских (или дендритных) клеток, NK, NKT, CD8 Т- клеток между собой обеспечивают развитие адекватного иммунного ответа на вирусную инфекцию [39,55,84,90].
В экспериментальных работах по изучению противоопухолевого
иммунитета получены новые сведения о субпопуляционном составе
иммунных клеток в печени. Была выявлена особая субпопуляция
Т-клеток - Т-регуляторные клетки CD4+CD25+ (Т per.), которые
проявляют гипопролиферативную способность, обладают
способностью угнетать активацию и ингибировать секрецию цитокинов CD4+CD25~ Т-хелперами и CD8+, таким образом препятствуя развитию реакций, направленных на элиминацию чужеродного антигена [45,64,146]. Данные о роли Т per. лимфоцитов печени при хронических вирусных гепатитах весьма малочисленны.
В связи с этим, актуальным представляется поиск механизмов, способствующих развитию и поддержанию длительной персистенции и
хронизации при вирусных гепатитах. Представляет интерес провести комплексное обследование больных хроническим вирусным гепатитом В и С с определением цитокинового профиля не только в сыворотке крови, но и изучить спонтанную и индуцированную продукцию цитокинов МНПК, изучить показатели иммунного статуса в сопоставлении с выраженностью показателей гистологической активности и фиброза, а также установить фенотип иммунных клеток печени для определения роли этих показателей в хронизации вирусных гепатитов и возможности коррекции их нарушений.
Цель работы.
Изучить особенности цитокинового профиля, субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови и лейкоцитарной инфильтрации печени в сопоставлении с морфологическими изменениями в печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Задачи исследования.
Изучить концентрацию цитокинов IFN-a, IFN-y, TNF-а, IL-ip, IL-4, IL-6 в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с показателями гистологической активности и фиброза.
Изучить спонтанную продукцию цитокинов ШЧ-a, IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-4, IL-6 МНПК у больных ХГВ и ХГС с различными показателями гистологической активности и фиброза.
Изучить индуцированную NDV и ФГА продукцию цитокинов IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-4, IL-6 МНПК у больных ХГВ и ХГС с различной активностью гепатита и выраженностью фиброза.
Определить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови в сопоставлении с уровнем гистологической активности и фиброза у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.
Оценить морфологические изменения с определением гистологической активности и фиброза в ткани печени у больных ХГВ и ХГС по данным пункционной биопсии печени.
Исследовать особенности лейкоцитарной инфильтрации печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с активностью гепатита и выраженностью фиброза.
Определить фенотип печень-ассоциированных лимфоцитов иммуногистохимическим и иммуноцитохимическим методом у больных ХГВ и ХГС.
Научная новизна.
У больных хроническими вирусными гепатитами В и С получены новые данные о стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК при различной активности гепатита и выраженности фиброза. В группе больных с выраженными морфологическими изменениями в печени определено достоверное угнетение способности МНПК продуцировать ряд цитокинов (ШЧ-а, IFN-y, TNF-а, IL-6) при стимуляции их NDV и ФГА.
Установлено отсутствие статистически значимых отличий концентрации цитокинов IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-1J3, IL-4, IL-6 в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами по сравнению со здоровыми донорами, что подтверждает необходимость изучения стимулированной продукции цитокинов для оценки цитокинового профиля.
Выявлено статистически значимое снижение
иммунорегуляторного индекса у больных с высокой гистологической активностью и выраженными морфологическими изменениями в печени.
Установлено отсутствие статистически значимых отличий содержания субпопуляций CD3, CD4, CD8, CD 16, CD25, HLADR, CD20, CD38 лимфоцитов периферической крови у больных хроническими вирусными гепатитами по сравнению со здоровыми донорами.
У больных хроническими вирусными гепатитами В и С сопоставлен характер и интенсивность лейкоцитарной инфильтрации с активностью патологического процесса в печени. Установлено, что у больных хроническим вирусным гепатитом С лейкоцитарная инфильтрация выражена больше и распространяется внутрь долек уже на ранних этапах развития инфекционного процесса по сравнению с больными-хроническим вирусным гепатитом В.
Впервые расшифрован фенотип иммунных клеток
лейкоцитарных инфильтратов паренхимы печени у больных ХГВ и ХГС, выявлены популяции Т- лимфоцитов CD3+, цитоксических лимфоцитов CD8+, Т per. лимфоцитов CD4+CD25+, NK- клеток CD16+CD56+, NKT-клеток CD3+CD16+CD56+.
