Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1.1 Частота и распространенность вирусного гепатита С и наркомании 13
1.2 Клинико-биохимические и морфологические особенности вирусного гепатита С у лиц с сопутствующей наркоманией 18
1.3 Метаболизм ксенобиотиков в печени 20
1.4 Биохимические синдромы поражения печени 24
1.4.1 Цитолитический синдром 25
1.4.2 Холестатический синдром 29
1.4.3 Иммуно-воспалительный синдром ...31
1.4.4 Индикаторы гепатодепрессии, связанные с синтезом белка 31
1.5 Биологические маркеры наркотической зависимости 36
1.6 Характеристика лизосомальных ферментов макрофагов в норме и патологии .36
1.7 Хитотриозидаза - лизосомальный фермент активированных макрофагов 47
1.8 Характеристика препаратов, использованных в экспериментальном исследовании 52
Заключение 60
Глава 2 Материалы и методы исследования
2.1 Общая характеристика больных вирусным гепатитом С 61
2.2 Лабораторные методы исследования 62
2.3 Лабораторные животные 66
2.4 Статистическая обработка результатов 71
Глава 3 Результаты собственных исследований
3.1 Результаты экспериментальных исследований 72
3.2 Результаты клинических исследований 85
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 107
Выводы 117
Список использованной литературы 119
- Клинико-биохимические и морфологические особенности вирусного гепатита С у лиц с сопутствующей наркоманией
- Характеристика лизосомальных ферментов макрофагов в норме и патологии
- Характеристика препаратов, использованных в экспериментальном исследовании
- Лабораторные методы исследования
Введение к работе
Актуальность темы. Особенностью современной инфекционной патологии является возрастающая роль вирусных инфекций, и в частности вирусного гепатита С (ВГС). Для вируса, вызывающего это заболевание, характерна высокая степень адаптации к организму хозяина, которая и определяет его способность к длительной, часто пожизненной персистенции в организме инфицированного (Borrow, 1997). С этим же вирусом связывают развитие цирроза печени (Покровский В.И., 2003; Tillmann H.L. et al., 2001) и гепатоцеллюлярной карциномы (Sharara A.I. et al., 1996; Imai Y. et al., 1998; Heathcote J.A. et al., 2000).
В настоящее время распространение вируса гепатита С поддерживается искусственными путями передачи, среди которых ведущее место занимает фактор наркомании. По данным ВОЗ, гепатитом С инфицировано до 90 % наркоманов (Кожевникова Г.М. и соавт., 1999; Beld М. et al., 1999; Shirin Т. et al., 2000; Gombas W. et al., 2000). Наличие большого числа наркоманов среди инфицированных лиц многократно увеличивает пассаж вируса, что, вероятно, определяет особенности течения гепатита и способствует хронизации уже в ранние сроки от начала заболевания (Толоконская Н.П., 1999). Вероятность неблагоприятного прогноза при вирусном гепатите С (ВГС) с сопутствующей наркоманией усиливается сочетанным действием на печень двух факторов -вирусного и токсического (за счет компонентов наркотика) (Соринсон С.Н., 1998).
Малосимптомное или скрытое течение заболевания создает значительные трудности в клинической диагностике с общепринятых позиций и определяет невозможность дифференцированного подхода к оценке тяжести поражения печени и прогноза заболевания (Шерлок Ш., 1997).
Характер течения ВГС, его тяжесть и исходы в значительной мере зависят от формирования системного ответа, когда реализуется преимущественное направление иммунного реагирования по клеточному, гуморальному типу или
по пути формирования толерантности (Майер К., 1999). К настоящему времени накоплено достаточно данных, свидетельствующих о том, что поражение гепатоцитов во многом опосредуется через непаренхиматозные клетки печени (главным образом клетки Купфера - КК) независимо от пускового механизма, будь это химические токсины, вирусы или иммунные комплексы (Маянский Д.Н., 1992; Фрейдлин И.С, 1998). Таким образом, реактивность КК к флогогенному стимулу во многом определяет характер патологического процесса в печени и важную роль в этом играет секреторная функция макрофагов (Маянский Д.Н., 1992). Большое внимание уделяется поиску адекватных тестов, информирующих о функциональном состоянии клеток ретикулоэндотелиальной системы (РЭС) (Шкурупий В. А., 1999).
В настоящее время изучается лизосомальный фермент хитотриозидаза (XT) как показатель активации макрофагов (Короленко Т.А. и соавт., 2000; Boot R.G., 2001; Rao F.V. et al., 2003). Хитинолитическая активность в сыворотке крови человека впервые обнаружена в 1994 году (Renkema G.H. et al., 1995). Диагностическое значение определение этого фермента показано при болезнях накопления (болезни Гоше, Нимана-Пика, болезни Краббе, GMI-ганглиозидозе) (Бейер Е.М., 2000), при воспалительных заболеваниях нервной системы (Czartoryska В. et al., 2001), атеросклерозе (Artieda М., 2003).
