Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Современные представления об иммунопатогенезе и морфологических особенностях поражения печени при хронических формах HCV-инфекции 12
1.1 .Значение факторов иммунной системы в патогенезе хронического гепатита С 12
1.2. Морфологическая характеристика поражения печени с позиций общепринятых критериев 21
1.3. Особенности клинического течения хронического гепатита С и его исходов с учетом вирусологических характеристик HCV 33
1.4. Иммуногенетическая детерминированность различных клинико-морфологических вариантов хронического гепатита С 36
ГЛАВА II. Способы прогноза течения хронического гепатита С и их критический анализ 38
Собственные исследования
ГЛАВА III. Клиническая характеристика больных и методы исследования 45
3.1 Общая характеристика обследованного контингента больных 45
3.2. Специфическая диагностика HCV-инфекции 51
3.3. Методы исследования иммунного статуса (показатели клеточного иммунитета, содержание цитокинов, фенотипирование антигенов HLA-системы 55
3.4. Методы комплексного морфологического анализа биоптатов печени (световая микроскопия, электронная микроскопия, морфометрический анализ) 57
3.5. Методы статистического анализа полученных данных 59
ГЛАВА 1 У. Результаты морфологического исследования биоптатов печени у больных хроническим гепатитом С 60.
4.1. Световая микроскопия биоптатов печени 60
4.2. Сравнительная оценка стадии фиброза печени с использованием полуколичественных методов и морфометрического анализа 70
4.3. Ультраструктурные изменения синусоидов 75
ГЛАВА V. Оценка показателей иммунного статуса у больных хроническим гепатитом С 82
5.1. Фенотипическая характеристика лимфоцитов и их субпопуляционного состава, маркеров активации лимфоцитов 82
5.2. Патогенетическое значение уровня экспрессии рецепторов интерферонам 87
5.3. Показатели содержания цитокинов в сыворотке крови у больных хроническим гепатитом С и их патогенетическое значение 90
5.4. Распределение антигенов HLA-системы 97
ГЛАВА VI. Влияние клинико-иммунологических и иммуногенетических показателей на интенсивность и темп фиброзирования печени при хроническом гепатите С 103
ГЛАВА VII. Комплексное использование факторов, влияющих на фиброгенез печени, для разработки способа прогноза неблагоприятного течения хронического гепатита С 135.
ГЛАВА VIII. Обсуждение полученных результатов (заключение) 148
Выводы 166
Практические рекоіушндации 168
Список литературы
- Морфологическая характеристика поражения печени с позиций общепринятых критериев
- Методы исследования иммунного статуса (показатели клеточного иммунитета, содержание цитокинов, фенотипирование антигенов HLA-системы
- Сравнительная оценка стадии фиброза печени с использованием полуколичественных методов и морфометрического анализа
- Показатели содержания цитокинов в сыворотке крови у больных хроническим гепатитом С и их патогенетическое значение
Введение к работе
Хронический гепатит С (ХГС) занимает одно из ведущих мест в структуре инфекционной патологии. Сложившаяся во всем мире неблагоприятная эпидемическая ситуация характеризуется неуклонным ростом заболеваемости ХГС во всех возрастных группах, в том числе и у лиц трудоспособного возраста [32, 33, 43, 51, 64, 81, 91, 179, 181].
С клинических позиций актуальность этой проблемы обусловлена отсутствием надежных способов прогноза неблагоприятного течения заболевания и недостаточной эффективностью существующих методов лечения.
Решение указанных задач не представляется возможным без углубленного изучения патогенеза ХГС, в частности, механизмов развития фиброза и цирроза печени.
Исследованиями последних лет показана роль провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в патогенезе хронической HCV-инфекции [1, 59, 80, 93, 125, 133, 134]. Установлено, что прогноз неблагоприятного течения ХГС, в значительной мере, определяется показателями, характеризующими выраженность и темп фиброзирования печени [54, 60, 62, 69, 84, 104]. В то же время, конкретные механизмы этого процесса остаются недостаточно изученными. В частности, при ХГС не определено патогенетическое значение в развитии фиброза печени таких иммунных факторов как цитокины и ростовые факторы. Не менее значимую роль может иметь генетический статус больных ХГС.
