Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Материалы и методы 29 стр.
Глава 2. Результаты исследования 43 стр.
2.1 Клиническая и лабораторная характеристика исследуемых групп 43 стр.
2.2 Морфологическая характеристика биоптатов печени больных ХГС 81стр.
2.3 Содержание гиалуроновой кислоты в сыворотке крови пациентов исследуемых групп 88 стр.
2.4 Содержание коллагена IV типа в сыворотке крови пациентовисследуемых групп 94 стр.
2.5 Клинические примеры 102 стр.
Глава 3. Обсуждение полученных результатов 115 стр.
Выводы 128 стр.
Практические рекомендации 130 стр.
Список использованной литературы 131 стр
- Клиническая и лабораторная характеристика исследуемых групп
- Морфологическая характеристика биоптатов печени больных ХГС
- Содержание гиалуроновой кислоты в сыворотке крови пациентов исследуемых групп
- Содержание коллагена IV типа в сыворотке крови пациентовисследуемых групп
Введение к работе
На современном этапе развития гепатологии приоритетные позиции занимают те ее разделы, которые изучают патогенетические механизмы формирования фиброза печени и пути предотвращения прогрессии фиброза печени в цирроз печени (ЦП).
Доля хронического гепатита С (ХГС) в этиологической структуре хронических гепатитов составляет не менее 25% [6].
У большинства пациентов с ХГС заболевание протекает бессимптомно, и пациенты нередко обращаются к врачу на стадии фиброза 3-4. Известно, что наличие фиброза печени 3 и 4 стадии (по шкале R.Knodell) существенно снижает вероятность успеха противовирусной терапии от 70% до 44% [55]. Поэтому в настоящее время пункционная биопсия печени (ПБП) с последующим морфологическим исследованием пунктата считается "золотым стандартом" определения тяжести поражения печени у больного хроническим гепатитом С. Кроме того, ПБП позволяет своевременно назначить адекватную этиопатогенетическую терапию и оценить эффективность противовирусной терапии. Более чем в 50% случаев во всем мире показанием для ПБП является хронический гепатит С.
К сожалению, пункционная биопсия, оставаясь "золотым стандартом" определения стадии фиброза, все-таки является инвазивной методикой с определенным процентом осложнений вплоть до летальных.
В последнее время достигнут значительный прогресс в изучении патогенеза фиброза печени при ХГС. Доказано антифибротическое действие интерферонов. Проводится большое количество работ по неинвазивной диагностике фиброза печени, с применением тестов, в основе которых лежат методы выявления молекулярных соединений, участвующих в патофизиологии процесса образования внеклеточного матрикса (в частности, коллаген IV типа (CL-IV) и гиалуроновая кислота (ГК)). Однако, данные, полученные
различными авторами о диагностической ценности ГК и CL-IV для неинвазивного скрининга фиброза печени, противоречивы и не достаточно изучены [4].
Учитывая вышесказанное, данная проблема требует дальнейшего изучения.
Цель и задачи исследования.
Цель исследования - определение диагностической значимости гиалуроновой кислоты (ГК) и коллагена IV типа (CL-IV) при оценке степени воспаления и стадии фиброза в печени у больных хроническим гепатитом С. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Сравнить клинические и лабораторные данные больных ХГС со стадией фиброза 1 (Fl), 3(F3)hII
Сопоставить средние значения концентрации ГК и CL - IV в сыворотке крови больных ХГС и степень некрозо-воспалительных изменений (ИГА) по результатам морфологического исследования пунктата печени.
Сопоставить средние значения концентрации ГК и CL - IV в сыворотке крови больных ХГС и стадию фиброза (ГИС) по Knodell по результатам морфологического исследования печени.
Сопоставить средние значения концентрации ГК и CL-IV в сыворотке крови больных желтушной формой ОГС и больных ХГС со стадией фиброза 1(F1) и 3(F3),Un.
Оценить изменения средних значений концентрации ГК и CL - IV в сыворотке крови больных ОГС в динамике заболевания.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Используя основные клинико - лабораторные и инструментальные методы обследования больного ХГС (осмотр, УЗИ печени, гемограмма и биохимический анализ крови, включающий определение АЛТ, ACT, АСТ/АЛТ, ГГТП, ЩФ, билирубин, общий белок, альбумин и глобулин) невозможно предсказать наличие выраженного фиброза печени (F3 и F4).
Средняя концентрация коллагена IV типа в сыворотке крови больных ХГС достоверно выше у пациентов с выраженной активностью гепатита (ИГА 13 -18 баллов) по сравнению с умеренной (ИГА 9 - 12 баллов) и слабовыраженной (4-8 баллов) активностью.
Средняя концентрация коллагена IV типа в сыворотке крови больных ХГС достоверно выше у больных со стадией фиброза F3, чем у пациентов со стадией фиброза F1, а у больных ЦП класса А по шкале Чайлд - Пью достоверно больше, чем у больных ХГС со стадией фиброза F3. Для разграничения стадий фиброза F3 от F1 значимой является концентрация коллагена IV типа более 196 нг/мл, при которых чувствительность метода составила 88%, специфичность- 58,7%. Концентрация коллагена IV типа более 280 нг/ мл позволяет разграничить ЦП класса А по шкале Чайлд - Пью от фиброза 3 стадии со специфичностью 88% и чувствительностью теста 100%.
Средняя концентрация гиалуроновой кислоты у пациентов с фиброзом легких, больных ХГС со стадией фиброза F1, ХГС со стадией фиброза F3, острым гепатитом С (в остром периоде и через 6-16 месяцев наблюдения) и у здоровых лиц не превышает нормальных значений (до 100 нг/мл). Концентрация гиалуроновой кислоты более 100 нг/мл позволяет диагностировать цирроз печени с чувствительностью 100% и
специфичностью 84,6%.
5. Средняя концентрация коллагена IV типа у больных острым гепатитом С с последующей хронизацией заболевания в остром периоде гепатита и через 6 -16 месяцев наблюдения не различались.
Научная новизна исследования.
Впервые результаты обследования больных ХГС с различными стадиями фиброза печени сопоставлены не только с контрольной группой, но и с группой сравнения (фиброз легких). Показаны различия среднего уровня коллагена IV типа между группами больных ХГС со стадией фиброза F1 и F3, а также у больных с фиброзом F3 и ЦП. Впервые определено значение концентрации коллагена IV типа, позволяющее диагностировать серьезный фиброз печени без морфологического исследования печеночной ткани. Определены специфичность и чувствительность метода для диагностики выраженного фиброза и ЦП. Впервые установлены значения нормы CL-IV на группе здоровых лиц из числа жителей города Москва. Впервые изучено содержание гиалуроновой кислоты и коллагена IV типа у больных ОГС с последующей хронизацией заболевания и показано, что концентрации маркеров фиброза не различались в динамике болезни (через 6-16 месяцев наблюдения).
Практическая значимость работы.
Коллаген IV типа можно рекомендовать для диагностики выраженного фиброза печени у больных хроническим гепатитом С. При концентрациях коллагена IV типа в сыворотке крови больше 196 нг/мл можно диагностировать выраженный фиброз печени без пункционой биопсии печени. Концентрация коллагена IV типа более 280 нг/мл позволяет разграничить цирроз печени от фиброза 3 стадии. При концентрации коллагена меньше 141 нг/мл с 88% долей вероятности можно исключить стадии фиброза F3 и F4.
Определение концентрации гиалуроновой кислоты в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С позволяет диагностировать цирроз печени.
Апробация диссертации.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании научно-практического общества инфекционистов города Москва (2003 г.), на конференции «Инфекционные болезни и антибактериальная терапия» (Москва, 2003г), Девятой Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2004г.). Диссертация апробирована на заседании кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ 24 марта 2004г.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 139 листах машинописного текста, состоит из введения, 2 частей (обзор литературы и результаты собственных исследований), обсуждения полученных результатов с выводами, практическими рекомендациями, списка литературы, содержащего 20 отечественных и 70 зарубежных источников. Иллюстративный материал представлен 42 таблицами и 17 рисунками.
По материалам диссертации опубликовано 5 работ.
Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Вирусные гепатиты продолжают оставаться одной из главных проблем здравоохранения. Ежегодно от патологии, связанной с вирусными гепатитами, включая цирроз печени и первичную клеточную карциному, в мире умирает более 1 млн. человек [11]. По данным ВОЗ, около 1% населения мира инфицировано вирусом гепатита С. Распространенность инфекции, вызванной вирусом гепатита С (HCV-инфекции) в разных странах колеблется от 0,5 до 2%. По данным Центра контроля за заболеваниями США, хронический гепатит С составляет приблизительно четвертую часть в структуре всех хронических гепатитов.
Вирус гепатита С является ведущей причиной хронического гепатита, цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), а также наиболее частым показанием к проведению трансплантации печени [10]. Это связано с тем, что прогрессия заболевания от стадии активного хронического гепатита к циррозу печени протекает бессимптомно, и пациент обращается к врачу уже на конечной стадии патологического процесса.