В экспериментальных исследованиях Т.А. Короленко (2000) показано, что введение мышам СВА или крысам Вистар известных стимуляторов макрофагов - зимозана, карбоксиметилированного(1-»3)-|3-глюкана (КМГ) и Тритона WR 1339 сопровождается значительным увеличением в сыворотке крови активности хитотриозидазы. Напротив, их блокада, вызываемая с помощью хлористого гадолиния, подавляет активность фермента. Таким образом, определение активности хитотриозидазы в сыворотке крови может быть использовано при оценке функционального состояния макрофагов.
Известно, что реакция лизосомального аппарата клеток на действие широкого спектра токсических соединений универсальна и сопровождается
лабилизацией мембран лизосом, усилением образования вторичных лизосом и является частью компенсаторно-приспособительных реакций организма на клеточном уровне (Панин Л.Е., Маянская Н.Н., 1987). В связи с этим возможность использования активности XT в оценке токсического поражения печени в экспериментальных и клинических исследованиях представляет определенный теоретический и практический интерес.
Цель работы: исследовать значение активности хитотриозидазы в оценке токсического поражения печени у больных вирусным гепатитом С с сопутствующей опийной наркоманией.
Задачи исследования.
Исследовать биохимические и морфологические изменения печени, а также возможность их коррекции стимуляторами макрофагов - Украином, Реафероном, карбоксиметилированным(1-»3)-|3-В-глюканом и депрессором макрофагов - хлористым гадолинием на биологической модели острого токсического гепатита, вызываемого системным введением ацетаминофена.
Выявить изменения активности лизосомального фермента макрофагов — хитотриозидазы при поражении печени, обусловленном ацетаминофеном у экспериментальных животных.
Провести сравнительный анализ цитолитического, холестатического синдромов и показателей белковосинтетической функции печени у больных с вирусным гепатитом С и при сочетании его с опийной наркоманией.
Оценить активность лизосомального фермента хитотриозидазы, как показателя активации макрофагов печени, у больных вирусным гепатитом С и вирусным гепатитом С с наркоманией.
Научная новизна.
В экспериментальных и клинических исследованиях впервые показана значимость определения активности хитотриозидазы в оценке токсического поражения печени. В эксперименте на животных впервые обнаружено, что развитие токсического гепатита, вызванного введением ацетаминофена,
сопровождается повышением активности хитотриозидазы и, следовательно, активацией макрофагов печени, что косвенно свидетельствует об иммуноопосредованном характере поражения гепатоцитов. Кроме того, установлено, что стимуляция макрофагов печени, вызванная введением карбоксиметилированного(1-»3)-|Н>глюкана, Реаферона и Украина, предотвращает развитие острого токсического гепатита на введение ацетаминофена. Иммунноопосредованный характер повреждения гепатоцитов косвенно подтверждается и корригирующим эффектом реаферона, причем гепатопротективный эффект сочетается со снижением активности хитотриозидазы по сравнению с группой нелеченных животных.
В клинических исследованиях выявлены особенности макрофагальной реакции (по активности хитотриозидазы) у больных ВГС с сопутствующей наркоманией. В этой группе пациентов впервые установлено значительное повышение активности хитотриозидазы независимо от стадии наркотической зависимости (ремиссия или абстиненция) и наличия синдрома цитолиза. Напротив, при вирусном гепатите С без наркомании в случаях отсутствия цитолиза активность XT остается в пределах нормы. При наличии цитолитического синдрома активность XT была достоверно выше, чем в контроле, но значительно ниже, чем в соответствующей подгруппе наркоманов. Таким образом, повышение активности хитотриозидазы в сыворотке крови позволяет дифференцировано подходить к оценке тяжести поражения печени у пациентов при отсутствии клинической симптоматики и биохимической активности процесса и предположить наличие дополнительного токсического фактора.
Повышение активности аі-протеазного ингибитора (сс1-ПИ) выявлено у всех пациентов с ВГС, не зависимо от наличия цитолиза и наркомании. В подгруппе наркоманов в стадии абстиненции с цитолизом наименьшее значение аі-протеазного ингибитора сочеталось со снижением концентрации общего белка и альбумина, что, вероятно, связано, как с подавлением
острофазного ответа, так и с нарушением белковосинтетической функции печени наркотиками кустарного производства.