С целью совершенствования подходов к ведению таких лиц весьма важной представляется разработка способов прогноза направленности течения этого заболевания.
Все вышеизложенное и явилось основанием для проведения настоящего исследования.
Цель исследования — на основе комплексного изучения ряда иммунологических, иммуногенетических и гистологических данных расширить существующие представления о развитии фиброза и цирроза печени у больных хроническим гепатитом С и разработать более совершенный способ прогноза неблагоприятного течения этого заболевания.
Задачи исследования:
исследовать клинико-биохимические и иммунологические показатели у больных ХГС;
оценить влияние генотипа HCV и вирусной нагрузки на темп и интенсивность развития фиброза печени у больных ХГС;
изучить состояние иммунологических показателей у больных ХГС и оценить патогенетическое значение выявленных нарушений;
установить корреляционные взаимоотношения иммунологических факторов с морфологическими признаками поражения печени у больных ХГС;
изучить характер распределения антигенов HLA-системы у больных ХГС;
разработать способ неинвазивной оценки выраженности фибротических изменений в ткани печени у больных ХГС;
на основании результатов комплексного клинико-лабораторного и морфологического обследования больных ХГС разработать более совершенный способ прогноза направленности течения заболевания;
разработать программу оптимизации диагностики и прогноза направленности течения ХГС.
Научная новизна
Установлена патогенетическая роль цитокиновых механизмов в регуляции фиброгенеза печени при ХГС. Доказано участие уровня экспрессии рецепторов лимфоцитов к а-, р- и у-интерферонам в механизмах развития цирроза печени. Для оценки стадии фиброза печени использован морфометрический (количественный) анализ с определением индекса фиброза с помощью программы Sigma Scan Pro 5,0. Впервые дана характеристика морфологических особенностей ХГС у лиц, инфицированных одновременно несколькими квазивидами HCV. Установлена взаимосвязь интенсивности фиброзирования печени с иммуногенетическими показателями HLA-системы. Впервые для дифференциальной диагностики ХГС и цирроза печени предложено определение в крови уровня инсулиноподобного фактора роста (IGF-1) в крови.
Практическая значимость
Использование морфометрического анализа биопсийного материала ткани печени позволило объективизировать оценку стадии фиброза и усовершенствовать способ разграничения ХГС и цирроза печени. Разработана программа оптимизации диагностики и прогноза направленности течения ХГС. Для практического применения рекомендованы: 1) способ неинвазивной оценки стадии фиброза с помощью определения IGF-1 в крови; 2) способ прогноза быстрого прогрессирования заболевания у больных ХГС; 3) шкала прогноза риска развития тяжелого фиброза и цирроза печени у больных ХГС.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Клинико-биохимические признаки ХГС не коррелируют с тяжестью
морфологического поражения печени.
2. Морфологическая картина ткани печени у больных ХГС
характеризуется преобладанием форм минимальной и слабовыраженной
активности с различной выраженностью фибротических изменений в ткани
печени. Наиболее часто регистрируются гидропическая (89,4%) и жировая (60,2%) дистрофия гепатоцитов; умеренно выраженная лимфо-гистиоцитарная инфильтрация портальных трактов (45,5%); ступенчатые некрозы, захватывающие менее 50% периметра портальных трактов (41,5%), пролиферация клеток Купфера (68,3%). Наибольшая выраженность некрозо-воспалительного компонента в структуре ИГА наблюдается при инфицировании За генотипом HCV.
Применение морфометрического анализа гепатобиоптатов у больных ХГС позволяет объективизировать оценку выраженности фибротических изменений в ткани печени.
Для неинвазивной оценки выраженности фиброза печени при ХГС может быть использовано определение в крови инсулиноподобного фактора роста.
