Содержание к диссертации
Введение
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Структурные полисахариды клеточных стенок растений 9
1.1. Строение пектина 11
1.1.1. Основная цепь пектина 11
1.1.2. Боковые цепи пектина 14
1.1.3. Неуглеводные заместители в пектине 15
Глава 2. Биодеградация пектина 17
2.1. Полигалактуроназы 18
2.1.1. Гены, кодирующие синтез полигалактуроназ 19
2.1.2. Структура и механизм действия полигалактуроназ 21
2.1.3. Биохимические свойства энгЬ-полигалактуроназ A. niger 24
2.2. Пектинэстеразы 26
2.2.1. Структура и механизм действия пектинэстераз 27
2.2.2. Влияние различных факторов на активность пектинэстераз 27
2.3. Пектин- и пектатлиазы 29
2.3.1. Структура и механизм действия пектин- и пектатлиаз 30
2.3.2. Биохимические свойства пектин- и пектатлиаз 33
Глава 3. Распространение в природе и использование пектиназ 37
Глава 4. Грибы рода Aspergillus 42
II. Экспериментальная часть
Глава 5. Объекты исследования и методика эксперимента 47
5.1. Материалы 47
5.1.1. Микроорганизмы и условия культивирования 47
5.1.2. Ферментные препараты 47
5.1.3. Субстраты и реактивы 48
5.2. Хроматографическое разделение препаратов и выделение ферментов 49
5.3. Определение концентрации белка 49
5.4. Определение биохимических характеристик ферментов 51
5.5. Методы определения активности ферментов 51
5.5.1. Определение активности к полисахаридным субстратам 51
5.5.2. Определение активности к л-нитрофенильным производным Сахаров 52
5.5.3. Определение пектинлиазной активности 53
5.5.4. Определение пектинэстеразной активности 54
5.5.5. Вискозиметрический метод определения общей пектиназной активности... 55
5.6. Определение кинетических параметров действия ферментов 56
5.7. Изучение зависимостей активности ферментов отрН и температуры 56
5.8. Изучение рН- и термостабильности ферментов 57
5.9. Исследование изменения ММР продуктов ферментативного гидролиза высокомолекулярных субстратов 57
5.10. Проведение гидролиза пектинов под действием ферментов 57
5.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков 58
5.12. Оценка способности ферментов к осветлению яблочного сока 58
5.13. Оценка способности ферментов к увеличению питательной ценности кормов... 59
III. Результаты и их обсуждение
Глава 6. Поиск и создание продуцентов пектиназ 60
6.1. Мутагенез и селекция гриба A. japonicus 60
6.2. Сравнение ферментного состава препаратов на основе исходного и мутантного штаммов A. japonicus 66
6.3. Мутагенез и селекция гриба A. foetidus 72
Глава 7. Выделение гомогенных пектиназ 78
7.1. Выделение пектиназ A. japonicus 78
7.1.1. Очистка полигалактуроназы 81
7.1.2. Очистка пектинэстеразы 82
7.1.3. Очистка пектинлиазы 82
7.2. Выделение пектиназ A. foetidus 84
7.2.1. Очистка полигалактуроназы 85
7.2.2. Очистка пектинэстеразы 86
7.3. Анализ препаратов, niger н выделение основных пектиназ 87
7.3.1. Субстратная специфичность препаратов A niger 87
7.3.2. Аналитическое фракционирование препарата/1. niger 88
7.3.3. Препаративное разделение препарата/1. niger 90
7.3.4. Очистка полигалактуроназ 90
7.3.5. Очистка пектинэстеразы 93
7.3.6. Очистка пектинлиазы 94
Глава 8. Идентификация пектиназ с помощью масс-спектрометрического анализа их трипсиновых гидролизатов 98
Глава 9. Свойства выделенных пектиназ ПО
9.1. Субстратная специфичность и кинетические параметры действия ферментов 110
9.2. Влияние температуры и рН на активность и стабильность пектиназ 116
9.3. Изучение механизма гидролиза пектинов под действием полигалактуроназ и
пектинл иаз 125
Глава 10. Взаимодействие ферментов при действии на пектины 130
10.1. Явления синергизма и антагонизма в системах полигалактуроназа пектинэстераза и пектинлиаза : пектинэстераза 1
10.2. Глубокий гидролиз пектинов 132
10.2.1. Гидролиз пектинов под действием индивидуальных пектиназ 133
10.2.2. Гидролиз пектинов под действием исходных препаратов Aspergillus 138
10.2.3. Взаимодействие пектиназ (PG 38 Af, РЕ А/и PL Aj) при глубокой деструкции пектинов 140
10.2.4. Взаимодействие пектиназ A. niger при глубокой деструкции пектинов 145
Глава 11. Испытания пектиназ in vitro 148
11.1. Использование пектиназ для осветления яблочного сока 148
11.2. Выявление способности пектиназных препаратов к увеличению питательной
ценности кормов in vitro 152
Выводы 154
Список литературы 156
- Боковые цепи пектина
- Биохимические свойства энгЬ-полигалактуроназ A. niger
- Микроорганизмы и условия культивирования
- Анализ препаратов, niger н выделение основных пектиназ
Введение к работе
Промышленная технология ферментных препаратов начала развиваться в первой четверти XX века. К настоящему времени ферментные препараты стали мощным средством трансформации практически любого вида биологического сырья, формирования и контроля качества продуктов [1]. Применение ферментных препаратов в пищевой промышленности и сельском хозяйстве позволило существенно повысить глубину переработки пищевого сырья, улучшить органолептические свойства и создать новые виды пищевых продуктов, повысить усвояемость кормов и расширить сырьевую базу кормопроизводства.