Практическая значимость. Результаты исследования дополняют теоретические представления о механизмах повреждающего действия опиатов кустарного производства на клетки печени при вирусном гепатите С. Учет активности хитотриозидазы в сопоставлении с общепринятыми методами исследования дает возможность дифференцированного подхода к оценке тяжести поражения печени у пациентов при отсутствии клинической симптоматики. Повышение активности XT, как в экспериментальных, так и клинических исследованиях свидетельствует об универсальности лизосомальной реакции макрофагов в ответ на повреждение печени независимо от его природы, что делает приоритетными патогенетические подходы к терапии инфекционных заболеваний.
Результаты работы включены в лекционный курс по инфекционным болезням для студентов НГМА, а также в цикл лекций на кафедре усовершенствования врачей г. Новосибирска.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Ацетаминофен вызывает не только прямое, но и иммуноопосредованное
поражение гепатоцитов, что косвенно подтверждается значительным
повышением активности хитотриозидазы. Введение экспериментальным
животным стимуляторов макрофагов (карбоксиметилированного(1-»3)-|3-0-
глюкана, Украина и Реаферона) (по данным биохимического и
морфологического исследования) предотвращает развитие острого
токсического гепатита. Корригирующий эффект Реаферона сопровождается
снижением активности хитотриозидазы по сравнению с группой нелеченных
животных.
2. У больных ВГС с сопутствующей наркоманией установлено
значительное повышение активности хитотриозидазы, независимо от стадии
наркотической зависимости (ремиссия или абстиненция) и наличия синдрома
цитолиза. При вирусном гепатите С без наркомании и цитолиза активность XT оставалась в пределах нормы и незначительно повышалась только при наличии цитолитического синдрома. Таким образом, даже при отсутствии клинических проявлений и биохимической активности процесса повышение активности хитотриозидазы может свидетельствовать о глубоком, вероятно, токсическом поражении печени.
3. Повышение активности аі-протеазного ингибитора выявлено у всех пациентов с ВГС независимо от наличия цитолиза и стадии наркомании. В подгруппе наркоманов в стадии абстиненции с цитолизом значительно меньшее повышение активности ссі-протеазного ингибитора (по сравнению с другими подгруппами) сочеталось со снижением концентрации общего белка и альбумина, что, вероятно, связано с подавлением острофазного ответа вследствие нарушения белковосинтетической функции печени наркотиками кустарного производства.
Внедрение результатов работы в практику. Определение активности XT и осі-ПИ введено в комплекс обследования больных с ВГС и гепатомегалиями не уточненной этиологии на базе МИКБ № 1. Материалы диссертации включены в учебную программу для студентов (лекционный курс и практические занятия), а также в учебный курс повышения квалификации инфекционистов на кафедре инфекционных болезней НГМА.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на рабочем совещании «Лизосомные болезни, модели, терапия» (с международным участием) (Новосибирск, 28-29 сентября, 2000), на IV съезде физиологов Сибири с международным участием (Новосибирск, 2-4 июля, 2002), на Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии» (Томск, 12-13 марта, 2003), на XIII научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 2003); на межлабораторном семинаре НИИ физиологии СО РАМН (Новосибирск, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ (из них 5 - за рубежом; 3 статьи в центральной печати).
Структура и объем работы.
Материал диссертации изложен на 152 страницах печатного текста, содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, обсуждение, выводы, список использованной литературы. Диссертация содержит 12 таблиц и 7 рисунков, 4 микрофотографии. Список цитируемой литературы включает 248 источников, в том числе 138 отечественных и 110 зарубежных авторов.
Автор выражает искреннюю признательность своим научным руководителям д.м.н., проф. Короленко Т.А. и д.м.н., проф. Толоконской Н.П. за неоценимую методическую помощь, постоянную поддержку и консультации, всему коллективу лаборатории клеточной биохимии и физиологии Института физиологии СО РАМН - к.б.н. Жанаевой С.Я., к.м.н. Левиной О.А., к.м.н. Фаламеевой О.В., д.б.н. Лоскутовой Л.В. (лаборатория механизмов регуляции памяти), к.ф.н. Джафаровой О.А. (Институт молекулярной биологии и биофизики). Особую благодарность автор выражает главному врачу к.м.н. Сахаровой Е.Г., зав. лабораторией к.м.н. Курышевой Н.Г., зав. отделением Краси льниковой И.В. и всему коллективу МИКБ №1 за творческую поддержку и дружескую атмосферу.
Работа поддержана грантом Kindermissionswerk (Project 98 0427 002 vk 09198 "Prevention Program for Narcotic Addictions among Youth in Novosibirsk, Russia".