Апробация работы и внедрение в практику.
Работа выполнена на кафедре инфекционных болезней Московской
медицинской академии имени И.М. Сеченова (зав. кафедрой, член-корр.
РАМН, профессор С.Г. Пак).
Тема диссертационной работы является фрагментом комплексной темы
кафедры «Интоксикация при бактериальных и вирусных инфекциях:
патогенез и механизмы адаптации» № 01200110439.
Рекомендации, полученные в результате исследования, внедрены в
практику на кафедре инфекционных болезней ММА имени И.М.
Сеченова и 2-й клинической инфекционной больницы г. Москвы.
Все основные положения диссертации опубликованы в открытой печати. Работа апробирована на заседании кафедры инфекционных болезней ММА имени И.М. Сеченова, лаборатории по изучению токсических и септических состояний кафедры инфекционных болезней 22 ноября 2007г.
Практическая значимость.
Для адекватной оценки активности инфекционного процесса
необходимо проводить комплексное обследование больных
хроническими вирусными гепатитами В и С, включающее в себя определение концентрации цитокинов не только в сыворотке крови, но и изучение стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК, а также вычисление показателей иммунорегуляторного индекса.
При морфологическом исследовании гепатобиоптатов у больных хроническими вирусными гепатитами В и С необходимо определять не только гистологическую активность и выраженность фиброза, но и оценивать выраженность, распространенность и субпопуляционный состав лейкоцитарных инфильтратов печени.
Только совокупность полученных данных позволяет выбрать правильную тактику и провести адекватную терапию у больных ХГВ и ХГС.
Часть 1.Обзор литературы.
Характеристика иммунного ответа при хронических вирусных гепатитах В и С
На сегодняшний день установлена определяющая роль клеточного иммунного ответа в элиминации вируса при вирусных гепатитах. Гибель вирусинфицированных гепатоцитов связывают с цитотоксическим действием Т-лимфоцитов (ЦТЛ), активированных макрофагов и NK-клеток [9,27,35,49,62,72]. При изучении морфологической картины в биоптатах печени у больных вирусными гепатитами описывают сочетание фокусов некроза и аутолиза паренхимы и серозного воспаления с развитием лимфоцитарной инфильтрации с примесью отдельных нейтрофилов, эозинофилов, плазматических клеток. Воспалительная инфильтрация распространяется по портальным трактам и сосудам, может сопровождаться образованием крупных инфильтратов вокруг печеночных и портальных вен. Отмечается четкая корреляция между тяжестью течения процесса и выраженностью лимфоцитарной инфильтрации. При доброкачественно текущих вариантах вирусных гепатитов степень выраженности инфильтрации незначительна, она локализована на отдельных участках. В случае значительного повреждения паренхимы печени определяется выраженная диффузная клеточная инфильтрация, при этом границы печеночных долек смазаны и гепатоциты как бы теряются в воспалительных инфильтратах, в то время как воспалительная инфильтрация портальных трактов выражена меньше [6,11,14,19,57]. Распространение инфильтрата в перипортальную зону сопровождается развитием ступенчатых некрозов, т.е. разрушением клеток паренхимы на границе с портальными трактами. При дальнейшем распространении клеток инфильтрата до соседних портальных трактов или центральной зоны формируются мостовидные некрозы, характеризующие высокую активность гепатита. Кроме ступенчатых и мостовидных некрозов, могут встречаться внутрилобулярные очаги небольших размеров, которые также окружены воспалительным инфильтратом. Гибель клеток печени при всех видах вирусных гепатитах происходит путем некроза и апоптоза [4,11,14,104].
Таким образом, вслед за развитием воспалительного процесса в печени наблюдаются дистрофические и дегенеративные процессы, некроз гепатоцитов, а затем коллагенизация стромы на месте гибели участков паренхимы и в стенках сосудов [11,35].
Морфологическая картина печени у больных хроническими вирусными гепатитами- В и С представлена мононуклеарными инфильтратами. Под действием цитокинов наблюдается повышение проницаемости эндотелия сосудов, рекрутирование моноцитов, макрофагов, лимфоцитов, нейтрофилов в патологический очаг из кровяного русла, затем активация иммунных клеток, выполнение ими своих функций и уничтожение вирусинфицированных гепатоцитов [11,20,33]. Большинство авторов описывают характерную гистологическую картину ткани печени при хроническом гепатите В и С в виде клеточной инфильтрации портальных трактов и междольковой стромы с формированием лимфоидных фолликулов, которые представляли собой скопления лимфоидных клеток в виде округлых образований. Установлена достоверная корреляция распространенности лимфоидных фолликулов в ткани печени с выраженностью портальной инфильтрации и перипортальных некрозов [11,19,35,101].