По данным современных исследований, HCV - инфекция становится хронической в 75 - 80% случаев острой инфекции, и более чем у 25% больных с установленным диагнозом хронического гепатита С в течение ближайших 5 -20 - 30 лет может развиться цирроз печени [7, 9].
Таким образом, при обследовании больного с верифицированной HCV инфекцией первым и необходимым шагом является определение активности некрозо-воспалительных процессов в печени и оценка стадии процесса на основании выраженности фиброза. Наряду с другими показателями (анамнестическими, клиническими и лабораторными) это играет важную роль в прогнозировании течения гепатита и обратимости выявленных изменений в печени на фоне лечения, оценке риска развития цирроза печени в ближайшем будущем и, в конечном счете, определяет лечебную тактику в каждом индивидуальном случае [15].
Патогенез фиброза печени.
Основу формирования фиброза печени составляет процесс фиброгенеза -избыточный синтез компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ). Фиброгенез в печени может активироваться рядом повреждающих факторов - алкоголем, гепатотропными вирусами (HBV, HCV), лекарственными препаратами, избыточным накоплением меди и железа, нарушением обмена углеводов и липидов и др.
В норме, при саморазрешающихся заболеваниях печени фиброгенез уравновешен процессами фибролиза, т.е. удаления избытка ВКМ с помощью протеолитичских ферментов. При хронических заболеваниях печени это равновесие нарушается и, таким образом, можно рассматривать фиброз, как состояние, возникающее вследствие нарушения баланса между процессами синтеза и распада внеклеточного матрикса с преобладанием процессов фиброгенеза и, в конечном счете, приводящее к конечной стадии фиброза печени - циррозу [1].
Основу ВКМ составляют фибрилл - формирующие коллагены и
матричные гликоконьюгаты (протеингликаны, фибронектины и
гиалуроновая кислота). Основным источником ВКМ в печени является
активированная звездчатая клетка, называемая также клеткой Ито, перицитом
или жирозапасающей клеткой -липоцитом [87, 90]. Звездчатые клетки
располагаются в пространстве Диссе между эндотелиальными клетками и
поверхностью гепатоцитов, обращенной к синусоиду. В нормальной печени
звездчатые клетки представляют собой покоящиеся клетки, которые
накапливают ретиноиды и производят ограниченное количество протеинов внеклеточной матрицы. Повреждение печени активирует звездчатые клетки. На их поверхности увеличивается количество рецепторов к цитокинам, стимулирующим пролиферацию и фиброгенез (фактор некроза опухолей (TNF-a), интерлейкин-1, росттрансформирующий фактор-(31(ТОР-)31), тромбин, тромбоцитарный и эпидермальный факторы роста) [19, 72]. Далее, в
процессе активации звездчатые клетки теряют ретиноиды, отмечается увеличение шероховатой эндоплазматической сети, появление волокон а -актина, увеличивается содержание матричной РНК коллагена I, III и IV типов. Активированные звездчатые клетки - миофибробласты начинают продуцировать в большом количестве коллаген и металлопротеиназы (ММП).
ММП - семейство цинк - зависимых эндопетидаз, играющих главную
роль в разрушении протеинов ВКМ. Выделяют 3 основные группы этих
ферментов (металлопротеиназ): коллагеназы, желатиназы и стромолизины.
Коллагеназы разрушают интерстициальный коллаген (типов I, II, III),
желатиназы - коллаген базальных мембран (IV типа) и желатин.
Стромолизины способны разрушать множество других белков, в том числе
протеогликаны, ламинин, желатины и фибронектин. Поскольку
активированные звездчатые клетки секретируют как ММП, так и ТИМП, они играют основную роль не только в синтезе фиброзной ткани, но и в ее разрушении. Другие клетки (портальные фибробласты) в меньшей степени участвуют в продукции компонентов ВКМ.
Активация фиброгенеза характеризуется усилением синтеза коллагена и увеличением концентрации тканевых ингибиторов металлопротеиназ (ТИМП), что приводит к уменьшению секреции и активности ММП и подавлению вследствие этого фибролиза. В пространстве Диссе формируется патологический коллагеновый матрикс, препятствующий нормальному обмену веществ между кровью синусоидов и гепатоцитами. Фиброз (коллагенизация) в начальных стадиях обратим, но после образования прочных фиброзных септ становится необратимым [20, 28, 52, 68, 87].
Гистологическая характеристика поражения печени при ХГС.
Одной из главнейших задач при морфологической диагностике вирусных гепатитов является установление степени активности и стадии патологического процесса в печени. Морфологические методы исследования биоптата печени позволяют проводить качественный (гистологический,
гистохимический, электронно-микроскопический и др.) и количественный анализ [16, 17, 88]. Количественные (полуколичественные, ранговые) методы включают определение индекса гистологической активности (ИГА) и гистологического индекса степени склероза (ГИС). Впервые система рангового счета разработана в 1981 году R.G.Knodell и соавторами [48]. По критериям R.G.Knodell, с помощью разработанной им балльной системы, определяется ИГА процесса в печени. В зависимости от полученных результатов, устанавливается диагноз хронического гепатита с минимальной (1-3 балла), слабовыраженной (4-8 баллов), умеренной (9-12 баллов) или выраженной (13-18 баллов) степенью активности [43, 46]. Однако эта система включает также и оценку фиброза, который отражает не степень активности, а стадию заболевания. Поэтому V. Desmet и соавторы (1994 г.) рекомендовали не учитывать фиброз в качестве компонента ИГА и предложили несколько иную полуколичественную систему учета степени фиброза при определении стадии хронического гепатита [43]. V.Desmet и соавторы выделяют 4 стадии фиброза печени (по системе R.G.Knodell и соавт. нет 2 стадии фиброза).
До 1994 г. гистологические заключения патологоанатомов нередко различались между собой по суммарной балльной оценке. В этой связи по инициативе T.Poynard ряду ведущих специалистов - морфологов было предложено независимо друг от друга описать одни и те же гепатобиоптаты, полученные от 363 больных ХГС, в соответствии с установленными классификационными требованиями. Впоследствии на основании этих заключений при использовании пошагового дискриминантного анализа и других статистических методов была разработана стандартизированная классификационная система METAVIR (1994 г.). По шкале METAVIR выделяют 4 степени активности некрозовоспалительных изменений в печени (АО - активность отсутствует, А1 - минимальная, А2 - умеренная и A3 -выраженная) и 5 стадий фиброза (F0 - фиброз отсутствует, F1 - портальный фиброз без перегородок, F2 - портальный фиброз с редкими перегородками, F3
- многочисленные перегородки без цирроза, F4 - цирроз). Уровень активности оценивают по интегральному показателю тяжести и интенсивности как ступенчатых некрозов (PMN) так и лобулярных некрозов (LN) [23, 46].
Для более детальной комплексной оценки фиброза печени была предложена модифицированная шкала Ishak, по которой выделяют следующие стадии фиброза: F0 - нет фиброза, F1 - фиброз нескольких портальных трактов, F2 - фиброз большинства портальных трактов, F3 - редкие септы, F4 -множество септ, F5 - с нарушением строения печени, но не цирроз, F6 -цирроз [13].
Фиброз, как зависимый от времени конечный результат. Большинство авторитетных гепатологов в своих работах отмечают, что степень выраженности фиброза (стадия процесса) коррелирует с активностью воспалительных изменений в печени, однако ими же оговаривается, что это не является абсолютной закономерностью. Так T.Poynard (2000) отмечает, что у 36% больных хроническим гепатитом С (178 из 500) по данным пункционной биопсии печени степень активности гепатита не соответствовала выраженности фиброза, и, если бы рекомендации для лечения основывались на степени активности гепатита, то 56% больных не лечились бы, несмотря на значительно выраженный фиброз (119 пациентов с выраженным фиброзом среди 214 пациентов с незначительной активностью гепатита) [72].
Согласно материалам конференции - консенсуса, проведенной в Париже 27 - 28 февраля 2002 года, определение стадии фиброза является ключевым фактором, определяющим прогноз и стратегию лечения. Так как тяжесть течения ХГС в большей степени обусловлена стадией развития фиброза печени (ФП), лечение проводится не только с целью избавления организма от вируса, но и для стабилизации, предотвращения нарушения, и даже улучшения функции печеночной ткани [18]. Так, хронический гепатит с фиброзом печеночной ткани на стадии F2 или F3 по системе МЕТАВИР является показанием к началу лечения, вне зависимости от степени активности
некротического воспаления печени. Для пациентов с фиброзом в стадии F3 и F4 с наличием биохимического ответа (нормализация или значительное снижение уровня трансаминаз) на первичный курс терапии, при отсутствии вирусологического ответа может быть назначена поддерживающая терапия интерфероном (ИФН) для замедления прогрессии заболевания. Для пациентов с хроническим гепатитом легкой степени тяжести (F0 или F1) рекомендуется динамическое наблюдение без проведения лечения, так как при отсутствии отягощающих факторов (ожирение, чрезмерное употребление алкоголя, ВГС -ВИЧ коинфицирование и др.) вероятность прогрессирования низка. Известно, что наличие ФП 3-4 степени в соответствии с полуколичественной системой учета по R.Knodell (1981г.) существенно снижает вероятность успеха противовирусной терапии с 70% до 44% [55].