Клинико-биохимические и морфологические особенности вирусного гепатита С у лиц с сопутствующей наркоманией
ВГС в большинстве случаев отличает скрытое течение, в силу чего он часто остается нераспознанным (De Filippi F. et al., 2002). У 82 % больных ВГС протекает малосимптомно, но с длительно сохраняющейся активностью процесса (повышение активности АлТ) (Рейзис, 2003). Лишь у незначительной части пациентов может быть четко прослежен эпидемиологический анамнез, т.е. зарегистрирована дата инфицирования. У 30-40 % и даже 50 % инфицированных ВГС нет никаких указаний в анамнезе на факторы риска (Толоконская Н.П., 1999; Alter H.J., 1996; Alter H.J., Houghton М., 2000). Многие пациенты с ВГС не имеют ярко очерченной клинической картины. Изучение вирусного гепатита С выявило некоторые особенности его течения. По клиническим проявлениям ВГС более однороден, чем гепатиты А, В, D, чаще протекает в легкой, реже - среднетяжелой форме (Игнатова Т.М., 1998; Соринсон С.Н., 1998; Толоконская Н.П. и соавт., 1999; Sharara A.J. et al., 1996). Часто персистенция ВГС растягивается на многие годы по типу медленной «ленивой» инфекции с грозным финишем (Львов Д.К., 1997; Bennejo О., 2000). По данным ряда авторов, ВГС становится хроническим в 70-80 % случаев острой инфекции. Предполагают, что у 30 % пациентов с хроническим гепатитом С в течение 5 лет развивается цирроз печени (Покровский В.И., 2003; Tillmann H.L., 2001). С этим же вирусом связывают развитие гепатоцеллюлярной карциномы - в 20 % случаев (Sharara A.J. et al., 1996; Imai Y. et al., 1998; Heathcote E.J., 2000).
Подразделение болезни на острую и хроническую формы, как принято для многих инфекций, при гепатите С весьма затруднительно (Толоконская Н.П., 1999). Ранняя фаза инфекции у большинства больных (2/3 пациентов) протекает скрыто и ее рассматривают как субклинический вариант острого гепатита (Соринсон С.Н., 1998). В относительно редких случаях манифестного течения острой фазы клинические признаки аналогичны таковым при других вирусных гепатитах. Клинические проявления при ВГС отмечаются приблизительно у 30-40 % больных, но даже у них клиника заболевания скудная (Яхонтова О.И., 1999). Желтуха выявляется только у 15-20 % больных, причем в большинстве случаев при трансфузионном заражении. 25-30 % пациентов с ВГС жалуются на повышенную утомляемость, слабость, отмечается снижение аппетита и толерантности к пищевым нагрузкам. Признаки интоксикации выражены слабо (Соринсон С.Н., 1997,1999).
Морфологические исследования биоптатов печени у пациентов с гепатитом С, осложненным наркотической зависимостью, показали в целом более активное течение сочетанной вирусной инфекции (Непомнящих Г.И. и соавт., 1999). При длительном употреблении наркотических веществ и давнем инфицировании вирусом гепатита обнаруживают выраженный фиброз с образованием порто-портальных и портоцентральных септ с тенденцией к трансформации в цирроз печени (Солодун Ю.В., 1998; Филимонов П.Н., и соавт., 2000).
При электронно-микроскопическом исследовании биоптатов печени опийзависимых пациентов с хроническими гепатитами С и С + В наблюдается умеренный полиморфизм гепатоцитов, часть из которых сохраняет нормальную внутриклеточную структуру, но доминируют клетки с признаками дистрофии. Выявлена тенденция снижения объемной плотности структур гранулярной цитоплазматической сети по сравнению с образцами тканей пациентов без опийной зависимости. При хронических гепатитах Си С. + В в сочетании с воздействием опиатов в гепатоцитах часто имеет место гиперплазия агранулярной цитоплазматической сети, представленная преимущественно полиморфными везикулами или узкими извилистыми канальцами, локализующимися диффузно и лишь в редких случаях относящихся к билиарным полюсам гепатоцитов, что является структурным маркером интенсивного метаболизма чужеродных веществ. Появление гиганских митохондрий может рассматриваться в качестве одной из адаптивных реакций гепатоцитов на токсическое действие опиатов. В пространствах Диссе и интергепатоцеллюлярно обнаружено большое количество коллагеновых фибрилл и резидуальных телец. Феномен коллагенизации пространств Диссе рассматривают как защитный механизм, направленный на предотвращение токсического действия опиатов на паренхиматозные клетки печени (Непомнящих Г.И. и соавт., 1999). За небольшой период наркомании сочетанное действие двух факторов - гепатита и наркотика приводит к ускоренному фиброзу с выраженными склеротическими процессами, характеризующимися 2-3-й стадией хронизации по В.В.Серову (Серов В.В., Севергина Л.В. 1996, 1998; Филимонов П.Н. и соавт., 2000).