Низкий уровень экспрессии CD 118+ на лимфоцитах периферической крови у больных ХГС ассоциируется с минимальными воспалительными и фибротическими изменениями в ткани печени.
6. Факторами быстрого прогрессирования ХГС являются: наличие
жировой дистрофии гепатоцитов, ультраструктурные нарушения
эндотелиоцитов синусоидов с формированием пресинусоидалыгого блока,
присутствие у пациентов антигенов HLA В7, В27 и Cwl.
Внедрение в практику
Материалы диссертационной работы внедрены:
в работу 4-го инфекционного отделения МЛПУЗ ГБ-1 им. Н.А. Семашко г. Ростова-на-Дону, ряда инфекционных отделений ЦРБ и ЦГБ Ростовской области;
в учебный процесс на кафедре инфекционных болезней РостГМУ Росздрава.
Подготовлены и опубликованы методические указания для инфекционистов и врачей амбулаторно-поликлинического звена «Стандарты диагностики и лечения инфекционных болезней» (Ростов-на-Дону, 2007 г.). Предложена программа оптимизации диагностики и прогноза направленности течения ХГС.
По результатам проведенных исследований поданы заявки на изобретения:
№2005140116 на «Способ дифференциальной диагностики хронического гепатита С и цирроза печени» (с приоритетом от 21.12.2005г.);
№2007145282 на «Способ прогноза быстрого прогрессирования заболевания у больных хроническим гепатитом С» (с приоритетом от 06.12.2007г.)
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на 4-ой Российской
научно-практической конференции «Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики (Москва, 2001г.); 5-ой Российской научно-практической конференции «Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2003 г.); научно-практической конференции «Вирусные гепатиты и ВИЧ-инфекция у подростков» (СПб., 2003г.); 6-ом Российском съезде врачей — инфекционистов (С.Петербург, 2003г.); Европейском конгрессе патологов (Словения, 2003 г.); научной конференции Российской академии Естествознания «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Сочи, 2003 г.); 11-й общероссийской научной конференции с международным участием «Естествознание на рубеже веков» (Сочи; Дагомыс, 2003г.); IV научной сессии РостГМУ (Ростов-на-Дону, 2004г.); I конференции врачей общей практики Южного федерального округа (Ростов-на-Дону, 2004г.); научной конференции Российской академии Естествознания «Успехи современного . естествознания» (Дагомыс, 2004г.); южнороссийской научно-практической
конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии Юга России» (Геленджик, 2005г.), Европейском конгрессе патологов (Париж, 2005г.), заседаниях Ростовской областной научно-практической ассоциации инфекционистов (Ростов-на-Дону, 2001-2007г.г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 научных работ.
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 210 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, 5-ти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, приложений и библиографического указателя, содержащего 194 отечественных и 157 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 35 таблицами, 29 рисунками и 6 клиническими примерами.
Базой выполнения диссертационной работы явились: кафедра инфекционных болезней РостГМУ Росздрава (зав. кафедрой д.м.н., профессор Ю.М. Амбалов); ГУЗ «Ростовское областное патологоанатомическое бюро», Ростовский филиал (зав.- к.м.н. Ю.Г. Кириченко); МЛПУЗ «Городская больница №1» им. Н.А.Семашко г.Ростова н/Д (главный врач- заслуженный врач РФ, к.м.н. В.Г. Жданов), лаборатория иммунологии Южного окружного центра МЗ РФ по профилактике и борьбе со СПИДом (руководитель- к.м.н. СР. Саухат), лечебно-диагностический комплекс «Здоровье» (руководитель-И.И.Барановский).
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Морфологическая характеристика поражения печени с позиций общепринятых критериев
Патоморфологическому анализу ткани печени при ХГС посвящены многочисленные исследования [30, 38, 48,54, 79, 92, 94, 97, 107, 149, 154, 159, 189,209,249,260,282,291].