Ферментная промышленность выпускает большой ассортимент препаратов микробного происхождения. Большую часть валового количества ферментов, особенно гидролитических, производят на основе культивирования бацилл (прежде всего, Bacillus subtilis), микроскопических грибов родов Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, а также актиномицетов Actinomyces, Streptomyces. При использовании в пищевой промышленности и фармакологии лидирующее место занимают препараты на основе грибов рода Aspergillus. Они используются как продуценты внеклеточных ферментов широкого спектра действия (пектиназ, амилаз, протеаз), а также для получения метаболитов (органических кислот, витаминов, жирных кислот и аминокислот) [2].
Пектиназы, продуцируемые промышленными штаммами грибов A. foetidus и A.niger, незаменимы при работе с ягодами, овощами и фруктами, а также с продуктами их переработки [3]. Пектиназы используются при приготовлении осветленных соков (яблочного, грушевого, виноградного), соков с мякотью (цитрусового, сливового, томатного) и пюре. Широкое распространение пектиназные препараты аспергиллов получили в виноделии. При приготовлении как соков, так и вин пектиназы используются на разных стадиях технологического процесса: при мацерации растительных тканей, при получении сока и увеличении его выхода, при подготовке сусла к брожению (в виноделии), при осветлении сока и вина и стабилизации готового продукта.
Ферментные препараты широко используются в птицеводстве и животноводстве в качестве добавок к кормам для повышения их питательной ценности, улучшения усвояемости кормов, а также для сохранения продуктивности при включении в корма дешевых, но трудноусвояемых или содержащих антипитательные вещества компонентов [4]. При использовании кормовых диет, включающих бобовые, возрастает
роль ферментов пектолитического действия, так как пектин является основным компонентом полисахаридной части бобовых. Известно также, что пектиназные препараты на основе A. oryzae в настоящее время широко используются в пищевой промышленности Юго-Восточной Азии при получении продуктов на основе сои [5].
Ряд положительных характеристик грибов рода Aspergillus - широкий диапазон продуцируемых гидролитических ферментов [6], высокий уровень белковой секреции, а также безопасность их использования в пищевой промышленности и фармакологии [7] - способствует увеличению интереса к ним как промышленно значимым объектам. В связи с этим растет потребность в фундаментальных знаниях о механизмах действия и свойствах индивидуальных ферментов, чтобы понимать механизмы функционирования ферментного препарата и иметь возможность управлять каталитическим процессом при его практическом использовании.
На сегодняшний день наиболее полно описаны свойства внеклеточных ферментов пектиназного комплекса гриба A. niger [8-9]. В настоящее время ведутся поиски продуцентов ферментов пектолитического действия среди других видов Aspergillus.
В нашей лаборатории совместно с Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН на протяжении ряда лет изучается мицелиальный гриб A.japonicus - продуцент различных карбогидраз. До сих пор он рассматривался только как источник гемицеллюлаз (ксиланаз и р-глюканаз), его пектиназный комплекс не изучался и в научной литературе не описан. Кроме того, перспективным продуцентом пектиназ является гриб A. foetidus; в ИБФМ получен ряд мутантных штаммов этого гриба. Несмотря на то, что ферментные препараты на основе A. foetidus успешно используются в России в пищевой промышленности уже несколько десятков лет, систематического изучения ферментного комплекса данного гриба ранее не проводилось.