Наибольшего прогресса в предотвращении развития ФП и формирования ЦП при ХГС удалось добиться за последние 5 лет, когда в широкую клиническую практику были внедрены эффективные методы противовирусной терапии (генно-инженерные интерфероны, комбинированная терапия интерфероном и рибавирином, пегилированные интерфероны в комбинации с рибавирином). Однако, даже применяя наиболее эффективную комбинированную терапию для лечения ХГС, удается добиться устойчивого ответа в среднем в 70% случаев, а при генотипе 1 HCV - в 42% случаев.
Изучение скорости развития фиброза при гепатите С является главным интересом клиницистов. По данным Poynard Т. (2000) можно предполагать, что существует условно 3 варианта прогрессии фиброза печени: быстрый (10 и менее лет), средний (около 30 лет) и медленный (более 50 лет) [72]. Полученные автором результаты говорят о том, что у не леченых пациентов среднее количество лет жизни от момента инфицирования до развития цирроза составляет 30, при этом у 33% больных ожидаемое время развития цирроза составляет менее 20 лет, а у 31% больных можно ожидать развитие цирроза через 50 и более лет. Эти 3 варианта прогрессии удалось установить на
группе пациентов с известной длительностью инфицирования (п=П57), выполнив парные биопсии печени с разными по времени интервалами. Но большинством исследователей приводятся данные о том, что темп развития фиброза не является постоянной величиной [35, 56, 70]. Считается, что основными факторами прогрессии фиброза являются: возраст на момент инфицирования, злоупотребление алкоголем (50-80 и более грамм в пересчете на чистый этаноловый спирт в сутки) в течение нескольких лет, мужской пол. Роль других, обсуждаемых в научной литературе, факторов (способ инфицирования (например, гемотрансфузии), генотип вируса, длительность инфицирования, вирусная нагрузка, нагрузка железом и др.) не доказана [35, 56, 57].
Роль пункционной биопсии печени в диагностике фиброза. На современном этапе ПБП считается "золотым стандартом" для диагностики фиброза печени у больного хроническим вирусным гепатитом С. Пункционная биопсия печени с последующим морфологическим исследованием пунктата проводится для определения степени активности гепатита, стадии процесса (степени выраженности фиброза), исключения альтернативных диагнозов или выявления дополнительных патологий, а также для того, чтобы оценить эффективность противовирусной терапии. Гистологическое исследование печени служит единственной возможностью точного подтверждения хотя и компенсированного, но уже сформировавшегося цирроза печени, позволяет определить исходное состояние печени до лечения и прогноз течения ХГС и ответа на противовирусную терапию [8, 55].
Более чем в 50% случаев во всем мире показанием для пункционной биопсии печени является хронический гепатит С [26, 75]. К сожалению, пункционная биопсия, оставаясь "золотым стандартом" определения стадии фиброза, все-таки является инвазивной методикой с определенным процентом осложнений вплоть до летальных (по данным ряда исследований количество
летальных случаев варьирует от 0 до 3,3 на 1000) [39, 72] и, по мнению некоторых авторов, обладает сомнительной информативностью для определения показаний к противовирусной терапии [34, 74].
Риск, связанный с процедурой пункционной биопсии печени.
В исследовании Gadranel J-F (2000) приводятся данные анализа 2084 процедур ПБП, проведенных в 89 медицинских центрах Франции в течение 12 месяцев 1997г [26]. У 54% обследованных поводом для ПБП послужил гепатит С. В 20% случаев регистрировались умеренно выраженные боли после процедуры, у 3% пациентов боли были значительными и потребовалось проведение внутривенной анальгезии с последующей госпитализацией (в случаях, когда биопсия проводилась амбулаторно). Среди осложнений лидировали вазо-вагусные эпизоды (39 пациентов-2%) с 4 коллапсами, потребовавшими применения атропина. Серьезные осложнения имели место у 12 пациентов (0,57%), но без летальных исходов. К серьезным осложнениям были отнесены: 1 случай гемоперитонеума, билиарный перитонит в 3 случаях, 1 пневмоторакс и в 3-х случаях были пунктированы другие органы. Пункция других органов при ПБП происходит в 0,01 - 0,1%. Это может быть пункция толстой кишки, почки, желчного пузыря, легкого с пневмотораксом, плевральным выпотом и подкожной эмфиземой [54]. Частота осложнений возрастала с количеством пассов биопсийной иглой (26,6% из полученных осложнений при одном пассе и 68% при двух и более). Дополнительные пассы проводились из-за того, что не был получен пригодный для исследования материал. В 1,5% случаев при выполнении ПБП полученный биологический материал был непригоден для диагностики, несмотря на количество пассов. С другой стороны частота осложнений зависела от опыта проводившего биопсию доктора: 34,4% осложнений у начинающих и 27,4% - у более опытных. При опросе пациентов после проведенной процедуры, 9% лиц заявили, что никогда более не захотят вновь подвергнуться биопсии печени. При обсуждении полученных результатов авторы приводят данные
аналогичного исследования, проведенного в Швейцарии в 1992 году и приходят к выводу, что частота осложнений сопоставима в двух исследованиях, однако в Швейцарии 0,3 % серьезных осложнений включали летальные исходы.
На такие осложнения как боль, вазовагусные эпизоды, летальный исход вследствие существенных кровотечений при ПБП указывают в своих работах и другие авторы [39, 60].
Описан летальный случай от кровотечения из псевдоаневризмы артерии после ПБП, который демонстрирует, что даже при подробном обследовании пациентов перед ПБП невозможно предугадать осложнения [22].
Биопсия печени имеет ряд абсолютных и относительных противопоказаний. Биопсия противопоказана при тяжелой коагулопатии, тромбоцитопении, увеличении времени кровотечения, эхинококкозе печени, гемангиоме и опухолях печени, а также при отказе пациента от проведения данной манипуляции. Относительными противопоказаниями для проведения ПБП являются: выраженный асцит, правосторонний плеврит, холангит.
Ценность биопсии ограничивается вариабельностью получаемого образца ткани печени, так как, несмотря на то, что гепатит - это диффузное заболевание печени, доля фиброзной ткани в исследуемом образце может не соответствовать доли фиброзной ткани в печени в целом.
Большинство исследователей считают, что для того, чтобы точно определить степень выраженности фиброза, необходим биоптат длиной не менее 10 мм и наличие в исследуемом образце не менее 6 портальных трактов [13, 18, 19, 25, 72]. По данным G.Colloredo, биоптат длиной 1 см содержит 6,4+/-0,1 портальных тракта; 1,5 см -10,4+/-0,2; Зсм -22,4+\-0,4 (50). Автор считает, что оптимальными для правильной оценки фиброза следует считать размеры биоптата длиной не менее 1,5см (лучше - 3 см), при минимальном диаметре биопсийной иглы 1,4 мм (лучше 1,6 мм) [13, 27].
К сожалению, существует возможность так называемой "ошибки
попадания", когда биопсийная игла попадает в участок ткани с менее или, наоборот, более выраженными изменениями, чем в целом в печени. В работе Regev (2002 г.) показано, что образцы, взятые из левой и правой доли печени (п=124) различаются гистологически по степени воспаления на 1 единицу у 24,2% и на 2 единицы - у 1,6% пациентов, а по стадии фиброза у 33,1% и 2,4% больных соответственно. У 14,5% больных в одной доле печени диагностирован цирроз печени, в то время как в другой доле - фиброз 3 стадии. Межисследовательские различия при повторной оценке степени воспаления одним и тем же морфологом на 1 и 2 единицы составили 0% у первого морфолога и 4% у второго морфолога, а в стадии фиброза - 6% и 10% соответственно [73].
Необходимо отметить, что нередко для оценки прогноза заболевания и эффективности лечения существует необходимость повторных биопсий в течение жизни одного больного [2].
Диагностика фиброза с помощью биохимических методов.
В работе исследователей из США (Saaden S. et al. 2001 г.) представлен анализ клинико - лабораторных показателей больных гепатитом С, позволивший авторам у значительного количества пациентов предположить или отвергнуть цирроз печени еще до получения результатов морфологического исследования пунктата печени. В данном исследовании была применена классификационная (дискриминантная) счетная шкала Bonacini с использованием 3 параметров: количества тромбоцитов, протромбинового времени и соотношения АЛТ/АСТ (диапазон оценки 0-11 баллов) [75].