Воспалительные заболевания печени можно разделить на две группы (Маянский Д.Н., Урсов И.Г., 1997). В первую входят те заболевания, в основе которых лежит воспаление в ответ на прямое повреждение печени. Прямое повреждение гепатоцитов вызывают гепатотропные яды, лекарства и вирусы. Во вторую группу входят те воспалительные заболевания, которые возникают не от прямого повреждения гепатоцитов, а от сложных реактивных преобразований печеночной ретикулоэндотелиальной системы (РЭС), дающих толчок воспалительной инфильтрации печени. К числу таких форм относятся многие инфекционно-аллергические заболевания, в основе которых лежат диффузные или очаговые мононуклеарные инфильтраты печени (Маянский Д.Н., Урсов И.Г., 1997).
Характеристика лизосомальных ферментов макрофагов в норме и патологии
Характер течения ВГС, его тяжесть и исходы в значительной мере определяются формированием системного ответа, в основе которого лежит «эффекторная» функция цитокинов макрофагального и лимфоцитарного происхождения (Маянский Д.Н., 1992).
При любом варианте повреждения гепатоцитов продукты их деструкции «заряжают на удар» лейкоциты крови, прежде всего - нейтрофилы. Чаще всего их действие опосредуется через РЭС - клетки Купфера (КК) и эндотелий печеночных синусоидов. Любое повреждение печени ведет к активации КК, которые активируют эндотелий (Маянский Д.Н., 1992). Происходит повреждение синусоидальных макрофагов, приводящее к нарушению фагоцитоза и секреции цитокинов. Система непаренхиматозных клеток (НПК) придает печени необходимый «запас прочности», так как синусоидальные клетки не только образуют единую функциональную систему с гепатоцитами, нацеленную на поддержание гомеостаза в стационарных и экстремальных ситуациях, но и детерминируют резистентность печени к вирусному и другим вариантами повреждения, опухолям, воспалению и фиброзам. К тому же она определяет, по какому пути пойдет повреждение и восстановление печеночной ткани. Проблемы синусоидальных клеток активно разрабатываются и регулярно обсуждаются на специальных международных симпозиумах, но достигнутые успехи пока не получили должного резонанса в медицинских кругах. Непаренхиматозные клетки печени (НПК) не просто защищают печень от патогенов, которые по той или иной причине оказались в крови воротной вены, но и активно взаимодействуют с гепатоцитами, участвуя вместе с ними в реализации метаболической, кроветворной, иммунной и регуляторной функций печени. После стимуляции зимозаном и другими флогогенами, или индукторами воспаления, популяция КК возрастает в 4-5 и более раз в течение 5 дней, причем больше КК определяется по ходу воротных вен. В работе показано (Schneider S. et al., 1997), что развитие многих патологических процессов сопровождается нарушением стабильности мембран и выходом кислых гидролаз в цитоплазму клетки, что приводит к дезорганизации метаболических процессов и развитию деструкции. Лабилизацию лизосом и нарушение проницаемости мембран рассматривают как неспецифический компонент реакций клеток на многие виды повреждений (Панин Л.Е., 1987). Лизосомальный аппарат клеток вовлекается в развитие патологических процессов под влиянием различных ядов и лекарств. У больных вирусным и токсическим гепатитом наибольших величин подъем активности кислых гидролаз в сыворотке крови достигает в разгар заболевания и является биохимическим маркером проницаемости лизосомальных мембран (Короленко Т.А., 2000). Одним из факторов, вызывающих повреждение клеточных мембран, в том числе и лизосом у больных вирусным и токсическим гепатитом считают усиление процессов перекисного окисления липидов (Kohler Н. et al., 2002).
Клетки Купфера и эпителиоциты играют решающую роль в очищении крови от многих нативных и модифицированных макромолекул, в том числе белков, глико-, липопротеинов и гликозаминогликанов. КК, как и другие классы макрофагов, легко переходят из одного функционального состояния в другое (Ishiguro Е., 2001). Под влиянием стимулов макрофаги вначале кондиционируются, или примируются (от англ. Priming — грунтовка), приобретая ряд свойств, повышающих их восприимчивость к разрешающему триггеру. Так, например, под действием такого примирующего фактора, как ИНФ-у, усиливается экспрессия Fc-рецепторов, адгезивных белков, 1а-антигенов в мембране макрофага, повышается их способность продуцировать и секретировать лизосомальные ферменты, эйкозаноиды, активные формы кислорода (супероксид О г и другие), IL-1, ФНО-а и другие цитокины (Khandkar D., 1996). Реакция лизосомального аппарата клеток макрофагальной системы на действие широкого спектра токсических соединений универсальна и сопровождается лабилизацией мембран лизосом, усилением синтеза вторичных лизосом и является частью компенсаторно-приспособительных реакций организма на клеточном уровне (Покровский А.А., 1976; Панин Л.Е., Маянская Н.Н., 1987). Материал, фиксированный к мембране, поглощается путем пиноцитоза и собственно фагоцитоза, когда объект захватывается псевдоподиями и погружается внутрь в составе фагосомы. КК извлекают из крови, поглощают и переваривают широкий круг веществ. Этому способствует, с одной стороны, их стратегически выгодное положение «на перехвате» крови, поступающей в печень от кишечника, а с другой - их высокая эндоцитозная активность (Маянский Н.Д., 1992; Mayer К., 2002).