Целью работы являлось изучение состава ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами грибов A. japonicus и A. foetidus, выделение в гомогенном виде основных ферментов пектиназного комплекса, изучение их биохимических и каталитических свойств, эффективности их действия на природные объекты (пектины из разных источников и яблочный сок), а также изучение взаимодействия пектиназ разной специфичности и выявление эффектов синергизма или антагонизма между ними. В качестве эталона для сравнения был использован промышленный пектиназный препарат Рапидаза Пресс ("Gist-Brocades", Нидерланды),
производимый на основе гриба A. niger; были выделены и изучены его основные пектолитические ферменты.
Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:
Выбрать мутантные штаммы-продуценты пектиназ и получить с их помощью ферментные препараты с высокими пектиназными активностями.
Разработать эффективный и экспрессный метод анализа состава препаратов на основе грибов Aspergillus и сравнить их ферментные комплексы.
Разработать схему выделения в гомогенном виде основных пектиназ и изучить их свойства.
Исследовать взаимодействие пектиназ различной специфичности при действии на пектины с разной степенью этерификации.
Разработать лабораторную методику оценки эффективности действия пектиназ в процессе осветления яблочного сока. На основе разработанной методики сравнить эффективность действия индивидуальных пектиназ, их комбинаций, а также ферменшых препаратов.
Боковые цепи пектина
В позиции О-З галактуроновой кислоты может присоединяться р-ксилозный остаток - такую структуру часто называют ксилогалактуронаном [17]. Его содержание высоко, например, в соевом пектине.
Из пектина клеточных стенок платана в присутствии эндо-полигалактуроназы было выделено два пектиновых полисахарида: рамногалактуронаны I и II [18]. В отличие от заряженного гомогалактуронана, рамногалактуронаны содержат фактически все нейтральные сахара.
Рамногалактуронан I состоит из чередующихся сс-1,2-связанных остатков L-рамнозы и а-1,4-связанных остатков D-галактуроновой кислоты. В зависимости от источника полисахарида, к 20-80% рамнозильных остатков в положении 0-4 присоединяются боковые ветви, длинной от 1 остатка галактозы до 50 и более остатков арабинозы (сахарная свекла), галактозы (лен, чеснок, лук) или их обоих (соя, картофель). Особенностью этого полисахарида является также высокое содержание ацетильных групп, связанных с остатками галактуроновой кислоты в положениях 0-2 и/или О-З. Ацетилирование рамногалактуронана зачастую приводит к ингибированию деполимеризующих его ферментов. Рамногалактуронан I был выделен также из риса, моркови, киви, томата [14]. Рамногалактуронан II встречается в пектине клеточных стенок растений редко. В его структуре было обнаружено до 30 различных Сахаров, в том числе и редких (например, апиоза). В отличие от рамногалактуронана I, включающего исключительно 1,2-связи, в рамногалактуронане II остатки рамнозы соединяются 1,2-, 1,3-, 1,4-связями. Пектин, содержащий рамногалактуронан И, был выделен из томата, яблока, капусты, картофеля [14]. Интересно, что до сих пор не было найдено ни одного фермента, способного разрушать рамногалактуронан П.
Боковые цепи пектина
Боковые цепи пектина преимущественно представлены остатками D-галактозы, L-арабинозы, D-ксилозы. Редко встречаются остатки D-глюкозы, D-маннозы, L-фукозы, D-глюкуроновой кислоты [19].
Основные сахара боковых цепей пектина (D-галактоза и L-арабиноза) образуют достаточно продолжительные последовательности (галактан, арабинан и арабиногалактан двух типов I и II), которые связаны с основной цепью через положения 0-4 и/или 0-3 L-рамнозы или иногда 0-2 и/или 0-3 галактуроновых остатков. Был исследован характер замещения сахарных остатков в основной цепи для пектинов из разных природных источников. Например, доля замещенных остатков галактуроновой кислоты в пектине семян рапса составляет 75%, картофеля и лука — 32%; в пектине листьев табака не было обнаружено замещения галактуроновой кислоты. Соотношение замещенных и незамещенных остатков рамнозы также варьирует в широких пределах в зависимости от природного источника: в пектине клеточных стенок платана 50% остатков рамнозы замещены боковыми цепями, яблок -почти 100%, листьев табака - 30-50%, моркови - 10-50%, капусты - 20-40%, винограда - 30%, свеклы - 60%, томатов - 20-40% [14].