Нужно отметить, что в оригинальной работе Bonacini (1997) разработанная шкала показала специфичность 98% и чувствительность 46%. Автором было показано, что средний балл у лиц с гистологически выявленным фиброзом 0-2 составлял 4,3+/-2,0, в то время как с фиброзом 3 - 4 -существенно больше - 7,9 +/- 1,4 (р< 0,0001) [24]. Таким образом, у пациентов
с количеством баллов 7 и более можно с большой вероятностью предполагать фиброз 3-4 без пункционной биопсии печени. На серьезную прогностическую значимость соотношения АЛТ/АСТ и количества тромбоцитов указывают и другие исследователи [31, 37, 42, 67].
В исследовании S. Saaden помимо шкалы Bonacini было введено
несколько дополнительных параметров, из которых наиболее
информативными оказались возраст, значение гамма -
глютамилтранспептидазы (ГТТП) и количество альбумина сыворотки крови. Среднее значение оценки по шкале Bonacini для пациентов с гистологически подтвержденным циррозом было 5,5 +/-1,9, а для пациентов без цирроза - 3,4 +/ 1,5. Ни один из пациентов без цирроза не имел более 7 баллов по шкале Bonacini, и авторы делают вывод о том, что оценка 3 и менее балла позволяет с большой долей вероятности предположить, что у пациента нет цирроза, а оценка 7 баллов и более - с большой вероятностью предположить наличие цирроза. У большинства пациентов в исследовании S. Saaden (85 человек) оценка по шкале Bonacini была в диапазоне от 3 до 7, и только биопсия печени позволила в этой группе уточнить диагноз. У 20,5% в группе пациентов из 122 человек цирроз печени явился неожидаемой гистологической находкой, и, по данным авторов, это как раз та группа пациентов, у которой диапазон оценки по классификационной шкале был в пределах 3-7 баллов. У большинства пациентов точный диагноз можно установить только с помощью биопсии печени, но в то же время приблизительно в 30% случаев можно достаточно точно отвергнуть или поставить диагноз цирроза печени, не прибегая к пункционной биопсии.
Таким образом, возможности пункционной биопсии печени ограничены, с одной стороны, погрешностями в получении материала и в трактовке результатов, с другой стороны - вероятностью серьезных осложнений вплоть до летальных. Кроме того, у ряда пациентов биопсию печени невозможно выполнить, так как имеются противопоказания
(гемофилия, гемангиома, тромбоцитопения, психическая неустойчивость с фобиями и др.).
Все вышеизложенное обосновывает необходимость разработки и внедрения неинвазивных маркеров фиброза с применением тестов, в которых бы использовалась периферическая кровь.
Неинвазивный мониторинг фиброза.
В последние 10 лет опубликовано значительное количество работ, в которых приводятся данные о достижениях в изучении механизмов формирования фиброза и разработке антифибротической терапии [32], а также диагностической значимости сывороточных маркеров фиброза [29, 44, 50, 53, 66, 77, 79, 86, 88]. В основу диагностических тестов для определения степени выраженности фиброза включены методы выявления молекулярных соединений, участвующих в патофизиологии процесса образования внеклеточного матрикса или являющихся активаторами фиброгенеза. Наиболее изученными являются: росттрасформирующий фактор бета, коллаген IV типа (CL-IV), аминотерминальный пропептид коллагена III (РIII Р), гиалуроновая кислота (hyaluronic acid), ММР (металлопротеиназы), и TIMP (ингибиторы металлопротеиназ) [30, 36, 38, 45, 50, 51, 59, 62, 63, 64, 77]. Особенно активно в литературе обсуждается значение повышенного содержания гиалуроновой кислоты (ГК) в диагностике фиброза, что продемонстрировано на примере пациентов с алкогольной болезнью печени и больных хроническим гепатитом С [80, 81, 89]. ГК является полисахаридом большой молекулярной массы и широко представлена в экстрацеллюлярном пространстве. Часть продуцируемой ГК поставляется лимфатической системой в венозную кровь и может определяться в крови иммуноферментным методом. В печени ГК синтезируется звездчатыми клетками и считается фактором, содействующим фиброгенезу. Повышение продукции ГК может отражать индукцию пролиферации звездчатых клеток и синтеза компонентов экстрацеллюлярного матрикса, вызванныю воспалением.
Не меньшее значение в диагностике фиброза и цирроза печени придается такому маркеру, как коллаген IV типа (CL-IV). Коллаген -внеклеточный белок, который образуется в виде внутриклеточной молекулы -предшественника в печеночных звездчатых клетках. Предшественник коллагена, подвергаясь посттрансляционным изменениям, образует молекулы коллагена, а затем фибриллы во внеклеточном матриксе. Образование ковалентных межмолекулярных поперечных связей обеспечивает дополнительную механическую силу коллагеновых волокон. Содержание этих зрелых связей при циррозе печени значительно выше, чем в ткани нормальной печени.
В большинстве исследований, посвященных неинвазивной диагностике фиброза печени, используется комбинация серологических маркеров фиброза, и наиболее часто эта комбинация состоит из ГК, CL-IV и Р III Р. Целью таких исследований, как правило, является выявление корреляции между концентрацией маркеров фиброза в крови и стадией фиброза печени, а также оценка с помощью данных тестов эффективности противовирусной терапии.
В исследовании Murawaki Y (2001 г.) продемонстрирована высокая диагностическая роль концентрации ММР, ГК, а также Р III Р, CL-IV и TIMP для дифференцировки фиброза 1-2 стадии от 3-4 стадии (169 больных хроническим гепатитом С) [61]. В указанной работе авторы показали, что определение ГК имеет наибольшую значимость по сравнению с другими тестами при диагностике фиброза более чем 2 стадии (при уровне cutoff 50 нг/мл чувствительность теста составила 75%, специфичность теста - 80%) и для выраженной степени воспаления (при уровне cutoff 60 нг/мл чувствительность теста составила 77%, специфичность теста - 74%). По результатам исследования авторы делают заключение, что серологические маркеры фиброза, особенно ГК, являются полезными диагностическими тестами для диагностики различных стадий фиброза печени у больных ХГС.
В исследование, проведенное в Швеции (Verbaan Н, 1997 г.), было
включено 119 больных ХГС с выполненной ПБП и анализировалась корреляция между стадией фиброза и концентрацией в сыворотке крови Р III Р и CL - IV [82]. Однако авторами не получено достоверных различий по уровню изучаемых маркеров в крови у больных с различными стадиями фиброза печени несмотря на то, что тенденция к повышению концентраций изучаемых маркеров по мере прогрессии фиброза была зарегистрирована.
В работе китайских авторов (Wang Т. и соавт., 1998 г.) приведен анализ корреляции стадии фиброза печени у 114 пациентов с концентрацией в сыворотке крови маркеров фиброза - ПС, Р III Р, CL-IV и TIMP - 1 [83]. Показано, что уровень изучаемых маркеров статистически значимо коррелировал как со степенью воспаления, так и со стадией фиброза печени (г = 0.610, 0.575, 0.641, 0.606 соответственно), и чем более выраженным в целом было поражение печени, тем выше были показатели концентрации указанных маркеров в крови.
Значительная часть работ посвящена возможности использования неинвазивных маркеров фиброза для оценки антифибротического эффекта интерферона при лечении хронического гепатита С.
В исследовании Fukuzaki Т с соавторами (2000 г.) показано, как менялся уровень концентрации серологических маркеров фиброза ГК, Р III Р и CL-IV у больных ХГС до и после лечения и в зависимости от того, был ли достигнут биохимический и вирусологический ответ на лечение [33]. Результаты исследования показали, что такие маркеры как Р III Р и CL-IV существенно снизились в крови у всех пациентов с нормализацией АЛТ на фоне лечения к концу терапии независимо от вирусологического ответа. Уровень ГК снижался медленнее. Существенное снижение ГК по сравнению с исходными значениями, было достигнуто к 6 месяцу после отмены терапии, и так же было зарегистрировано у всех пациентов с достигнутым биохимическим ответом. Полученные результаты можно трактовать как доказательство прямого противовоспалительного и атифибротического
эффекта терапии, однако, повторные биопсии после лечения в этой работе не проводились, поэтому авторами такого вывода не было сделано.
В работе Ninomiya Т. (1998 г.), также проанализированы результаты определения серологических маркеров фиброза (ГК, Р III Р и CL-IV) у 49 больных ХГС до и после лечения интерфероном и в зависимости от достижения устойчивого ответа на лечение [63]. Наиболее значительная корреляция получена между стадией фиброза и ГК при обследовании больных до лечения (г = 0.607, Р < 0.0001), менее значимая, но достоверная корреляция - между стадией фиброза до лечения и концентрацией РШР ( г = 0.531, Р = 0.0004), и недостоверная - между стадией фиброза и CL-TV (г = 0.241, Р = 0.1062). При оценке результатов лечения достоверное снижение было зарегистрировано только по уровню ГК и лишь у пациентов с устойчивым ответом и регрессией фиброза по данным контрольной ПБП.