Лизосомы по определению Покровского и Тутельяна - это особый тип цитоплазматических образований, составляющих вакуолярный аппарат клетки и выполняющий наряду с клеточным пищеварением ряд других важнейших функций (Покровский А.А., Тутельян В.А., 1976). Лизосомы представляют собой морфологически и функционально гетерогенную популяцию частиц, образующих вакуолярный аппарат клетки. Они содержат около 40 типов гидролитических ферментов, включая протеазы, нуклеазы, гликозидазы, липазы, фосфолипазы (Kornfeld D., 1989). Вакуолярный аппарат разделяют на три основные группы: прелизосомы, собственно лизосомы (первичные и вторичные) и постлизосомы. Первичные лизосомы (транспортные везикулы) -небольшие органеллы, содержащие вновь синтезированные гидролитические ферменты в неактивной форме, формируются в транс-сети аппарата Гольджи (Luzio J.P., 2001). Существует специфический транспортный механизм, позволяющий селективно «отсортировать» кислые гидролазы лизосом от множества других ферментов, синтезирующихся в эндоплазматическом ретикулуме.
Характеристика препаратов, использованных в экспериментальном исследовании
Синонимы - парацетамол, доламин, калпол, тайленол, эффералган, доланекс, колдрекс, фервекс (Гаевская Л.В., 1997). Нестроидные противовоспалительные препараты по частоте назначения относятся к наиболее применяемым лекарствам: по данным ВОЗ их назначают 20 % стационарных больных. Парацетамол-индуцированные печеночные некрозы - наиболее распространенная форма токсических поражений печени в клинической практике в США и Великобритании (Simpson K.J. et al., 2000). Имеется большой риск развития некроза печени при использовании препарата в дозе 150 мг/кг для детей и 10 г для взрослых. Алкоголь, индуцируя ферменты, усиливает гепатотоксичность АцФ, так что у больных алкоголизмом повреждение печени может развиться при ежедневном приеме лишь 4-8 г препарата, а при сопутствующем заболевании печени - при приеме еще меньшей дозы (Шерлок Ш., 1999). Острая печеночная недостаточность возникает в 1-5 % случаев передозировок парацетамола через 3-6 дней от начала приема препарата. АцФ ингибирует печеночную N-ацетилтрансферазу in vitro и in vivo (Rothen J.P. et al., 1998). Механизм АцФ индуцированной токсичности включает в себя нарушение ряда биохимических путей: истощение глутатиона гепатоцитов, ковалентную модификацию белков-мишеней, кислородный стресс, нарушение кальциевого гомеостаза; также хромосомные аберрации (Lores - Arnaiz S., 1995; Hinson J. A. et al., 2000; Dimova S. et al., 2000; James L.P., 2003). Токсичность АцФ обусловлена взаимодействием его реактивного метаболита N-ацетил-р-бензоквинона с белками плазмы крови и снижением уровня глутатиона в гепатоцитах (Pang K.S. et al., 1995; Matthews A. M, 1996; McCloskey P., 1999). В эксперименте на животных выявлено общее снижение глутатиона на всем протяжении опыта после назначения АцФ. Максимальное снижение (до 83 %) обнаружено через 60 мин после инъекции. В опытах на мышах показано, что увеличение концентрации печеночного глутатиона оказывает защитный эффект при передозировке АцФ (Mirochnitchenko О. et al., 1999). АцФ метаболизируется и обезвреживает с помощью глутатиона гепатоцитов. При передозировке АцФ глутатион гепатоцитов истощается, и метаболиты ковалентно связываются с цистеиновыми остатками белков, образуя 3-(цистеин-8-ацетил)ацетаминофен, который является высоко токсичным продуктом (Pang K.S. et al., 1995; Hinson J. A. et al., 1995). В процесс вовлекаются следующие цитохромы: ЗА4, 2Е1, 1А2 и 1А1. Печень и почки являются основными мишенями для действия АцФ. Также в экспериментах на животных был выявлен некроз бронхиального эпителия (клеток Клара) у мышей после приема токсических доз АцФ, вследствии активации цитохрома Р 450 и простагландин-Н-синтетазы. Пневмоциты II типа синтезируют и секретируют сурфактант, контролируют, возможно, метаболизм многих ксенобиотиков (Dimova S. et al., 2000). Большое значение в развитии цитотоксичности играет кислородный стресс (Lores-Arnaiz S., 1995; O Brien P., 2000). Предварительное назначение крысам супероксиддисмутазы снижает токсический эффект АцФ (Mirochnitchenko О. et al., 1999).