Арабинан - разветвленный полисахарид, основная цепь которого построена из а-1,5-связанных остатков L-арабинофуранозы. Остальные a-L-арабинофуранозидные остатки (от 1 до 3) присоединены к атомам 0-2 и/или О-З арабинозы основной цепи. Арабинан может иметь молекулярную массу до 10 кДа. Пектины, имеющие арабинаны в боковых цепях, были выделены из яблок, сахарной свеклы, платана, семян рапса, абрикоса, моркови, капусты, лука, груши [20].
Входящий в состав боковых цепей пектина галактан является слабо разветвленным полисахаридом. Его основная цепь построена из Р-1,4-связанных остатков D-галактопиранозы. Описано два типа арабиногалактанов [21-22]. Арабиногалактан I состоит из линейной последовательности Р-1,4-связанных остатков D-галактозы; 20-30% галактозы через 0-3 соединены с короткими боковыми цепями, состоящими из сс-1,5-связанных остатков L -арабинофуранозида. Арабиногалактан I был выделен из цитрусовых, картофеля, сои, люпина, табака, яблок, лука, помидоров, капусты.
Арабиногалактан II - сильно разветвленный полисахарид, представленный цепями D-галактопиранозы, соединенной Р-1,3- и Р-1,6-связями. 1,3-Связи преобладают в основной цепи арабиногалактана, а 1,6-связи - в дополнительных, наиболее разветвленных цепях, которые заканчиваются L-арабинофуранозидом и реже L-арабинопиранозидом. Арабиногалактан II был обнаружен в пектине яблок, семян рапса, лимона, винограда.
Неуглеводные заместители в пектине Пектины имеют неуглеводные заместители, в частности метильную, ацетильную группы, остатки ароматических кислот, а также в некоторых коммерческих образцах амидные группы.
Степень этерификации остатков галактуроновой кислоты метанолом и/или уксусной кислотой - важная характеристика пектиновых веществ. Степень метилирования (СМ) определяется как доля карбоксильных групп, этерифицированных метанолом. Если СМ больше 50%, пектины называются высокометилированными; если СМ меньше 50%, пектины называются низкометилированными. Если доля этерифицированных карбоксильных групп меньше 10%, тогда говорят о пектиновых кислотах.
Природные пектины, как правило, высокометилированы. При этом распределение сложноэфирных групп может быть как блочным, так и произвольным [23]. Оно сильно зависит от присутствия эндогенных ферментов, например, растительных пектинметилэстераз, действие которых приводит к блочной деэтерификации пектина, или от условий экстракции пектина из сырого материала.
Степень ацетилирования (САц) определяют как долю остатков галактуроновой кислоты, в которых одна гидроксильная группа (ОН-2 или ОН-3) этерифицированна уксусной кислотой. В случае, когда одновременно ацетилированы обе гидроксильные группы, САц может быть больше 100%). Другие исследователи определяют степень ацетилирования пектина как долю остатков галактуроновой кислоты, в которых обе гидроксильные группы (ОН-2 и ОН-3) этерифицированы уксусной кислотой. Тогда максимальная степень ацетилирования равна 100%. В обоих случаях принимается, что только гидроксильные группы галактуроновой кислоты могут быть ацетилированы.
Степень ацетилирования вообще низка в природных пектинах за редким исключением. Например, в пектине сахарной свеклы по крайней мере 35% ОН-2 или ОН-3 остатков галактуроновой кислоты связано с ацетильными группами [24].
Пектины шпината и сахарной свеклы содержат сложные эфиры феруловой кислоты и нейтральных Сахаров боковых цепей, преимущественно арабинозы и галактозы [25].
Коммерческие низкометилированные пектины могут быть также искусственно амидированы. Степень амидирования определяется как число амидных остатков на 100 остатков галактуроновой кислоты [14].
Биохимические свойства энгЬ-полигалактуроназ A. niger
К пектинэстеразам относятся ферменты, гидролизующие сложные эфиры основной цепи пектина. Выделяют три класса эстераз: пектинметилэстеразы (РМЕ, ЕС 3.1.1.11), пектинацетилэстеразы (РАЕ, ЕС 3.1.1.6) и рамногалактуронанацетилэстеразы (RGAE). Пектинметилэстеразы действуют на метиловые эфиры О-6-галактуроновой кислоты в гомогалактуроновой части пектина; до сих пор не было обнаружено пектинметилэстераз, активных к метиловым эфирам рамногалактуронана. Оба класса ацетилэстераз гидролизуют сложные эфиры 0-2 и/или 0-3 галактуроновой кислоты или в гомогалактуронане, или в рамногалактуронане.
Пектинметилэстеразы принадлежат 8-ой семье карбогидратэстераз, микробные пектин- и рамногалактуронанацетил эстераз ы - 12-ой семье, а растительные пектинацетилэстеразы- 13-ой семье [27].