В настоящее время о роли специфического иммунного ответа известно достаточно много, меньше сведений посвящено другим субклассам мононуклеарных клеток (МНК) печени, особенно их участии в инициации иммунного ответа. Особенностью иммунной системы печени является то, что она содержит большое количество иммунокомпетентных клеток как врождённого, так и приобретенного иммунитета: натуральные киллеры (NK), натуральные киллеры-Т-клетки (NKT-клетки), дендритные клетки, макрофаги и др. Взаимосвязь между этими двумя звеньями иммунной защиты печени до конца не изучена [20,35,39,110,127].
В настоящее время в печени выявлена особая субпопуляция иммунных клеток - натуральные киллеры Т-клетки, обладающая выраженными цитотоксическими свойствами. NKT-клетки составляют большую часть Т-клеточной популяции печени и характеризуются как CD4+ или CD4-CD8- (двойные негативные) Т-клетки, экспрессирующие на своей поверхности маркеры NK. NKT-клетки имеют Т-клеточный рецептор и дифференцировочные антигены, присущие NK-клеткам [39,87,106,110,139]. NKT-клетки распознают антигены, которые игнорируют Т-лимфоциты. Взаимодействие с антигеном происходит посредством антигенпредставляющей молекулы CD Id без участия молекул МНС 1 или 2 класса. NKT-клетки также имеют рецепторы к IL-2 (CD25) и способны к активации этим эндогенным цитокином или его экзогенными аналогами [83,106]. NKT-клетки печени составляют основную часть Т-клеточной популяции этого органа и. обладают значительной противоопухолевой и противовирусной активностью. Практически все сведения об их внутрипечёночной активации и взаимодействии с другими звеньями иммунной системы печени были получены в эксперименте на мышах [54,58,87,100]. В отличие от мышиной, интактная печень здорового человека содержит небольшое количество NKT-клеток (0,5% CD3+), в периферической крови их ещё меньше (0,02%), в то же время в работах зарубежных авторов показано, что печень больных хроническим вирусным гепатитом инфильтрирована NKT- клетками [42,56,58,87,106].
Характер морфологических изменений и роль иммунных клеток печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С
Исследования производились в отделениях 1-1 и 5-11 на базе КИБ №2 г. Москвы (кафедра инфекционных болезней ММА им. ЕМ; Сеченова) в период с 2004 по 2007 гг. Было обследовано 47 больных хроническим вирусным гепатитом В и С. В исследование вошли 37 больных вирусным гепатитом В и С, из них 13 больных хроническим гепатитом В и 24 больных хроническим вирусным гепатитом С. Забор крови у всех больных проводился однократно. До момента обследования больные не получали противовирусной терапии. Диагноз хронического вирусного гепатита основывался на выявлении синдромов гепато- и спленомегалии, холестаза и цитолиза. У всех больных BFG, включенных в наше исследование, в сыворотке крови были обнаружены anti-HCV IgG. Для установления диагноза хронический вирусный гепатит В выполнено серологическое исследование сыворотки крови на HbsAg, anti-HBcorYgG, anti HBcorYgM. С целью подтверждения активной репликации вируса всем больным выполнен полуколичественный анализ ІЩР на HCV-PHK в сыворотке крови с определением генотипа вируса гепатита С. У больных с хроническим вирусным гепатитом В был выполнен полуколичественный анализ для выявления HBV-ДНК методом ПЦР в сыворотке крови; Для исключения вирусных гепатитов смешанной этиологии сыворотка крови от больных была исследована на наличие маркеров В ГА (anti-HAV IgM), ВГД (anti-HDV IgM, anti HDVcyM.).
Были определены следующие показатели в сыворотке крови больных ХГВ и ХГС: уровни свободного и связанного билирубина, АЛТ, ACT, гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, ПЯ и СЯ, моноцитов, лимфоцитов, СОЭ. Объем крови для исследования составил 15мл. Кровь центрифугировали при 3000 обЛмин в течение 15 минут. Полученную сыворотку замораживали при -20 С.
Для оценки цитокинового профиля у больных хроническими вирусными гепатитами В и С изучена концентрация цитокинов (IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-4, IL-6) в сыворотке крови, а также спонтанная и стимулированная NDV и ФГА продукции данных цитокинов МНПК. Изучение иммунного статуса у больных проводилось с помощью определения CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, HLADR, CD20, CD38 антигенов методом иммунофлюоресценции. Данные исследования проведены в лаборатории клеточного иммунитета ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (зав. лабораторией д.м.н., проф. М.В. Киселевский).