Синусоидальные клетки также являются мишенью ацетаминофеновой цитотоксичности (De Leve L.D. et al., 1997). Показано, что активация клеток Купфера (и других макрофагов) снижает токсичность АцФ (Blazka М.Е. et al., 1996; Goldin R.D. et al., 1996; Michael S.L., 1999). Известно, что активация клеток Купфера способствует повышению синтеза оксида азота и супероксида (Thummel К.Е. at al., 1993; Xia Y.,1997; Hinson J.A., 2000). Полагают, что в гепатоцитах АцФ активированные метаболиты реагируют с глутатионом двумя способами: в форме коньюгатов глутатиона (глюкуронидов) с одной стороны и образованием дисульфида с другой (Jack A. et al., 1998; Kim Y.C., 1998; Nickolls- Grzemski F. A., 2000).
Наиболее рациональной в настоящее время является терапия, обращенная к саморегуляции в соответствии с биологической направленностью защитных сил организма (Толоконская Н.П., 2000). Актуальной задачей современной медицины является развитие новых подходов к терапии хронических инфекционных заболеваний, предполагающих как одно из направлений разработку патогенетически обоснованных принципов создания лекарственных форм и схем лечения, направленных на повышение естественной резистентности организма путем использования этиопатогенетических средств с адресной доставкой в клетки системы мононуклеарных фагоцитов (Шкурупий В.А., 2000). Для клинической медицины перспективно изучение механизмов защитного действия иммуномодулирующих препаратов, таких как карбоксилированный (1-»3)-Р-0-глюкан, Украин, Реаферон.
Реаферон. Препараты интерферона являются основными средствами для лечения ВГС. В клинической практике обычно используют интерферон, полученный из культуры лейкоцитов, либо рекомбинантный (Соринсон С.Н., 1998).
Препарат Реаферон получен при культивировании бактериального штамма Pseudomonas, содержащего в своем генетическом аппарате встроенную рекомбинантную плазмиду гена ИНФ-СС2 человека. Этот белок по своей первичной последовательности соответствует человеческому природному ИНФ-осг.. Рекомбинантный ИНФ, как и природный, не гликозилирован, так как не содержит гликозилирующихся аминокислотных последовательностей (Asp-xhr или Asp-x-Ser). У рекомбинантного ИНФ отсутствует дополнительный остаток Met- на N-конце молекулы, кодон которого служит для инициации белкового синтеза. Реаферон имеет молекулярную массу 18-18,5 кДа, не соответствующую величине, расчитанной на основе известной аминокислотной последовательности (Ершов Ф.И., 1996).
Эффективность ИНФ в настоящее время определяется биохимически как нормализация уровня АлТ в сыворотке крови больных и вирусологически - по исчезновению РНК вируса из биологических сред (Майер 1С, 1999). Обычная терапевтическая доза а-интерферона составляет 3 млн Ед 3 раза в неделю (Париж, 1999). Агрессивный характер терапии, заключающийся в увеличении дозы и продолжительности курса лечения (до 1-3 лет), в ряде случаев связан с ее неэффективностью (Толоконская Н.П., 1999).
Лабораторные методы исследования
Инфицирование вирусом гепатита С является одной из ведущих причин заболеваемости и смертности в мире. Новосибирск относится к числу регионов с высоким уровнем распространения вирусного гепатита С (Толоконская Н.П.,, 1999; Шустов А.В., 2000).