Пектинэстеразы являются среднеразмерными белками с массой 25-54 кДа. Большинство эукариотических пектинметилэстераз представляют собой гликопротеины. Особенностью пектинэстераз является наличие большого числа изоформ [55-56].
Действие пектинметилэстераз на высокометилированный пектин не приводит к его полному деметилированию. Как правило, конечная СМ субстрата составляет 20-30%. Отчасти это связано с присутствием ацетильных групп в пектине [57]. Предобработка или одновременное действие с РАЕ увеличивает количество уходящих метальных групп, однако полного деметилирования субстрата все же не происходит.
Основное различие растительных и грибных пектинметилэстераз состоит в типе действия на пектин. В то время как растительные ферменты приводят к блочной деэтерификации субстрата, грибные действуют на пектин спонтанно [56]. 2.2.1. Структура и механизм действия пектинэстераз
В настоящее время установлены трехмерные структуры для РМЕ из E.chrysanthemi (PDB-код 1QJV), для РМЕ из моркови (PDB-код 1GQ8) и для RGAE из A. aculeatus (PDB-код 1DEO и 1DEX) (http://oca.ebi.ac.uk/oca-bin/ocamain).
Структура РМЕ имеет схожую топологию с пектат- и пектинлиазами, а также с полигалактуроназами/рамногалактуроназами. Она представляет собой параллельную р-листовую структуру с петлей, выдающейся от угла Р-листа и образующей субстрат-связывающую полость.
Основываясь на трехмерной структуре и первичной последовательности РМЕ (подробно аминокислотная последовательность РМЕ рассматривается в гл. 8), была предложена гипотеза механизма гидролиза [58]. Строго консервативными для пектинметилэстераз являются два остатка Asp и один остаток Arg. Один из остатков Asp находится в протонированной форме, а другой депротонируется за счет образования водородной связи с остатком Arg. Молекула воды, находясь рядом с депротонированным остатком Asp, активируется благодаря переходу ее протона на заряженный остаток аминокислоты. Образовавшаяся ОН -группа атакует карбоксильный С-атом. Одновременное протонирование одной из карбоксильных групп приводит к образованию тетраэдрического интермедиата, который распадается с высвобождением метанола.
Трехмерная структура RGAE существенно иная [59]. Этот фермент сворачивается в а/р/а-структуру, которая отлична от обычно наблюдаемой а/р-структуры большинства эстераз. Для пектинацетилэстераз механизм катализа до сих пор не установлен.
В литературе отсутствует информация о точном количестве и строении субстрат-связывающих субсайтов пектинэстераз. Однако, для РМЕ A. niger было установлено присутствие как минимум 5 субсайтов связывания [60].
Влияние различных факторов на активность пектинэстераз Растительные пектинэстеразы, например, выделенные из томата [61] или цитрусовых [62], обладают высокой активностью. Это имеет большое значение при производстве соков и консервировании фруктов. Например, в процессе приготовления сока цитрусовый пектин быстро деэтерифицируется под действием собственной пектин эстеразы, что приводит к коагуляции частиц и последующему нежелательному осветлению сока. Это может быть предотвращено только инактивацией ферментов. В табл. 5 представлены свойства некоторых растительных и грибных пектинэстераз. Активность пектинэстераз зависит от рН среды, температуры, а также присутствия солей и ингибиторов. Пектинэстеразы из разных источников отличаются рН-оптимумами действия: для растительных и бактериальных характерен диапазон 6-8, для грибных - это кислая область рН 4-6. Следует отметить, что при рН 8 начинается щелочная деэтерификация пектина. рН-Стабильность фермента зависит от источника его выделения и находится в диапазоне рН 1-Ю. Температурная стабильность грибных пектинэстераз умеренная (40-70 С) [63], при этом немного большая стабильность характерна для растительных ферментов [61-62] по сравнению с микробными.
До сих пор не были найдены низкомолекулярные ингибиторы пектинэстераз. Известно, что ионы Hg2+, Al3+, NH/, а также сахароза и галловая кислота уменьшают активность некоторых пектинметилэстераз [62]. Для многих пектинметилэстераз ингибитором является полигалактуроновая кислота - конечный продукт их действия на пектин. Для РМЕ томата была найдена К, = 7 мМ, причем полигалактуроновая кислота была конкурентным ингибитором [61].
Было обнаружено, что в присутствии NaCl и КО активность РМЕ увеличивалась, и этот эффект был результатом уменьшения ингибирования со стороны полигалактуроновой кислоты за счет взаимодействия последней с солями одновалентных металлов [62].