В исследовании Mazzoran I. (1998 г.) была проанализирована сывороточная концентрация CL-IV у 57 больных ХГС до лечения, на фоне лечения (ежемесячно) и после полугодового лечения интерфероном (в течение 12 месяцев 1 раз в месяц), а также у лиц контрольной группы [58]. Авторами было сделано два важных вывода: 1. концентрация CL-IV достоверно выше у больных ХГС (133,6+/-93,3 нг/мл) по сравнению с лицами контрольной группы (100,2+/-10,5 нг/мл); 2. степень фиброза коррелирует с концентрацией CL-IV (r=0,68; р < 0,05). Далее авторами было показано, что концентрация CL-IV уменьшалась у всех пациентов на фоне терапии интерфероном. Однако, у лиц с устойчивым ответом на терапию она продолжала оставаться ниже исходной в течение 12 мес последующего наблюдения после отмены терапии, а у лиц с обострением после отмены терапии она быстро возвращалась к уровню, предшествовавшему лечению (139,1+/-100,7 нг/мл). Авторы делают вывод о том, что CL-IV является полезным маркером оценки активности фиброгенеза и что, возможно, интерферон способен уменьшать выраженность фиброза в печени и в отсутствие ингибирования вирусной репликации.
Подобные результаты получены в исследовании японских авторов (Abe S, 2003 г.), где проведено обследование 80 больных ХГС, получавших ИФН-терапию в высоких дозах (10 млн. ЕД через день в течение 24 недель) до лечения, через 1 год и 5 лет после отмены терапии [21]. Уровень РШР и CL-IV снижался у лиц как с вирусологическим (устойчивым) ответом, так и с биохимическим ответом на терапию, и данное снижение сохранялось на протяжении 5 лет у пациентов обеих групп. Полученные результаты позволили авторам сделать дополнительный вывод о том, что высокие дозы интерферона подавляют фиброгенез по крайней мере на 5 лет.
Японские исследователи (M.Yamada, 1998 г.) изучали сывороточное содержание Р III Р, CL-IV и ГК, оценивая диагностическую значимость этих маркеров для определения стадий фиброза у 36 больных гемофилией и хроническим гепатитом С [89]. Полученные результаты сравнивали с заключениями, полученными путем биопсии печени. По результатам морфологии печени были диагностированы следующие стадии фиброза: F0 (п -5), F1 (п - 9), F2 (п - 9), F3 (п - 9) и F4 (п - 4). В результате проведенного исследования получена значительная корреляция стадии фиброза 3-4 с уровнем ГК и CL-IV и не получено корреляции с сывороточным содержанием Р III Р. Все 36 пациентов получили лечение интерфероном в стандартных дозах в течение 12 месяцев, и через 6 месяцев после отмены терапии был оценен эффект лечения и уровень изучаемых маркеров. У пациентов с устойчивым ответом (п=8) содержание всех трех сывороточных маркеров фиброза достоверно снизилось по сравнению с пациентами, не ответившими на терапию. В обсуждении полученных результатов авторы делают вывод, что изучаемые маркеры (CL - IV и ГК) можно использовать для диагностики фиброза 3-4 стадии и оценки эффекта терапии. Р III Р, по мнению авторов, является маркером активного фиброзообразования и отражает активность воспаления и фиброгенеза, но не выраженность фиброза. Похожие результаты опубликованы итальянскими авторами в 2001 году (Giannini Е. и соавт.) [36].
Авторами показано, что уровень Р III Р находится в значительной корреляции с некрозовоспалительными процессами в печени и отражает больше степень воспаления, чем стадию фиброза, что отмечается большинством исследователей.
В исследовании Shimizu I. (2001 г.) показано, что уровень Р III Р и CL -IV коррелирует с концентрацией железа в печени. У пациентов с устойчивым ответом на терапию интерфероном достоверно снижаются как показатели маркеров фиброгенеза, так и концентрация железа в печени [78].
В работе Ueno Т. (2001 г.) описывается группа больных ХГС (п -52) получавших ИФН - терапию [81]. Концентрацию Р III Р, CL - IV и ГК определи до лечения и после окончания лечения (включая период шестимесячного наблюдения после отмены препарата). Результаты сывороточного содержания маркеров фиброза сравнивали с данными морфологии печени до и после лечения. У лиц с устойчивым ответом на терапию отмечено достоверное уменьшение показателей, как степени активности, так и стадии фиброза по результатам ПБП. Степень активности процесса до и после лечения коррелировала с уровнем Р III Р и CL - IV, а стадия фиброза - с концентрацией ГК. В тоже время, в работе Poynard Т, Imbert-Bismut F. и соавт. (2002 г.) при анализе уровня гиалуроновой кислоты у 92 больных ХГС, не ответивших на лечение ИФН, и у 17 лиц с устойчивым ответом на терапию не получено существенной разницы в образцах крови, взятых до лечения и после лечения [71]. Аналогичное заключение о том, что концентрация ГК не уменьшается после курса ИФН терапии у не ответивших на лечение, приводится в работе Granot Е (2001г.), где были проанализированы образцы крови до и после лечения у 55 пациентов [38]. Автор отмечает, что уровень ГК у лиц с устойчивым ответом на терапию и у не ответивши х на лечение не различался, но, с другой стороны, уровень ГК четко коррелировал со стадией фиброза.
В исследовании Leroy V. (2001 г.) определялись концентрации Р III Р и
ГК в сыворотке крови 109 больных, не ответивших на терапию ИФН, не отмечено снижения концентраций изучаемых маркеров после лечения по сравнению с исходным уровнем [50]. Однако в данной группе и не отмечено улучшения гистологии печени после лечения у 75 процентов больных. Полученные авторами результаты указывают на то, что изучаемые маркеры коррелируют с данными морфологии печени, а ИФН - терапия не улучшает гистологию печени у пациентов, не ответивших на противовирусную терапию.
Patel К. (2003 г.) при анализе 76 больных ХГС показал, что концентрация ГК слабо коррелирует со стадией фиброза (г=0,45) до лечения, но существенно ниже у ответивших на лечение по сравнению с группой не ответивших на ИФН - терапию [65]. Эти данные противоречат результатам Koroglu G. и соавт. (2003 г.) [49]. Авторами на 112 больных ХГС показано, что концентрация ГК больше 100 нг/мл регистрировалась у 80,9% лиц с фиброзом 4 стадии (F4). Уровень ГК больше 100 нг/мл соответствует ЦП с 94,4% чувствительностью и 66,6%о специфичностью теста. Концентрация ГК до 60 нг/мл соответствует начальным стадиям фиброза печени с чувствительностью теста - 87,8%о и специфичностью - 65,5%. В заключение авторы делают вывод, что ГК - полезный в клинической практике маркер для диагностики выраженного фиброза печени.
В исследовании Kojima Н. (2001 г.) учитывались результаты лечения у 108 пациентов получивших противовирусное лечение по следующим критериям: биохимический, вирусологический, гистологический ответы и показатели CL-IV и ГК [47]. По результам проведенной биопсии до и после лечения авторы делают вывод о том, что гистологическое выздоровление зарегистрировано только у лиц с полным и устойчивым ответом на терапию. У лиц с биохимическим ответом отмечается улучшение показателей гистологии печени, у лиц с неполным биохимическим ответом или без ответа на терапию зарегистрировано ухудшение показателей гистологии печени или отсутствие морфологических изменений. Авторы отмечают, что уровни ГК и CL-IV
варьировали в зависимости от ответа на интерферон, и показатели маркеров фиброза увеличивались у лиц с прогрессией заболевания. Исследователи делают заключение, что изучаемые маркеры можно применять для длительного мониторирования исходов заболевания у лиц, получающих терапию интерфероном.
Все вышеизложенное демонстрирует значительный прогресс в области изучения фиброза печени за последние годы и позволяет надеяться на методы диагностики, альтернативные инвазивным. Литературные данные позволяют сделать заключение о том, что большинство исследователей считает серологические маркеры фиброза полезным методом мониторирования фиброза печени, методом, с помощью которого можно разграничивать стадии фиброза и оценивать эффект противовирусной терапии [21, 58, 63]. Однако, ряд исследований не подтверждает эти заключения [38, 71, 82]. Кроме того, имеются расхождения в оценке диагностической значимости каждого отдельного маркера и высказываются разные мнения по вопросу о том, что, собственно, отражает тот или иной маркер - степень воспаления, активность фиброгенеза или уже сформировавшуюся стадию фиброза. Это расхождение, отчасти, можно объяснить использованием авторами разных шкал оценки фиброза и различиями в интерпретации стадии фиброза морфологами (межисследовательские различия), возможностью "ошибки образца" печени, полученного при ПБП (достигающей 30% в такого рода исследованиях), а также особенностями применяемых тест-систем (разные производители, различные фрагменты молекул, положенные в основу тест - систем).