Как известно, в большинстве случаев хроническая HCV-инфекция представлена малоактивными формами хронического гепатита с явным преобладанием дистрофических изменений над некротическими [30, 38,49, 74, 77, 112, 129, 136, 148, 182, 296, 342]. При этом, одним из наиболее частых морфологических признаков является выраженная гидропическая дистрофия гепатоцитов [49, 128, 129, 135].
При анализе частоты обнаружения различных проявлений дистрофического компонента установлено, что у больных ХГС приблизительно в 60-70% случаев регистрируется жировая дистрофия гепатоцитов [61, 128, 129, 219]. Кроме того, установлена прямая корреляционная связь этого морфологического признака с развитием экстрацеллюлярного матрикса [48, 98]. Также было отмечено, что наличие жировой дистрофии гепатоцитов, как правило, ассоциируется с 3 генотипом HCV [175, 257].
Относительно недавно установлена еще одна весьма интересная закономерность. Речь идет о клеточно-инволютивной дистрофии гепатоцитов, являющейся доминирующим морфологическим феноменом при хронической HCV-инфекции. Она характеризуется «опустошением» цитоплазмы, значительным снижением содержания гликогена и гипохромностью ядер [117, 159]. Обнаруживаемые при этом тубулярные и ретикулотубулярные структуры (кластеры мелких везикул с электронно-прозрачным содержимым) могут рассматриваться в качестве патогномоничного ультраструктурного признака HCV-инфекции [97].
Вместе с тем, публикации, касающиеся ультраструктурных изменений печени при ХГС, сфокусированы, главным образом, на изучении популяции паренхиматозных клеток [97, 129]. Однако, с нашей точки зрения, необходима комплексная морфологическая оценка и других структур, в частности, эндотелия синусоидов печени. Такая позиция базируется на данных научной литературы, свидетельствующих об участии эндотелиальных клеток не только в регуляции сосудистого тонуса, но и в развитии иммунного воспаления в ткани печени [166, 167, 168]. Так, по мнению И.С. Фрейдлина и Ю.А. Шейкина (2001), эндотелиоциты могут выступать в качестве мишеней действия вирусов и провоспалительных цитокинов. В свою очередь, возникающие в них структурные изменения могут являться одним из факторов, способствующих прогрессированию заболевания. Между тем, эта сторона патоморфогенеза печени при ХГС практически не изучена.
В ряде работ было показано, что в наибольшей степени, активность воспалительных изменений при ХГС отражают выраженность клеточной инфильтрации и порто-перипортальные (ступенчатые) некрозы [79, 112, 128]. В портальных трактах практически всегда определяется лимфо-гистиоцитарный инфильтрат [49, 79, 129]. Воспалительная инфильтрация довольно редко бывает выраженной как по своей плотности, так и по числу пораженных портальных трактов [98]. «Плотные» инфильтраты, выходящие за пограничную пластинку, регистрируются не более, чем в 10% случаев [49, 129]. Редко встречаются и незначительные очаговые внутридольковые скопления лимфоцитов, отражая, тем самым, слабую выраженность лобулярного компонента [74, 79].
Что касается некротических изменений в ткани печени, то при хронической HCV-инфекции они представлены исключительно ступенчатыми некрозами [49, 137]. Их выраженность, как правило, является весьма умеренной [74, 129].
К числу других морфологических признаков, которые также встречаются при ХГС, могут быть отнесены: активация синусоидальных клеток с образованием «цепочек» лимфоцитов по ходу синусоидов, пролиферация желчных протоков и активация клеток Купфера [41, 49].
Не вызывает сомнений, что при оценке тяжести течения и прогноза хронической HCV-инфекции решающее значение имеет выраженность фиброза ткани печени [165, 249, 261, 282]. Показано, что именно этот фактор, во многом, определяет клинические проявления и исходы хронической HCV-инфекции [145, 271, 298]. Закономерным финалом избыточного фиброгенеза является портальная гипертензия и печеночно-клеточная недостаточность [57, 84, 340].