Во фруктах киви был найден гликопротеиновый ингибитор РМЕ массой 16,7 кДа и выделен с помощью аффинной хроматографии на колонке с носителем сефароза с привитой РМЕ томата [64]. При взаимодействии РМЕ с ингибитором образовывался комплекс (1:1), причем взаимодействие было настолько сильным, что комплекс диссоциировал только при высоких значениях рН и высокой ионной силе элюирующего раствора (рН 9,5; 1,5 М NaCl).
Микроорганизмы и условия культивирования
Мутагенез и селекцию микроорганизмов проводили в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г. Пущино).
В ходе мутагенеза гриба A. japonicus в качестве исходного использовали дикий штамм Aj F-2092 (регистрационный номер ВКМ F-3743D). Штаммы подвергали УФ-облучению, селективный отбор клонов проводился по увеличению полигалактуроназной (рее) и ксиланазной (xyl) активностей. Отобранные клоны выращивали в колбах (30С, рН 4,0) на среде, содержащей (г/л): свекловичный жом -10, солодовые ростки - 30, соевую шелуху - 30, (NH4)2S04 - З, КН2РО4 - 4, MgS04 -0,5. Автоматическое поддерживание концентрации растворенного кислорода (20-40% от насыщения), расход воздуха - 0,4 л/мин, рабочий объем - 0,9 л. Длительность 144 ч. После 49 ч ферментации проводили подпитку смесью (г/л): глюкоза- 16, ксилоза- 4.
В ходе мутагенеза гриба A. foetidus в качестве исходного использовали штамм Af М-45, предоставленный д.т.н. Бравовой Г.Б. (НТЦ "Лекбиотех"). Штаммы подвергали УФ-облучению, клоны отбирали согласно увеличенным размерам зоны просветления, образуемой вокруг колоний на агаризованной среде с пектином. Отобранные клоны выращивали в колбах (30С, рН 4,0) на среде, содержащей (г/л): свекловичный жом -30, солодовые ростки - 10, (№[4)2804 - 7, КН2РО4 - 1, MgS04 - 0,5. Автоматическое поддерживание концентрации растворенного кислорода (20-40% от насыщения), расход воздуха - 0,4 л/мин, рабочий объем - 0,9 л. Длительность 168 ч.
Для наработки препаратов на основе пектиназных штаммов Aj и Л/использовали те же условия, что и в ходе мутагенеза соответствующих исходных штаммов. Рабочий объем при культивировании составлял
Использовали лабораторные ферментные препараты A. japonicus и A. foetidus, приготовленные в ИБФМ. Использовали культуральные жидкости (кж) штаммов Ajaponicus (штаммы указаны на рис. 8 и в табл. 8 в гл. 6), а также лиофильно высушенные ультрафильтраты кж некоторых штаммов A. japonicus: препарат #349.63.2 (продуцент - штамм F-2092), препарат #349.43.2 (продуцент - штамм рее 45-79-178), препарат #349.84.2 (продуцент - штамм рее 178-1049). Препараты A. foetidus представляли собой лиофильно высушенные ультраконцентраты кж: препарат #7.11.2 (продуцент - штамм М-45), препарат #7.17 (продуцент - штамм рее 70а), препарат #7.18 (продуцент - штамм рее 70а).
Из коммерческих ферментных препаратов были использованы. Рапидаза С-80Л и Рапидаза Пресс на основе A. niger производства "Gist-Brocades", Нидерланды; Ксиланаза AN на основе A. niger производства "Biovet", Болгария.
В работе были использованы следующие полисахаридные субстраты: К-соль полигалактуроновой кислоты (ПГК), высокометилированный цитрусовый пектин, яблочный пектин, а также цитрусовые пектины со СЭ 26, 65 и 89%, глюкуроноксилан березы, карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) ("Sigma", США); р-глюкан из ячменя, разветвленный арабинан из сахарной свеклы, галактан из картофеля, ксилоглюкан (amyloid) ("Megazyme", Австралия); свекловичный пектин, сахароза ("Реахим", Россия); растворимый картофельный крахмал (НПО по крахмалопродуктам, Россия); галактоманнан (лаборатория углеводов ИНБИ РАН, Россия). Использовали следующие и-нитрофенильные производные Сахаров: a-L-арабинофуранозы, а- и P-D-галактопиранозы, P-D-глюкопиранозы - и «-нитрофенильное производное P-D-ксилопиранозы ("Sigma"). Проводили оценку эффективности осветления сока ферментами и ферментными препаратами, используя продажный неосветленный яблочнй сок. Оценку эффективности действия ферментных препаратов на корма проводили с использованием сои американского производства.