Проведенные исследования по оценке диагностической значимости сывороточных маркеров фиброза позволяют сделать ряд заключений. Наибольшее единодушие исследователи проявляют в вопросе о существенной вспомогательной или даже равноценной ПБП роли этих маркеров в оценке эффекта противовирусной терапии. Однако некоторые авторы утверждают, что достоверное снижение уровня маркеров фиброза отмечено только у лиц с
устойчивым ответом на ИФН - терапию [38, 47, 63], в то время как другие отмечают, что это снижение отмечается у всех пациентов с нормализацией уровня АЛТ [33]. Также не вызывает сомнения возможность диагностировать субкомпенсированный цирроз печени с помощью определения концентрации ГК в сыворотке крови больных, однако это в большинстве случаев удается сделать клиницистам без использования этих маркеров [40, 74]. Наименьшее единодушие отмечено в оценке возможности разграничения фиброза 3 стадии от фиброза 1-2 стадии с помощью неинвазивного мониторинга фиброза, что наиболее важно для определения тактики лечения.
При анализе индивидуальных маркеров наибольшие разногласия мы видим по оценке диагностической значимости ГК, а наибольшее единодушие по коллагену IV типа [65].
Совсем мало изучен вопрос о том, как ведут себя маркеры фиброза при естественном течении гепатита, поскольку мало работ описывает динамику этих показателей при естественном течении HCV - инфекции.
Учитывая противоречивость литературных данных, целесообразно дальнейшее изучение этих диагностических маркеров у больных ХГС с различными стадиями фиброза и сравнение этих показателей у больных ХГС, здоровых людей и больных с фиброзом других органов, т.е. с результами тщательно подобранных групп сравнения и контрольной группой. Эта мысль прозвучала в материалах Согласительной конференции по лечению гепатита С (Париж, 2002 г.): «Определение серологических маркеров фиброза печени может стать альтернативой биопсии печени, если их информативность будет подтверждена в клинических исследованиях» [18]. Учитывая все вышеизложенное, нами было предпринято собственное исследование для оценки возможности применения неинвазивных методов диагностики фиброза печени у больных ХГС и циррозом печени с использованием ГК и CL-IV.
ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Клиническая и лабораторная характеристика исследуемых групп
В исследовании Leroy V. (2001 г.) определялись концентрации Р III Р и ГК в сыворотке крови 109 больных, не ответивших на терапию ИФН, не отмечено снижения концентраций изучаемых маркеров после лечения по сравнению с исходным уровнем [50]. Однако в данной группе и не отмечено улучшения гистологии печени после лечения у 75 процентов больных. Полученные авторами результаты указывают на то, что изучаемые маркеры коррелируют с данными морфологии печени, а ИФН - терапия не улучшает гистологию печени у пациентов, не ответивших на противовирусную терапию.
Patel К. (2003 г.) при анализе 76 больных ХГС показал, что концентрация ГК слабо коррелирует со стадией фиброза (г=0,45) до лечения, но существенно ниже у ответивших на лечение по сравнению с группой не ответивших на ИФН - терапию [65]. Эти данные противоречат результатам Koroglu G. и соавт. (2003 г.) [49]. Авторами на 112 больных ХГС показано, что концентрация ГК больше 100 нг/мл регистрировалась у 80,9% лиц с фиброзом 4 стадии (F4). Уровень ГК больше 100 нг/мл соответствует ЦП с 94,4% чувствительностью и 66,6%о специфичностью теста. Концентрация ГК до 60 нг/мл соответствует начальным стадиям фиброза печени с чувствительностью теста - 87,8%о и специфичностью - 65,5%. В заключение авторы делают вывод, что ГК - полезный в клинической практике маркер для диагностики выраженного фиброза печени.
В исследовании Kojima Н. (2001 г.) учитывались результаты лечения у 108 пациентов получивших противовирусное лечение по следующим критериям: биохимический, вирусологический, гистологический ответы и показатели CL-IV и ГК [47]. По результам проведенной биопсии до и после лечения авторы делают вывод о том, что гистологическое выздоровление зарегистрировано только у лиц с полным и устойчивым ответом на терапию. У лиц с биохимическим ответом отмечается улучшение показателей гистологии печени, у лиц с неполным биохимическим ответом или без ответа на терапию зарегистрировано ухудшение показателей гистологии печени или отсутствие морфологических изменений. Авторы отмечают, что уровни ГК и CL-IV варьировали в зависимости от ответа на интерферон, и показатели маркеров фиброза увеличивались у лиц с прогрессией заболевания. Исследователи делают заключение, что изучаемые маркеры можно применять для длительного мониторирования исходов заболевания у лиц, получающих терапию интерфероном.
Все вышеизложенное демонстрирует значительный прогресс в области изучения фиброза печени за последние годы и позволяет надеяться на методы диагностики, альтернативные инвазивным. Литературные данные позволяют сделать заключение о том, что большинство исследователей считает серологические маркеры фиброза полезным методом мониторирования фиброза печени, методом, с помощью которого можно разграничивать стадии фиброза и оценивать эффект противовирусной терапии [21, 58, 63]. Однако, ряд исследований не подтверждает эти заключения [38, 71, 82]. Кроме того, имеются расхождения в оценке диагностической значимости каждого отдельного маркера и высказываются разные мнения по вопросу о том, что, собственно, отражает тот или иной маркер - степень воспаления, активность фиброгенеза или уже сформировавшуюся стадию фиброза. Это расхождение, отчасти, можно объяснить использованием авторами разных шкал оценки фиброза и различиями в интерпретации стадии фиброза морфологами (межисследовательские различия), возможностью "ошибки образца" печени, полученного при ПБП (достигающей 30% в такого рода исследованиях), а также особенностями применяемых тест-систем (разные производители, различные фрагменты молекул, положенные в основу тест - систем).
Проведенные исследования по оценке диагностической значимости сывороточных маркеров фиброза позволяют сделать ряд заключений. Наибольшее единодушие исследователи проявляют в вопросе о существенной вспомогательной или даже равноценной ПБП роли этих маркеров в оценке эффекта противовирусной терапии. Однако некоторые авторы утверждают, что достоверное снижение уровня маркеров фиброза отмечено только у лиц с устойчивым ответом на ИФН - терапию [38, 47, 63], в то время как другие отмечают, что это снижение отмечается у всех пациентов с нормализацией уровня АЛТ [33]. Также не вызывает сомнения возможность диагностировать субкомпенсированный цирроз печени с помощью определения концентрации ГК в сыворотке крови больных, однако это в большинстве случаев удается сделать клиницистам без использования этих маркеров [40, 74]. Наименьшее единодушие отмечено в оценке возможности разграничения фиброза 3 стадии от фиброза 1-2 стадии с помощью неинвазивного мониторинга фиброза, что наиболее важно для определения тактики лечения.
При анализе индивидуальных маркеров наибольшие разногласия мы видим по оценке диагностической значимости ГК, а наибольшее единодушие по коллагену IV типа [65]. Совсем мало изучен вопрос о том, как ведут себя маркеры фиброза при естественном течении гепатита, поскольку мало работ описывает динамику этих показателей при естественном течении HCV - инфекции.
Учитывая противоречивость литературных данных, целесообразно дальнейшее изучение этих диагностических маркеров у больных ХГС с различными стадиями фиброза и сравнение этих показателей у больных ХГС, здоровых людей и больных с фиброзом других органов, т.е. с результами тщательно подобранных групп сравнения и контрольной группой. Эта мысль прозвучала в материалах Согласительной конференции по лечению гепатита С (Париж, 2002 г.): «Определение серологических маркеров фиброза печени может стать альтернативой биопсии печени, если их информативность будет подтверждена в клинических исследованиях» [18]. Учитывая все вышеизложенное, нами было предпринято собственное исследование для оценки возможности применения неинвазивных методов диагностики фиброза печени у больных ХГС и циррозом печени с использованием ГК и CL-IV.
Морфологическая характеристика биоптатов печени больных ХГС
Как видно из представленной данных, сравнительный анализ биохимических показателей крови больных ХГС F1 с ХГС F3 и ХГС F3 с ЦП (А) не выявил существенных различий по среднему уровню активности АЛТ, ACT, ГГТП, ЩФ, соотношения АСТ/АЛТ, значений тимоловой пробы, билирубина, общего белка, альбумина и глобулинов. У пациентов с ЦП (А) по сравнению с больными ХГС F1 выявлены существенно более высокие средние значения активности ACT (161,2+/-28 и 69,4+/-4,4 мкмоль/(мин.л) соответственно, р 0,01), соотношения АСТ\АЛТ (1,2+/-0,2 и 0,6+/-0,03 соответственно, р 0,01), тимоловой пробы (14,4+/-2,2 и 8,1+/-0,4 Ед соответственно, р 0,01). По другим показателям (среднему уровню активности АЛТ, ГГТП, ЩФ, билирубина, общего белка, альбумина и глобулинов) достоверных различий между указанными группами не выявлено.