В последние годы достигнуты большие успехи в изучении молекулярно-клеточных основ и механизмов развития фиброза печени. Общепризнанной является точка зрения о том, что фиброгенез печени является универсальной реакцией, возникающей в результате действия гепатотропных вирусов (HBV, HCV, HDV), а также целого ряда других факторов [79, 85, 112, 119, 146, 165, 200, 212, 294]. По мнению большинства авторов [114, 131, 145], в основе этого процесса лежит нарушение баланса между синтезом и распадом протеинов внеклеточного соединительнотканного матрикса (ВКМ).
Методы исследования иммунного статуса (показатели клеточного иммунитета, содержание цитокинов, фенотипирование антигенов HLA-системы
Определение показателей иммунного статуса и HLA-фенотипирование проводились в иммунологической лаборатории (лицензия МЗ Ростовской области №В-663489) Ростовского лечебно-диагностического комплекса «Здоровье» (руководитель- И.И. Барановский).
Иммунологические исследования включали в себя: 1) определение субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови в тесте с моноклональными антителами; 2) фенотипирование маркеров ранней и поздней активации лимфоцитов: CD3/CD25+, CD3/HLADR+, CD3/HLA95+; 3) определение уровня экспрессии рецепторов к а- и у-интерферонам (CD118+, CD119+) на лимфоцитах периферической крови; 4) определение уровня ЦИК в сыворотке крови; 5) определение концентрации иммуноглобулинов классов А, М и G в сыворотке крови; 6) определение содержания в крови трансформирующего фактора роста (TGF-bl); 7) определение содержания в крови инсулиноподобного фактора роста (IGF-1); 8) определение содержания в крови ИЛ-1 и ИЛ-6; 9) HLA-типирование антигенов сублокусов А, В и С.
Исследование показателей клеточного звена иммунитета проводили с помощью проточного цитофлюориметра EPICS XL (Coulter Corporation, USA) с использованием моноклональных антител CD3+, CD4+, CD8+, CD 16+, CD20+, CD3/CD25+, CD3/HLADR, CD3/CD95+ (АО «Сорбент», НИИ иммунологии МЗ РФ) по методу А.В.Филатова и соавт. (1990). Для определения популяций лимфоцитов, экспрессирующих поверхностные антигенные маркеры CD 118- и CD119-, использовали набор моноклональных антител фирмы Caltag (США).
Уровень ЦИК определяли по методу Haskova et al. (1978) в модификации Ю.А.Гриневич и А.И.Алферова (1981).
Исследование концентрации сывороточных иммуноглобулинов классов А, М и G проводили с помощью специфических сывороток против иммуноглобулина человека (НИИВС им. И.И.Мечникова) методом радиальной иммунодиффузии в геле (Manchini et al., 1965).
За норму указанных показателей иммунного статуса были приняты результаты обследования 20 практически здоровых лиц.
Концентрацию IGF-1 в крови определяли методом ИФА с использованием коммерческой тест-системы «Diagnostic System Laboritories» (USA). Сопоставление результатов изучения уровня TGF-1 в группе больных HCV-инфекцией и здоровых лиц (контрольная группа) осуществляли с учетом возрастной нормы. Для определения уровня TGF в крови использовали тест-систему фирмы «Bio Sourse» (Europe S.A.). Постановку указанных лабораторных тестов проводили в соответствии с инструкциями фирм-изготовителей.
Определение уровня ИЛ-1 и ИЛ-6 в крови осуществляли методом ИФА с использованием тест-систем «Pro ConIL-lb» серия К050 и «Pro ConIL-6» серия К090 (ООО «Протеиновый контур», Россия).
HLA-типирование антигенов сублокусов А, В и С проводили стандартным двухступенчатым микролимфоцитотоксическим методом (Terasasaki Р., McClelland, 1964) с использованием 112 типирующих сывороток, идентифицирующих 23 антигена HLA сублокуса А, 29 антигенов HLA-сублокуса В и 5 антигенов HLA сублокуса С (АО «Гисанс» НИИ гематологии и переливания крови, С.Петербург).