Всем больным проводилась аспирационная пункционная биопсия печени по Менгини с последующим гистологическим и морфологическим исследованием полученных биоптатов печени.
Полученные гистологические препараты окрашивали гематоксилин эозином для выявления лимфоидной инфильтрации печени и пикрофуксином по Ван-Гизону для выявления соединительной ткани. В лаборатории клеточного иммунитета ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН методом иммуногистохимии на криосрезах и иммуноцитохимии на мононуклеарных клетках, выделенных из биоптатов, определяли иммунофенотип клеток печени. Из мононуклеарных лейкоцитов гепатобиоптатов были приготовлены мазки, которые окрашивались эозин-азуром по Романовскому-Гимза и по Браше с контрольной обработкой РНК-азой. Световую микроскопию и фотографирование иммунных клеток печени в окрашенных мазках проводили с помощью фотовидеосистемы Axioplan 2 (фирмы Carl Zeiss, Германия). Дополнительно проводилось ультразвуковое исследование печени.
Таким образом, каждому больному было проведено больше 40 специальных исследований для решения поставленных задач.
Определение маркеров вирусных гепатитов.
Для установления диагноза хронический вирусный гепатит В и С у пациентов методом иммуноферментного анализа (ИФА) определялись маркеры вирусных гепатитов в сыворотке крови с использованием стандартных сывороток (институт эпидемиологии, г. Н-Новгород) на базе 2КИБ в иммунологической лаборатории (Зав. лаб. к.м.н. Ольшанский А.Я.) ВГВ (HBsAg, anti-HBcor IgM, anti-HBcor IgG), ВГА (anti-HAV IgM), ВГС (anti-HCV IgG), ВГД (anti-HDV IgM, anti-HDVcyM).
Определение биохимических показателей крови.
Определение биохимических показателей крови, таких как прямой и непрямой билирубин, АЛТ, ACT проводилось на базе КИБ №2 на клиническом анализаторе OLLI-3000 (Финляндия) с использованием наборов фирмы Копе по общепринятым методикам.
Определение ДНК HBV, РНК HCV и генотипирование вируса.
Исследование наличия ДНК HBV, РНК HCV и установление генотипа вируса С проводилось методом ПНР в лаборатории ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ (к.м.н. Чуланов В.П.). Определение уровней IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-lp, EL-6, IL-4.
Определение концентрации цитокинов производилось «сендвич» - методом твердофазного иммуноферментного анализа с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента (наборы реагентов IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-6, IL-4 OOO «Протеиновый контур» С-Петербург). Активность связанной пероксидазы измерялась с использованием автоматического фотометра для микропланшетов при длине волны 492 нм, который» определяет зависимость оптической плотности от концентрации для стандартного антигена и позволяет произвести сравнение с ним исследуемых образцов. Количественная оценка результатов проводилась методом построения калибровочной кривой. Чувствительность метода 5 пг\мл. Метод не требует особых условий проведения исследований. Достаточно точен и прост в
Осуществлении: Исследовали концентрацию цитокинов в сыворотке крови, а также спонтанную и индуцированную продукцию цитокинов МНПК.
Сопоставление цитокинового профиля с уровнем гистологической активности и с отдельными параметрами, характеризующими гистологическую активность при хронических вирусных гепатитах В и С
Одной из задач нашего исследования является, изучение взаимосвязи цитокинового профиля и гистологической активности у больных с хроническими вирусными гепатитами различной-этиологии. Большие компенсаторные возможности печени приводят к тому, что клиническая симптоматика и функциональные показатели не отражают истинный характер патологических морфологических изменений в печени. В настоящее время ведущим диагностическим критерием при обследовании больных с хроническим поражением печени является прижизненное морфологическое исследование ткани печени. Морфологическое исследование биоптата печени позволяет определить степень активности процесса, уточнить стадию болезни, выявить начальные признаки цирроза, прогнозировать течение и исход заболевания. Наиболее широко распространенным методом полуколичественной оценки гистологической активности хронического гепатита вне зависимости от его этиологии является метод Кноделя [1,10,14,35].