Как видно из таблицы, у больных группы ХГС F1 по сравнению с группой ХГС F3 не выявлено различий по средним показателям количества эритроцитов (4,8+/-0,1 и 4,9+/-0,1 х 106/пш13, р 0,05), лейкоцитов (7,2+/-0,3 и 6,6+/-0,4х 103/mm3, р 0,05), тромбоцитов (227,5+/-6,8 и 228,9+/-10,7х 103/mm3, р 0,05) и среднему уровню гемоглобина (145,6+/-1,6 и 146,5+/-3,1 G/dl, р 0,05). В тоже время у пациентов с ЦП (класс А) по сравнению с больными ХГС F3 и ХГС F1 достоверно ниже был средний показатель количества тромбоцитов в крови (126,2+/-20,1, 228,9+/-10,7 и 227,5+/-6,8 xloVmm3 соответственно, р 0,01). Доля лиц с тромбоцитопенией (таблица №36) значительно больше среди пациентов с ЦП (А) (63,6%), чем среди больных ХГС F1 (15,9%) и ХГС F3 (12%), р 0,01. У 36,4% (п-3) пациентов с ЦП (класс А) количество тромбоцитов в крови укладывается в значения нормальных показателей, и разграничить ЦП от фиброза стадии F1 и F3 у этих больных по количеству тромбоцитов не представляется возможным.
В группе больных ЦП по сравнению с группами больных ХГС F1 и ХГС F3 (таблица 36) значительно больше доля лиц с гипербилирубинемией (54,5% 4,8% и 4% соответственно, р 0,01) и со сниженным значением протромбинового индекса (63,6% 12,7% и 24% соответственно, р 0,01).
Несмотря на большую долю лиц с повышенными значениями тимоловой пробы, в группе пациентов с ЦП (А) по сравнению с группой больных ХГС F3, увеличение данного показателя было незначительным (на 1-3 единицы) и поэтому существенного диагностического значения не имеет. Таким образом учитывая представленный сравнительный анализ клинических и лабораторных данных можно сделать заключение, что разграничить стадии фиброза F1 и F3 у больных ХГС используя результаты клинико-лабораторного обследования не представляется возможным. У 63,6% больных ЦП (А) диагноз можно установить на основании клинико - лабораторных данных и данных УЗИ. У 36,4% диагноз ЦП (А) можно поставить только при морфологическом исследовании пунктата печени. Морфологическое исследование биоптата печени проведено 92 больным ХГС. Морфологическое исследование каждого биоптата печени проводилось одним патоморфологом с использованием полуколичественных методов оценки в баллах выраженности фиброза или стадии процесса (ГИС) и активности гепатита, т.е. некрозо-воспалительных изменений (ИГА) по двум шкалам (R.G.Knodell и METAVIR). Количество портальных трактов в исследуемых образцах составляло в среднем 7+/-0,3 (от 4 до 17). В зависимости от степени выраженности фиброза в печени были выделены группы: Больные ХГС F1 - 63 пациента (68,5%) Больные ХГС F3 - 25 пациентов (27,2%) Больные ХГС F4 - 4 пациента (4,3%) Пациенты, у которых при морфологическом исследовании ткани печени выявлена стадия фиброза 4 (F4), были включены в группу больных с ЦП (А). При сравнении частоты регистрации составных компонентов ИГА у больных ХГС получены результаты представленные в таблице №38. У больных ХГС F3 достоверно чаще, чем у больных ХГС F1 регистрировались выраженные ступенчатые некрозы (в 48% и 19% случаев соответственно, р 0,01), выраженные внутридольковые фокальные некрозы (в 20% и 6,3% случаев соответственно, р 0,01) и выраженное портальное воспаление (в 36% и 6,3% случаев соответственно, р 0,01). При сравнении средних значений составных компонентов ИГА у больных ХГС F3 и ХГС F1 (таблица №37) выявлены статистически значимые различия по среднему показателю выраженности портального воспаления (3,4+/-0,1 и 3+/ 0,1 соответственно, р 0,05). В целом, активность воспалительного процесса в печени (ИГА) достоверно выше у пациентов с F3, чем у больных с Fl (12,2+/ 0,3 и 9,2+/-0,2 соответственно, р 0,01).
Содержание гиалуроновой кислоты в сыворотке крови пациентов исследуемых групп
Мы сравнили степень активности гепатита (ИГА) и концентрацию CL - IV в сыворотке крови больных ХГС (рисунок 17). Уровень CL - IV в сыворотке крови был достоверно выше у пациентов с ИГА 13-18 баллов (251,2+/-72,5 нг/мл), чем у больных с ИГА 9-12 (134,3+/-7,5 нг/мл, р 0,01) и 4 - 8 баллов (117+/-4,4 нг/мл, р 0,01). У пациентов с ИГА 9-12 баллов концентрация CL -IV была больше, чем у больных с ИГА 1-3 балла, но достоверности не получено. Таким образом, на основании представленных данных можно сделать заключение, что средняя концентрация CL-IV в сыворотке крови больных ХГС достоверно выше у больных с выраженной активностью гепатита по сравнению с умеренной и слабовыраженной степенями воспаления в печени. Кроме того, средняя концентрация коллагена IV типа в сыворотке крови больных ХГС в стадии выраженного фиброза (F3) достоверно выше, чем у больных ХГС со слабовыраженным фиброзом (F1), а у больных ЦП (А) достоверно больше, чем у больных ХГС F3. Концентрации CL-IV более 196 нг/мл позволяет разграничить 3 стадию фиброза (F3) от фиброза 1 стадии (F1) со специфичностью 58,7% и чувствительностью теста 88%. Концентрация CL-IV более 280 нг/ мл позволяет разграничить ЦП от фиброза 3 стадии со специфичностью 88% и чувствительностью теста 100%.
Средний уровень CL-IV у больных ОГС на 1-15 день желтухи достоверно не отличался от этого показателя у больных ХГС F1, ХГС F3 (р 0,05). Средние концентрации CL-IV у больных ОГС как в остром периоде (на 1-15 день желтухи), так и через 6-16 месяцев наблюдения после острой HCV инфекции достоверно не различались.
Считает себя больной с 08.11.00, когда появились слабость, умеренные боли в правом подреберье, плохой аппетит. Со 2 дня болезни присоединились тошнота. На темный цвет мочи пациентка обратила внимание 11.11.00 (3-й день болезни). 12.11.00. заметила желтушность склер и кожи. Во все последующие дни до госпитализации перечисленные симптомы сохранялись. Госпитализирована в ИКБ №1 15.11.00 (на 7 день болезни, 4 день желтухи). При поступлении предъявляла жалобы на слабость, умеренные боли в правом подреберье, тошноту, снижение аппетита, небольшой зуд кожи (появившийся в тот же день). Из эпидемиологического анамнеза известно следующее: в течение 6 месяцев живет в гражданском браке с мужчиной больным ХГС. Средствами механической контрацепции не пользуется. В августе 2000г лечила зубы у стоматолога. Сопутствующих заболеваний нет. Желтухи раньше не было. Состояние больной при поступлении в клинику расценено как среднетяжелое. При осмотре выявлена желтуха, вторичных печеночных знаков нет. Отеков нет. В легких хрипов нет, ЧД 18 в минуту. Тоны сердца ритмичные, шумов нет, ЧСС 76 в минуту, АД 110/70 мм.рт.ст. Живот правильной формы, не вздут, при пальпации мягкий, безболезненный во всех отделах. Печень выступает на 1,5 см. из - под края реберной дуги по правой среднеключичной линии, безболезненна. Селезенка не пальпируется. Асцита нет. Симптомов раздражения брюшины нет. Область почек не изменена, симптом поколачивания отрицательный. Моча темная. Сознание ясное. Симптомов ОПЭ нет. Учитывая сочетание астеновегетативного и диспептического синдромов, темной мочи, желтухи, увеличение печени, данные эпидемиологического анамнеза (половую связь с HCV инфицированным), было предположено наличие у пациентки вирусного гепатита с парентеральным механизмом передачи. Учитывая клинические и эпидемиологические данные, а также наличие гиперферментемии, гипербилирубинемии, обнаружение анти - HCV в сыворотке крови при отсутствии маркеров острой HBV и HAV инфекции, установлен диагноз: вирусный гепатит С. Проводилась базисная терапия, инфузионная терапия в течении 4 дней, per os церукал, полифепан, . Самочувствие больной улучшалось: тошнота исчезла через 2 дня после поступления, зуд кожи и тяжесть в правом подреберье беспокоили в течении 5 дней, аппетит нормализовался через 6 дней после поступления,. Желтуха сохранялась с 16.11.00 по 23.11.00. Состояние расценивалось как удовлетворительное с 23.11.00. Наблюдалась также положительная динамика лабораторных показателей: уровня билирубина и ферментемии. На 23 день болезни пациентка выписана из стационара. При выписке желтуха визуально не определялась, печень выступала на 1,0 см из-под реберной дуги по правой среднеключичной линии, при пальпации безболезненна, уровень билирубина был нормальным (19 мкмоль/л), сохранялось умеренное повышение уровня ферментов (АЛТ 259 мкмоль/(мин.л), ACT 52 мкмоль/(мин.л)). Форма заболевания расценена как среднетяжелая. Больной была предложена ИФН -терапия, от которой она отказалась. После выписки из стационара пациентка наблюдается амбулаторно в Гепатологическом центре в течение 1,5 лет.