Чрезкожная пункционная биопсия печени осуществлялась под местной анестезией с использованием иглы типа Menghini 123 больным ХГС (из них-25 больным - в динамике с интервалом 1 год) и 5 пациентам с ЦП. Временной интервал между проведением пункционной биопсии и лабораторными исследованиями не превышал 3-4 дней. Осложнений (кровотечение, желчный перитонит и т.д.), связанных с проведением указанной манипуляции и требующих хирургического вмешательства, ни у кого из пациентов не наблюдалось.
Гепатобиоптат делили на 2 части, одну из них- фиксировали в 10% нейтральном формалине на фосфатном буфере и заливали в парафин. Полученные на микротоме «Leica RM-2135» срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также по методу Ван-Гизона и трихромом по Массону для выявления соединительнотканных структур. Вторую часть биопсийного материала, предназначенную для проведения электронной микроскопии, фиксировали в забуференном 2,5% растворе глутарового альдегида с дальнейшим приготовлением ультратонких срезов и окрашиванием осмиевой кислотой по общепринятой методике. В ряде случаев полученный при биопсии образец ткани печени делили на 3 части, одна из которых подвергалась гомогенизации с последующей постановкой ОТ-ГЩР в гепатобиоптате.
Для оценки морфологических данных применяли полуколичественную систему учета активности гепатита (ИГА по R.G.Knodell, 1984) и стадии фиброза (ГИС по V.Desmet, 1994), а также морфометрический анализ с помощью программы Sigma Scan Pro 5,0.
Количественная (морфометрическая) оценка стадии фиброза включала определение площади фиброза и общей площади гистологического препарата в 13-15 срезах гепатопунктата. Индекс фиброза (ИФ) рассчитывали по отношению этих двух показателей. Значения ИФ 0,01-0,02 соответствовали слабому (F1) фиброзу, 0,03-0,06 -умеренному (F2), 0,07-0,2 - тяжелому (F3) и более 0,2 -циррозу печени (F4).
Сравнительная оценка стадии фиброза печени с использованием полуколичественных методов и морфометрического анализа
Известно, что прогноз течения ХГС, в значительной мере, зависит от степени выраженности и темпа прогрессирования фиброза в печени. Для оценки фиброза обычно используются полуколичественные методы исследования. Следует отметить, что даже при достаточно большом опыте клинического морфолога субъективизм такой оценки совершенно очевиден [96, 145, 159]. В качестве альтернативного подхода нами впервые применен морфометрический анализ биоптатов печени с использованием программы Sigma Scan Pro 5,0.
Указанная компьютерная программа позволяет получить результат оценки фибротических изменений в ткани печени пациента как в цифровом, так и графическом вариантах (рис.10).
Комментарий к рис.10: цифровая информация включает количественные показатели площади фиброза и общей площади биоптата в ультратонких срезах изучаемого образца ткани печени. Расчет индекса (коэффициента) фиброза осуществляется по соотношению этих двух показателей. Графическая зависимость представлена двумя вариантами. Один из них отражает отношение площади фиброза к общей площади биоптата, другой — значения ИФ в каждом из исследуемых срезах гистологического препарата.
Полученные при проведении морфометрических исследований данные позволили создать электронную картотеку пациентов с хроническими формами HCV-инфекции. Этот электронный архив используется для обеспечения быстрого доступа к информации о предыдущих исследованиях с целью оценки динамики гистоструктурных нарушений печени у обследованных нами больных.
Установлено, что при отсутствии фибротических изменений в ткани печени (F0) значения индекса фиброза (ИФ) варьируют от 0,001 до 0,009. Слабый фиброз (Fi) характеризуют показатели ИФ 0,01-0,02. При развитии умеренного фиброза (F2) величина ИФ составляет 0,03-0,06. Выраженному фиброзу (F3) соответствуют показатели 0,07-0,2 и циррозу печени (F4)- 0,3 и выше.