Для приготовления буферных растворов и реагентов использовали реактивы марок х.ч. и ч.д.а. производства "Реахим", "ICN" и "Sigma". Для приготовления реактивов для электрофореза и изоэлектрофокусирования использовали реактивы марки "electrophoresis grade" производства "ICN", "Sigma", "Reanal" (Венгрия), "Bio-Rad" (США). Также использовали белки-маркеры производства "Sigma".
Для экспериментов по высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) использовали ацетонитрил производства "КриоХим" (Россия). Для калибровки использовали декстраны производства "Pharmacia" (Швеция) с молекулярными массами 20-250 кДа, а также D-галактуроновую кислоту производства "Sigma".
Хроматографические носители. Для разделения ферментов использовали: для ГПХ низкого давления носитель акрилекс П-2 ("Reanal"); для анионообменной хроматографии колонку с носителем Source 15Q и колонку Mono Q HR 5/5 ("Pharmacia"); для гидрофобной хроматографии колонку с носителем Phenyl Sepharose и колонку Phenyl Superose HR 5/5 ("Pharmacia"); для обессоливания и перевода в другой буфер образцов колонку с носителем Sephadex G-25 ("Pharmacia").
Для исследования молекулярно-массового распределения (ММР) продуктов ферментативного гидролиза полисахаридов применяли ВЭЖХ на колонке Protein Рак 125 ("Waters", США).
При разработке схем аналитического и препаративного разделения ферментов использовали известные из литературы схемы очистки белков [125-126], а также рекомендации фирмы производителя оборудования [127].
В работе использовали препараты в виде лиофильно высушенных концентратов кж. Навеску препарата (10 г/л) растворяли в 20 мМ пиперазин-HCl буфере, рН 5,5 в течение 15 мин при перемешивании на магнитной мешалке. Полученные растворы центрифугировали (10000 об/мин, 3 мин), затем супернатант фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Обессоливание проводили, используя хроматографическую систему низкого давления Econo System ("Bio-Rad"), состоящую из перистальтического насоса, ультрафиолетового детектора (280 нм), кондуктометрического детектора, самописца. Образцы наносили на колонку с акрилексом П-2 объемом 20 или 70 мл, уравновешенную 20 мМ пиперазин-HCl буфером, рН 5,5, элюировали белки при скорости 1 мл/мин.
Анализ препаратов, niger н выделение основных пектиназ
Наиболее перспективной ветвью генеалогического древа мутантов A. japonicus оказалась группа штаммов рее 45-79-178, рее 178-354 (красная ветвь, рис. 8). Для препаратов этих штаммов характерны одновременно высокие активности по отношению к ПГК (4,9 и 3,8 ед/мг белка, соответственно), ксилану (52,2 и 42,0 ед/мг белка, соответственно) и р-глюкану (22,4 и 32,9 ед/мг белка, соответственно) (табл. 8).
Следует выделить еще одну перспективную ветвь полученных мутантных штаммов A. japonicus с высокой специфичностью к ксилану (до 75 ед/мг белка, зеленая ветвь, рис. 8). Однако изучение ксиланазного комплекса A. japonicus не входило в приоритеты данной работы; подробнее анализ ксиланаз проведен в работе [139].
Сравнение ферментного состава препаратов на основе исходного и мутантного штаммов A. japonicus
Итак, в ходе многоступенчатого мутагенеза из исходного штамма F-2092 был получен мутантный штамм рее 45-79-178 с существенно измененным набором основных активностей. Кроме того, по данным ДДС-электрофореза белковый состав препаратов также был различен (рис. 10, представлен также ДДС-электрофорез препаратов на основе штаммов A. foetidus, которые будут обсуждаться позже). Интересно было провести более детальный анализ ферментного состава препаратов на основе обоих штаммов. Для этого ультраконцентраты кж штаммов были лиофильно высушены, в полученных препаратах определены активности к ряду субстратов (табл. 9, представлены также активности препаратов на основе штаммов A. foetidus, речь о которых будет идти позже), затем их подвергли хроматографическому разделению.
Предварительные эксперименты показали, что наиболее оптимальной является двухстадийная схема фракционирования, при которой в начале препарат (10 мг белка) наносится на анионообменник Mono Q при рН 5,5 (при этом примерно 2/3 белков связываются с носителем), затем на второй стадии несвязавшаяся фракция подвергается разделению при более высоком рН 7,3. Такой подход позволил упростить
Белки-маркеры, приведена масса в кДа. работу с мультиферментными препаратами и одновременно сохранить активности ферментов, лабильных при нейтрально-щелочных значениях рН. В полученных фракциях анализировали активности по широкому спектру субстратов, а также проводили ДДС-электрофорез белковых фракций (подробные результаты не приводятся).