Ультразвуковое исследование органов брюшной полости. Печень не увеличена - 9,5x4,2см. Паренхима не изменена. Очаговые изменения не выявлены. Сосудистый рисунок не изменен. Внутрипеченочные протоки не расширены. V. portae - 1см. Желчный пузырь овальной формы, размеры 7,2x2,4см. Стенки уплотнены, не утолщены. Общий желчный проток не расширен - 0,4 см. Поджелудочная железа не увеличена, 2,3x1,2x1,4см. Контуры ровные. Паренхима средней эхогенности. Структура умеренно не однородная. Селезенка не увеличена - 10,2x3,7см. Селезеночная вена не расширена - 0,5см. Заключение: Эхопризнаки хронического холецистита, умеренно выраженных диффузных изменений ткани поджелудочной железы. Для уточнения степени активности воспалительного процесса в печени, стадии болезни больной произведена ПБП 21.08.01. Осложнений не было, самочувствие больной не ухудшалось. Ткань печени, полученная при ПБП, отправлена на гистологическое исследование. Результат гистологического исследования биоптата печени: Хронический активный гепатит. Индекс по Knodell: 6-1-3-1=11, по METAVIR: А2 PMN 1 LN2 F1.
Содержание коллагена IV типа в сыворотке крови пациентовисследуемых групп
Среднее значение предполагаемой давности заболевания у пациентов с ЦП HCV и смешанной (HCV + алкоголь) этиологии составило 11,3+/-0,5 лет и было достоверно больше по сравнению с больными ХГС Fl (3,4+/-0,4 лет) и ХГС F3 (4,1+/-1,3 лет), р 0,01. По данным литературы процесс формирования ЦП у больных ХГС занимает около 20 лет [3]. По данным Poynard (2000 г.) у не леченных пациентов среднее количество лет жизни от момента инфицирования до развития цирроза составляет 30 лет, при этом у 33% больных ожидаемое время развития цирроза составляет менее 20 лет, а у 31% больных можно ожидать развитие цирроза через 50 и более лет [72]. Большинством исследователей приводятся данные о том, что темп развития фиброза не является постоянной величиной и увеличивается с возрастом больного. Одним из факторов, способствующих прогрессии гепатита в ЦП при наличии у больного HCV- инфекции, является злоупотребление алкоголем [35, 72, 76]. В нашем исследовании доля лиц злоупотребляющих алкоголем у пациентов с ЦП была больше, чем у больных ХГС F1, ХГС F3 (38,9%, 4,8%, 16% соответственно, р 0,01).
Лица, употребляющие в/в наркотические средства одинаково часто встречались в группах больных ХГС F1, ХГС F3 и ЦП, но длительность наркотизации у пациентов с ЦП больше, чем у больных ХГС F1 и ХГС F3 (12,5+/-2,2; 3,2+/-0,4 и 5,1+/-1,9 соответственно, р 0,01).
По литературным данным, у большинства больных ХГС, даже на фоне высоких уровней сывороточных трансаминаз (превышение в 5 раз), заболевание может протекать бессимптомно [12, 41]. В нашем исследовании клинические проявления ХГС независимо от стадии фиброза печени, также, были довольно скудными. Жалобы предъявляли 31-36 % больных. По доле лиц с наличием жалоб и тех или иных клинических проявлений группы больных ХГС F1 и ХГС F3 не различались. Сравнительный анализ биохимических показателей (активность АЛТ, ACT, ГГТП, ЩФ, соотношение АЛТ/АСТ, значения тимоловой пробы, билирубина, общего белка, альбуминов и глобулинов) и клинического анализа крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и уровень гемоглобина) больных ХГС F1 с ХГС F3 также не выявил существенных различий, что согласуется с литературными данными [24, 31, 37, 42, 71, 75]. По данным Schuppan, используя биохимический анализ, включающий помимо стандартных биохимических тестов углубленное обследование с определением гаптоглобина и альфа 2 макроглобулина, и применяя дискриминантную шкалу, где определенному набору показателей присвоен определенный балл, называемый "баллом фиброза", исключить или заподозрить стадии фиброза F3 и F4 по шкале METAVIR можно только у 50% больных ХГС. Наиболее важным, по мнению Schuppan, является тот факт, что данный "фиброзный балл" не позволяет оценить динамику фиброгенеза или фибролиза при длительном наблюдении пациента и на фоне противовирусной терапии [76].
Клиническая картина ЦП существенно отличалась от аналогичной у больных ХГС со стадиями фиброза 1 и 3. "Классическая картина" цирроза печени (асцит, печеночная энцефалопатия, "печеночные знаки", желтуха) выявлялась у больных ЦП класса В и класса С по шкале Чайлд - Пью и диагностика цирроза у этих пациентов не представляла труда. В связи с этим мы провели сравнительный анализ клинико- лабораторных данных больных ЦП класса А по шкале Чайлд - Пью и больных ХГС F1 и ХГС F3. В нашем исследовании у 63,6% % пациентов ЦП можно было диагностировать по клиническим, лабораторным данным и при проведении УЗИ печени. У больных ЦП (А) по сравнению с больными ХГС F1 и ХГС F3 существенно чаще встречались астеновегетативный, диспептический, болевой синдромы. Достоверно чаще у больных ЦП (А), по сравнению с пациентами с ХГС F1, ХГС F3 наблюдалась гепатомегалия и спленомегалия. Также у пациентов с ЦП регистрировались незначительная гипербилирубинемия, "вторичные печеночные" признаки, геморрагический синдром, похудание, чего не было отмечено у больных с ХГС F1 и ХГС F3. При сравнениии биохимических показателей пациентов больных ЦП (А) с аналогичными показателями у больных ХГС F3 не было выявлено различий по среднему значению активности АЛТ, ACT, ГГТП, ЩФ, соотношения АЛТ/АСТ, значения тимоловой пробы, билирубина, общего белка, альбуминов и глобулинов. У больных ЦП (А) достоверно ниже был уровень тромбоцитов в сыворотке крови, чем у больных ХГС F1 и ХГС F3. В то же время доля лиц с тромбоцитопенией у пациентов с ЦП (А) составила 63,6 %. Обращает на себя внимание тот факт, что у 36,6 % больных диагноз цирроз печени можно было поставить только при морфологическом обследовании, так как у этих пациентов не было клинико -лабораторных данных и данных УЗИ за диагноз ЦП. Эти результаты согласуются с литературными данными, в которых ряд исследователей пытались предположить фиброз 3 и 4 степени с помощью клинико -лабораторных показателей больных гепатитом С [24, 75]. Так Bonacini, используя три параметра: количество тромбоцитов, протромбиновое время и соотношение АЛТ/АСТ разработал дискриминантную шкалу для разграничения стадий фиброза. Автор показал, что у пациентов с количеством баллов 7 и более можно с большей долей вероятности предположить фиброз 3-4 стадии без пункционной биопсии печени. В работе S. Saaden оценка по шкале Bonacini была в диапазоне от 3 до 7 у 70 % больных и только биопсия печени позволила в этой группе уточнить диагноз. У 20,5% в группе пациентов из 122 человек цирроз печени явился неожидаемои гистологической находкой, и по данным авторов, это как раз та группа пациентов, у которой диапазон оценки по классификационной шкале был в пределах 3-7 баллов.
Таким образом, учитывая представленный сравнительный анализ клинических и лабораторных данных можно сделать заключение, что разграничить стадии фиброза 1 (F1) и 3 (F3) у больных ХГС используя результаты клинико-лабораторного обследования не представляется возможным. У 63,6% больных ЦП (А) диагноз можно установить на основании клинико - лабораторных данных и данных УЗИ, а остальным 36,4% больных диагноз ЦП был установлен только морфологически.
В нашем исследовании морфологическое исследование биоптата печени проведено 92 больным ХГС. У 63 (68,5%) пациентов выявлен фиброз 1 стадии (F1), у25 (27,2%)-F3Hy4(4,3%)-F4.
В целом, это согласуется с результатами других исследователей. Так, Yamada М. по результатам морфологии печени диагностировал следующие стадии фиброза печени: F0- (13,9%), F1 -9 (25%),F2- (25%), F3 - (25%), F4 - (11,1%) [89].