В результате сравнительного изучения фибротических изменений в ткани печени у 53 больных хронической HCV-инфекцией с использованием полуколичественной системы учета по Desmet и морфометрического анализа обнаружены достоверные различия в частоте выявления отдельных стадий фиброза (табл. 7). Так, из 19 больных ХГС, у которых на основании полу количествен ной оценки по Desmet было констатировано наличие слабого фиброза, лишь у 7 - это удалось подтвердить морфометрическими данными (р 0,01). В то же время частота светооптического выявления умеренного фиброза оказалась достоверно ниже аналогичного показателя при использовании морфометрического анализа (р 0,01). Аналогичные результаты были получены при сравнении частоты обнаружения цирроза печени.
Сравнительная оценка стадии фиброза у больных хронической HCV-инфекцией по данным полуколичественной системы учета по Desmet и морфометрического анализа
Гистологическое подтверждение цирроза печени с помощью полуколичественной оценки по Desmet оказалось возможным лишь у 4-х из 12 пациентов (р 0,05). Следует также отметить, что в нашем исследовании общая частота совпадений оценки стадии фиброза по данным указанных методов исследования составила 60,4%. В остальных случаях имело место расхождение в оценке выраженности фибротических изменений, как правило, на 1 стадию.
По результатам проведенных исследований были рассчитаны показатели чувствительности, специфичности и точности полуколичественного способа оценки фибротических изменений печени по Desmet. Чувствительность=ИП/(ИП+ЛО)х 100%, где ИП (истинные положительные результаты)-число больных, у которых имело место совпадение оценки стадии фиброза по данным светооптического исследования и морфометрического анализа гепатобиоптата; ЛО (ложноотрицательные результаты)- число больных, у которых оценка стадии фиброза с помощью световой микроскопии оказалась ошибочной (менее выраженный фиброз по сравнению с данными морфометрического анализа).
Специфичность=ИО/(ИО+ЛП)х 100%, где ИО (истинные отрицательные результаты)- число больных, у которых светопотическое исследование гепатобиотата позволило правильно оценить стадию фиброза; ЛП (ложноположительные результаты)- число больных с ошибочной оценкой фибротических изменений печени по данным световой микроскопии (более выраженный фиброз по сравнению с морфометрической оценкой).
Точность=(ИП+ИО)/(ИП+ИО+ЛО+ЛП)хЮ0% Приводим расчеты по полуколичественной оценке стадии фиброза по Desmet: Чувствительность=29/(29+3 8)х 100%=43,2% Специфичность=29/(29+16)х 100%=64,0% Точность=(29+29)/(29+23+3 8+16)х 100%=54,7%
На основании полученных данных нами был рассчитан показатель диагностической информативности (J) морфометрического анализа по формуле Кульбака (Kullbak S., 1967)
Показатели содержания цитокинов в сыворотке крови у больных хроническим гепатитом С и их патогенетическое значение
Полученные данные свидетельствуют о том, что у больных ХГС уровень в крови TGF-lb не зависит от вирусологических параметров возбудителя.
Обращает на себя внимание значительная вариабельность показателей содержания TGF-lb в крови у обследованных нами пациентов с ХГС - от 380 до 2115пг/мл. В нашем исследовании из 44 больных у 19 (43,2%) его концентрация превысила 1000пг/мл.
Учитывая это обстоятельство, мы предприняли попытку проанализировать состояние показателей клеточного иммунитета в зависимости от уровня в крови TGF-lb (табл.16). Из числа обследованных нами больных ХГС были сформированы две группы. В первую - вошли 19 пациентов, в крови которых концентрация TGF-lb превышала 1000пг/мл. Остальные (25 чел.) с уровнем этого показателя ниже указанного значения были включены во вторую группу.