Предложенный метод анализа ферментного состава препаратов представляется достаточно экспрессным (анализ одного препарата занимает 3-4 дня) и одинаково эффективным для различных видов Aspergillus. Благодаря строгой воспроизводимости результатов полученные данные можно считать "паспортом" ферментного препарата и на этом уровне сравнивать препараты разных штаммов и разных видов Aspergillus между собой.
Следует отметить, что, так как изучение ферментных препаратов на основе A.japonicus ведется в нашей лаборатории несколько лет, некоторые ферменты, не относящиеся к пектиназам, были выделены, и достаточно хорошо исследованы их свойства. На основе профиля элюции, субстратной специфичности и данных ДДС-электрофореза можно с уверенностью идентифицировать такие ферменты, как Стадия 2: Mono Q, pH 7,3
Результаты аналитического фракционирования препаратов на основе исходного и мутантного штаммов представлены на рис. 11 и 12. Действительно, в ходе мутагенеза произошли серьезные изменения ферментного состава A. japonicus, в первую очередь пектиназного комплекса. Так, во фракциях препарата исходного дикого штамма F-2092 были обнаружены как минимум четыре полигалактуроназы (рис. 13): основная активность (76% от общей активности) была обнаружена во фракции, незавязавшейся на первой стадии разделения препарата, и фракции, собранной при 0,12 М NaCl на второй стадии. Во фракциях первой стадии разделения, кроме того, были найдены три полигалактуроназы с минорными активностями, соответствующие 0,05, 0,16 и 0,3 М NaCl, при этом вторая по времени элюции полигалактуроназа вносила наибольший вклад в общую активность по сравнению с двумя другими.
При фракционировании штамма-мутанта рее 45-79-178 были обнаружены только две полигалактуроназы. По-прежнему основной была полигалактуроназа, выделенная на второй стадии разделения: ее вклад в общую полигалактуроназную активность увеличился до 85%, а также более чем в 20 раз выросло ее содержание (об этом говорит увеличение единиц активности, приходящихся на 10 мг наносимого на колонку белка). Из полигалактуроназ, выходящих на первой стадии, осталась только
Распределение полигалактуроназной активности во фракциях после аналитического разделения препаратов на основе штаммов A. japonicus. одна минорная, собранная при 0,3 М NaCl, при этом ее вклад в общую активность препарата увеличился в 4 раза, а ее содержание в ферментном комплексе — в 100 раз. Таким образом, увеличение в десятки раз полигалактуроназной активности препарата мутантного штамма обусловлено изменением качественного состава секретируемых ферментов и повышением содержания двух полигалактуроназ. При этом, как будет показано ниже (гл. 7), содержание основной полигалактуроназы в препарате мутантного штамма не превышает 0,2% от общего содержания белка.
Также во фракциях обоих препаратов были обнаружены пектинэстеразная активность (при 0,27 М NaCl на первой стадии разделения) и пектинлиазная активность (в конце первой стадии фракционирования препарата при 0,35-0,39 М NaCl).
Изменился также состав гемицеллюлазного комплекса препарата. Гриб увеличил секрецию ксиланаз в основном за счет ксиланазы 22 кДа, которая элюировалась в начале градиента соли на первой стадии фракционирования (при 0,07 М NaCl), для нее наблюдалось наибольшее увеличение соответствующего пика. Вместе с тем, в середине градиента соли (при 0,17 М NaCl) на первой стадии разделения препарата мутантного штамма не была найдена ксиланазная активность, мажорная для исходного штамма.
Также существенно выросли пики и увеличились активности во фракциях, соответствующих Р-глюканазе 30 кДа (при 0,1 М NaCl на второй стадии разделения препарата) и глюкоамилазе 140 кДа (при 0,28-0,3 М NaCl на первой стадии). Однако в препарате мутантного штамма исчезли минорные Р-глюканазная и амилазная активности, собранные, соответственно, при 0,05 и 0,19 М NaCl на первой стадии фракционирования препарата исходного штамма.
В качественном составе препарата также произошли изменения. В препарате мутантного штамма были обнаружены ферменты, отсутствующие в препарате исходного штамма: вторая минорная ос-галактозидаза (при 0,17 М NaCl на первой стадии) и галактаназа (в конце градиента на первой стадии фракционирования).