Основой развития иммунокомплексных реакций являются нарушения цитокинового статуса, поскольку именно цитокины принимают непосредственное участие в развитии воспаления, иммунного ответа и регенерации печени. Отмечено, что длительная активация ТЫ-лимфоцитов с гиперпродукцией IFN-y и TNF-a способствуют активному прогрессирующему течению заболевания и элиминации вируса, тогда как преобладание в патологическом процессе цитокинов, продуцируемых ТЪ2-клетками, напротив, ассоциируется с вирусной персистенцией и хронизацией процесса [12,27,37,46,61,80,96].
Таким образом, изменение цитокинового статуса в виде нарушения баланса Thl/Th2 цитокиновой продукции и является одним из механизмов неадекватного иммунного ответа, играющего ключевую роль в развитии, прогрессировании заболевания и хронизации.
В связи с этим представляло интерес изучить цитокиновый профиль в сопоставлении с гистологической активностью у больных с хроническими вирусными гепатитами.
В наше исследование было включено 37 больных хроническими вирусными гепатитами различной этиологии, у которых исследовали цитокиновый профиль в сыворотке крови, спонтанную и индуцированную NDV и ФГА продукцию 6 цитокинов (IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-4, IL-6). В качестве группы контроля исследован цитокиновый профиль у 10 здоровых доноров.
Первоначально все больные с хроническим вирусными гепатитами В и С были разделены на группы по уровню активности гепатита в соответствии с ИГА. Значения ИГА 1-3 балла соответствуют минимальной степени активности гепатита, при ИГА 4-8 баллов делают заключение о низкой активности, показатели в пределах 9-12 баллов свидетельствуют об умеренной степени активности, а 13-18 баллов - о высокой степени активности хронического гепатита вне зависимости от его этиологии.
Была изучена сывороточная, спонтанная и стимулированная NDV и ФГА продукция цитокинов у больных хроническими вирусными гепатитами различной этиологии в зависимости от уровня гистологической активности.
Не было статистически значимых различий концентрации IFN-a в сыворотке крови, спонтанной и стимулированной ФГА продукции данного цитокина МНПК ни в одной группе больных с различной степенью гистологической активности по сравнению со здоровыми донорами. В группах больных с минимальной и высокой степенью активности гепатита индуцированная NDV продукция IFN-a МНПК была достоверно снижена по сравнению с контрольной группой.
Выявлено статистически значимое снижение стимулированной NDV продукции IFN-y МНПК только у больных с высокой гистологической активностью по сравнению со здоровыми донорами.
Установлено достоверное снижение стимулированной» NDV и ФГА продукции TNF-a МНПК у больных с высокой активностью гепатита, при этом концентрация данного цитокина в сыворотке крови и при спонтанной продукции МНПК не отличалась от группы контроля.
В группе больных с высокой активностью гепатита определено статистически значимое снижение индуцированной NDV продукции IL-6 МНПК и выявлена тенденция к повышению концентрации исследуемого цитокина в сыворотке крови по сравнению со здоровыми донорами.
При изучении содержания IL-ip у больных с различной гистологической активностью, была определена только тенденция к повышению спонтанной продукции данного цитокина МНПК у больных с высокой активностью гепатита, уровень IL-ip в сыворотке крови и при стимулированной продукции МНПК не отличался от контрольной группы.
Ни в одной группе больных с различной активностью гепатита не было определено статистически значимых различий в концентрации IL-4 в сыворотке крови, при спонтанной и стимулированной NDV и ФГА продукции МНПК при сравнении с группой контроля.
Таким образом, ни в одной группе больных с различной степенью гистологической активности содержание исследуемых цитокинов IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-4, IL-6 в сыворотке крови и их спонтанная продукция МНПК достоверно не отличалась от контрольной группы. Установлено статистически значимое снижение индуцированной NDV продукции IFN-a МНПК у больных с минимальной активностью гепатита, а при высокой гистологической активности выявлено достоверное снижение IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-6 при стимулированной NDV продукции и достоверное снижение TNF-a при стимулированной ФГА продукции МНПК по сравнению со здоровыми донорами.