Из приведенных в табл. 16 данных видно, что значительная гиперпродукция TGF-1 b ( выше 1000 пг/мл) ассоциируется с низким содержанием лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры - CD3/CD25+ и CD3/HLADr+, а также - с высокой готовностью клеток к апоптозу. Так, у пациентов с концентрацией TGF-lb, превышающей 1000пг/мл, средний уровень CD3/CD25+ лимфоцитов оказался достоверно ниже, чем во второй группе (8,1±1,5% против 12,8±1,7%, р 0,05). Аналогичная закономерность прослеживалась и в отношении маркера средней активации - HLADr+. Среднее содержание данного типа лимфоцитов у пациентов 1-й группы составило 16,5± 1,4%, 2-й -22.1 ±1,2% (р 0,05). Наряду с этим, наиболее высокий средний уровень клеток, экспрессирующих CD3/CD95+, нами был зарегистрирован у больных 1-й группы -10,8±1,5%, тогда как во 2-й - аналогичный показатель составил лишь 4,2±0,9% (р 0,05).
При проведении корреляционного анализа были получены следующие результаты: выявлена умеренная отрицательная связь между высокой концентрацией TGF-lb и содержанием CD3/CD25+ (г=-0,56), а также - HLADr+ лимфоцитов (г=-0,63). С остальными показателями клеточного иммунитета связь оказалась слабой или отсутствовала вообще.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют об участии TGF-lb в механизмах нарушения регуляторного звена иммунного гомеостаза. В наибольшей степени это проявляется в ингибировании (замедлении) процессов активации иммунной системы. Это позволяет рассматривать высокую концентрацию в крови TGF-lb (выше ЮООпкг/мл) как фактор, определяющий неблагоприятное течение заболевания.
Важным разделом настоящей работы явилось сопоставление выраженности некрозо-воспалительных и фибротических изменений в ткани печени у больных ХГС в зависимости от концентрации в крови TGF-lb (табл.17). ИГА (в баллах) 0, Проведенные исследования показали, что средний показатель ИГА у больных 1-й группы составил 4,4±0,5 баллов, а у пациентов 2-й - 4,8±0,5 баллов (Р 0,05).
Сопоставление степени выраженности фибротических изменений ткани печени у больных сравниваемых групп не выявило достоверных различий (р 0,05). Корреляционный анализ также не позволил нам констатировать статистически значимую связь уровня TGF-1 b крови как с ИГА (г=0,1), так и с ИФ (г=0,2).
Полученные данные свидетельствуют о том, что при ХГС высокий уровень продукции TGF-lb ( 1000пг/мл) в крови не ассоциируется с большей выраженностью фиброза печени. Однако, это не исключает, как нам представляется, активное участие указанного ростового фактора в фиброгенезе на местном (тканевом) уровне.
С целью выявления ассоциаций антигенов HLA-системы с HCV-инфекцией проведен анализ их распределения среди 94 больных ХГС в сопоставлении с региональным контролем - лицами русской национальности (400 чел.), являющимися представителями коренного населения г.Ростова-на-Дону.
Оценку достоверности различий между частотой выявления антигенов HLA-системы у больных ХГС и в здоровой популяции проводили с помощью критерия X". Для определения силы ассоциации между изучаемыми иммуногенетическими признаками и HCV-инфекцией нами был использован критерий относительного риска (RR). При значениях показателя RR 1 мы определяли атрибутивный риск или этиологическую фракцию (EF), которую вычисляли по формуле EF=RR-l/RRxF, где EF-этиологическая фракция, RR- показатель относительного риска, F-частота встречаемости антигена HLA у обследованного контингента больных. Если величина RR была ниже 1, нами проводился расчет превентивной фракции (PF) по формуле PF=( 1 -RR)xF/( 1 -F)xRR+F, где PF —превентивная фракция, RR- показатель относительного риска, F- частота встречаемости антигена HLA у обследованного контингента больных.
Результаты проведенных исследований представлены в табл.18. Наиболее часто в здоровой популяции г.Ростова — на - Дону встречались антигены HLA-A1(23,4%); А2(49,3%); А3(24%); А9(22%); А19(22,7%); В7(21,3%); В35(20%); Cw2(30,7%) и Cw4(42,8%); значительно реже - А28(8%); В 14(6,7%); В 17(8%); В22(3,4%) и Cw6(3,4%).