На раннем этапе изучения инфекции исключительное внимание уделяли посттрансфузионному пути передачи, в последние годы ведущее место занимает наркомания (Онищенко Г.Г. и др., 1998; Gombas W., et al., 2000), причем в России растет употребление наркотиков, приготовленных кустарным способом (Букановская Т.И., 1995; Демин А.А. и др., 2002). Среди основных групп наркотиков, вызывающих синдром зависимости, преобладают опиаты, доля которых составляют 92,8 %. Биологическими последствиями химических аддикций являются острые сосудистые мозговые катастрофы, неврологические расстройства, почечная декомпенсация, снижение иммунной защиты и т.д. (Короленко Т.А., 1999), возможно развитие токсической энцефалопатии (Найденова и др., 1993). Хронические заболевания печени с персистирующим повышением уровней трансаминаз в сыворотке диагностируются на клиническом уровне до 50 % - 77 % случаев, до 98 % - по данным аутопсий (Мандель А.И., 2003). Значительное количество (до 90 %) наркоманов, употребляющих препараты внутривенно, заражаются гепатотропными вирусами, некоторые двумя и более одновременно, поэтому все большее значение приобретает многоплановое изучение патологических феноменов наркоманий и ассоциированных с ними соматических повреждений (Логинов А.С., 1999).
ВГС в большинстве случаев отличает скрытое или малосимптимное течение (De Filippi F. et al., 2002). Цитолиз — один из основных показателей активности патологического процесса в печени (Хазанов, 1988). При хроническом гепатите вне обострения гиперферментемия, как правило, отсутствует. Несравнимо большая часть гиперферментемий связана с интоксикацией, чаще алкогольной, реже лекарственной. При анализе биохимических показателей приблизительно у 1/3 пациентов с хроническим гепатитом С уровень АлТ остается нормальным, а у остальных повышение уровня АлТ колеблется в широких пределах (Соринсон С.Н., 1999). Но, как известно, у больных ВГС степень выраженности патоморфологических изменений в печени не предопределяет уровень повышения АлТ в крови (Haber Н. et al., 1995), следовательно, этот тест не является достаточно информативным. Основными маркерами холестаза являются у-глутамилтрасфераза и щелочная фосфатаза. Значение ГТТ и ЩФ многозначно в диагностическом отношении. По крайней мере, 5 процессов повышают их активность: цитолиз, холестаз, интоксикация алкоголем и лекарственными препаратами, опухолевый рост в печени. Таким образом, рутинные биохимические методы неспецифичны и мало информативны в оценке тяжести поражения печени, особенно при ВГС.
Характер течения ВГС, его тяжесть и исходы в значительной мере определяются формированием системного ответа, в основе которого лежит «эффекторная» функция цитокинов макрофагального и лимфоцитарного происхождения. Поэтому в настоящее время большое внимание уделяется поиску тестов, характеризующих функциональное состояние макрофагального звена. Известно, что реакция лизосомального аппарата клеток на действие широкого спектра токсических соединений универсальна, таким образом, определение активности хитотриозидазы в сыворотке крови при оценке функционального состояния макрофагов представляет определенный теоретический и практический интерес.
Актуальной задачей современной медицины является развитие новых подходов в терапии хронических инфекционных заболеваний, предполагающих как одно из направлений разработку патогенетически обоснованных принципов создания лекарственных форм и схем лечения, направленных на повышение естественной резистентности организма путем использования этиопатогенетических средств с преимущественной адресацией к клеткам системы мононуклеарных фагоцитов (Шкурупий В.А., 2000), поэтому исследование активности хитотриозидазы важно и для контроля иммунокорригирующими препаратами.
Исследуемую группу составили 246 мужчин с ВГС, наблюдавшихся в гепатологическом отделении Муниципальной клинической инфекционной больницы № 1 или в Городском наркологическом диспансере г. Новосибирска в период с 1998 по 2001 гг. Клинические исследования проведены совместно с заведующей отделением, врачом высшей категорией Красильниковой И.В. и врачом высшей категорией Чистиной Л.М. Давность инфицирования ВГС составляла от 2 до 6 лет.
Критерием отбора пациентов для настоящего исследования послужило наличие маркеров ВГС. Для исключения других типов гепатита определяли маркеры к вирусу гепатита А (анти-HAV IgM), к вирусу гепатита В (HBsAg, HBeAg, анти-HBsAg, анти-HBcIgM, анти-Hbe), к вирусу гепатита D (анти-HDV) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Дополнительно у 1/3 больных проведено исследование РНК вируса гепатита С методом полимеразной цепной реакции, морфологическое исследование печени (методом пункционной биопсии).
В соответствии с критериями международной систематики МКБ — 10 диагноз больных с наркотической зависимостью формулировался как наркомания, обусловленная систематическим потреблением препаратов опия, синдром зависимости от опиатов, воздержание (ремиссия) или синдром отмены (абстиненция).
Группа контроля (15 человек), сопоставимая с основной группой по полу, возрасту и месту проживания, представлена здоровыми студентами Новосибирска. Сформировать группу контроля из больных наркоманией без ВГС не удалось, так как у всех обследованных нами больных Городского наркологического диспансера были выявлены при дополнительном обследовании маркеры гепатитов В, С или В+С.