Учитывая то, что индекс гистологической активности является интегративным показателем, складывающимся из следующих параметров: степень выраженности дистрофических и некротических изменений гепатоцитов, степени выраженности воспалительной инфильтрации портальных трактов и разрастания в печени соединительной ткани, представляло интерес изучить каждый параметр в отдельности в сопоставлении с уровнем отдельных цитокинов в сыворотке крови, уровнем их спонтанной продукции и на фоне стимуляции NDV и ФГА. Важным показателем, характеризующим гистологическую активность, входящим в состав интегративного показателя является выраженность перипортальных некрозов в баллах. Это позволило нам соотнести уровень цитокинов IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-lp, IL-4, DL-6 в сыворотке крови, при спонтанной и стимулированной NDV и ФГА продукции с уровнем перипортальных некрозов, выраженным в баллах от 0 до5
Сопоставление показателей иммунного статуса с уровнем гистологической активности и с отдельными параметрами, характеризующими гистологическую активность при хронических вирусных гепатитах В и С
Повышение сывороточных концентраций IL-6, который наряду с провоспалительной активностью - синтез и высвобождение белков острой фазы, является регулятором роста гепатоцитов, свидетельствует о повышении пролиферативной активности гепатоцитов при хронических вирусных гепатитах. TNF-a является ключевым провоспалительным цитокином системного действия, играющим важную роль в патогенезе тканевого повреждения при хронических вирусных гепатитах. Запуская каскад воспалительных и регенераторных реакций он стимулирует процессы воспаления, фагоцитарную и цитотоксическую активность клеток и индуцирует апоптоз, что приводит к разрушению инфицированных клеткок [33,40,81,121]. Этим может быть объяснена установленная нами тенденция к повышению спонтанной продукции TNF-a МНПК у больных хроническими вирусными гепатитами различной этиологии с максимальной выраженностью перипортальных некрозов 5 баллов и у больных с 2 баллами фиброза.
В, настоящее время изучение цитокинового профиля у больных хроническими вирусными. гепатитами проводится многими отечественными и зарубежными авторами, при этом в большинстве работ приводятся данные о содержании отдельных цитокинов только в сыворотке крови без изучения их спонтанной и стимулированной продукции [12,15,27,37,51,80,104]. Вместе с тем, концентрации исследуемых цитокинов в сыворотке крови у здоровых доноров, полученные разными авторами, значительно отличаются. Так, в работах разных авторов приводятся данные о содержании DL-ip в сыворотке крови у здоровых доноров в пределах от 5 до 46 пг/мл [27], уровень IL-4 колебался от 7,91 до 67,39 пг/мл [37]. Сывороточная концентрация DL-6 у здоровых доноров, по данным разных авторов, колебалась от 4,56 f до 25,3 пг/мл [27,32], а для TNF-a эта величина варьировала от 0,72 до 1 34,3 пг/мл в группе контроля [22,27,32]. Очевидно, с этим связаны различия в статистически значимых уровнях повышения сывороточных цитокинов у больных хроническими вирусными гепатитами по сравнению со здоровыми донорами. Так в работах показано статистически значимое повышение продукции IL-ip до 22 пг/мл , IL-6 до 24,2 пг/мл, TNF-a до 40 пг/мл в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами, что по данных других авторов не превышает показатели физиологической нормы [12,22,26,27,37,53,150].
При обследовании здоровых доноров было установлено, что концентрация цитокинов в сыворотке крови находилась в пределах от О до 400 пг/мл, при этом у 90% больных не превышала 50 пг/мл [32,37,71]. Таким образом, колебания концентрации цитокинов в сыворотке крови до уровня 50 пг/мл, несмотря на достоверность этих изменений, находятся в пределах физиологических значений и не могут рассматриваться как повышение по сравнению со здоровыми донорами. Очевидно, с этим связаны разноречивые данные о значимости отдельных цитокинов при хронических вирусных гепатитах. В работах показано статистически значимое значительное повышение концентрации TNF-a, IL-6, IFN-y, EFN-a в сыворотке крови по сравнению со здоровыми донорами, в то же время по данным других авторов наблюдается выраженное снижение концентрации TNF-a на фоне повышения уровня IL-4 в сыворотке крови, а также достоверное увеличение концентрации IL-10 и снижение уровня IFN-y [12,15,22,27,40,47,59,96]. Столь разноречивые данные, полученные разными авторами при изучении концентрации цитокинов в сыворотке крови, подтверждают значительную вариабельность этого признака и требуют пересмотра их роли в качестве диагностического критерия у больных с хроническим вирусным гепатитом.
Полученные в результате исследований низкие концентрации цитокинов в сыворотке крови могут быть следствием как истинной медиаторной гипо-/ареактивности, так и быстрым специфическим и/или неспецифическим связыванием и исчезновением из системного кровотока свободных форм этих биологически активных соединений. Поэтому даже при ежедневном мониторинге вероятность выявления свободных цитокинов мала, тем более, что время циркуляции свободных цитокинов в системном кровотоке колеблется от десятков минут до нескольких часов [17,28,32,33].
