Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время ферменты, расщепляющие полисахариды (карбогидразы), находят все более широкое применение в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства: для конверсии растительной биомассы, обработки текстильньж изделий, в целлюлозно-бумажной промышленности, в пищевой промышленности, в качестве добавок, улучшающих питательные свойства кормов для животньж и т.д. Поэтому важной и актуальной задачей является изучение состава ферментньж комплексов микроорганизмов, являющихся продуцентами карбогидраз.
Как известно, одними из самьж распространенных природных полимеров являются полисахариды клеточных стенок растений. Среди них ксиланы занимают значительное место, например, их содержание в древесине лиственных пород составляет до 20-30%. Оснозная цепь ксилана построена из остатков D-ксилозы, соединенных р-1,4-связями, и может содержать различные заместители (или короткие боковые цепи) такие как L-арабинофуранозу, D-глюкуроновую кислоту, D-ксшюзу, а также ацетил- ферулоил- и п-кумароильные группы. Ферменты - ксиланазы расщепляют гликозидные связи в основной цепи [3-1,4-ксилана. Массированное изучение ксиланаз происходит на протяжении более 50 лет. Тем не менее, задача поиска новьж ферментов, не имеющих гомологии с известными ксиланазами и, возможно, обладающих новыми важными свойствами и особенностями дейстзия на сложный гетерополисахарид, остается актуальной. Ярким примером является недавнее обнаружение в паках белковых ингибиторов ксиланаз. Большинство известных ксиланаз (которые группируются в две различные семьи гликозил-гидролаз: 10-ю и 11-ю) ингибируются белковыми ингибиторами. Только единичные ксиланазы проявляют устойчивость к этим ингибиторам.
Ксилоглюканыи Р-глкжаны - полисахариды растений, выполняющие структурные и запасные функции. Основная цепь этих полисахаридов содержит остатки D-глюкозы, соединенные р-1,4-связями (в случае ксилоглюкана) или остатки глюкозы, соединенные Р-1,4- и Р-1,3-связями (в случае р-глюканов). Большая часть остатков глюкозы в ксилоглюкане содержит боковые заместители - остатки D-ксилозы, D-галактозы и иногда других Сахаров - L-фукозы, и L-арабинозы. Основную цепь этих полисахаридов могут расщеплять по эндо-деполимеразному механизму многие эндо-Р-1,4-глюканазы (целлюлазы). Однако, ферменты, специфичные только к данному полисахариду (Р-глкжану или ксилоглюкану) и неактивные по отношению к другим Р-1,4-глюканам, крайне мало изучены. Исключением являются бактериальные лихеназы (эндо-Р-1,3-1,4-глюканазы), расщепляющие р-глкжаны. В случае же ксилоглюканаз довольно хорошо изучены лишь специфические ферменты растений - ксилоглюкан-эндо-трансгликозилазы. Только недавно (в 1999-2004 гг.) появились первые сообщения о специфичных грибньге ксилоглюханазах.
ЦИиТЬКА
ГОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА СПстср
В нашей лаборатории на протяжении ряда лет изучается мицелиальный гриб Aspergillus japonicus - продуцент ксиланаз, р-глюканаз, пектиназ и других карбогидраз. Однако, систематического изучения ферментного комплекса данного гриба ранее не проводилось и сведения, касающиеся ферментов, которые он продуцирует, в научной литературе практически отсутствуют.
Цель и задачи исследования.
Целью работы являлось изучение состава ферментного комплекса, секретируемого грибом Ajaponicus и выявление наиболее важных и перспективных ферментов. Далее мы поставили цель подробно изучить свойства обнаруженных нами ксиланаз, Р-глюканазы и ксилоглкжаназы и сравнить их со свойствами аналогичных ферментов из других источников. Для двух последних ферментов в качестве «стандарта для сравнения» выбрали хорошо изученные эндо-р-1,4-глюканазы I, II и III мицелиального гриба Trichoderma reesei и лихеназу (эндо-|3-1,3-1,4-глюканазу) из Bacillus subtilis, а также мало изученные ксилоглкжаназы из T.reesemChrysosporium lucknowense.
Для достижения указанных целей в рамках диссертационной работы было необходимо решить следующие задачи:
Выделить основные (мажорные) карбогидразы ферментного комплекса Ajaponicus. Разработать схему экспрессного хромагографического анализа качественного и количественого состава ферментных препаратов, продуцируемых мугантными штаммами Ajaponicus.
Изучить свойства и механизм действия специфичных Р-глюканазы и ксилоглюканазы A. japonicus и сравнить их действие с эндо-Р-1,4-глюканазами T.reesei и лихеназой В. subtilis, атакжексилоглюканазами Т. reesemC. lucknowense.
Научная новизна. Охарактеризован состав ферментного комплекса, секретируемого мугантными штаммами Ajaponicus. Изучены биохимические и физико-химические свойства ксиланаз 35 и 22 кДа, Р-глюканазы 28 кДа, ксилоглюканазы 32 кДа, арабиноксилан-арабинофурангидролазы 33 кДа. Вьшвлены особенности действия Р-глюканазы Ajaponicus, классифицированной как Р-глкжан-специфичная эндо-Р-1,4-глюканаза. Исследован механизм действия ксилоглюканазы Ajaponicus, классифицированной как ксилоглюкан-специфичная эндо-Р-1,4-глюканаза. Проведено сравнительное изучение степени упорядоченности действия на полимерный р-глюкан ячменя ряда Р-глюканаз и эндоглюканаз. Обнаружен процессивный (экзо-деполимеразный) тип действия малоизученных ксилоглюканаз T.reesei и С lucknowense при гидролизе ксилоглюкана.
Практическая значимость работы. Разработан эффективный и экспрессный метод определения компонентного состава ферментньж комплексов, продуцируемых грибом AJaponicus. Исследован компонентный состав трех ферментньж препаратов, полученньж с помощью различных мугантньж штаммов гриба. Вьшснена причина исключительно высокой удельной ксиланазной активности препаратов на основе двух мутаптньж штаммов - увеличение содержания в белковом комплексе ксиланазы 22 кДа в 6-7 раз и одинаковый уровень продукции другой мажорной ксиланазы - 35 кДа. Вьшснена причина высокой Р-глюканазной активности (и при этом низкой целлюлазной активности) препаратоз AJaponicus - значительное содержание специфичной Р-глюканазы 28 кДа (10-12% от общего содержания белка). Обнаружена полигалактуроназа, обуславливающая высокую пектиназную активность некоторых препаратов AJaponicus. Детальное знание состава ферментного комплекса, сектетируемого этим перспективным продуцентом ксиланаз, р-глюканаз и пектиназ позволит эффективно применять эти ферментные препараты при производстве кормов, биоотбеливании целлюлозной пульпы, обработке текстильных материалов и в других областях биотехнологии.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), международных конференциях «Биокатализ-2000» (Москва, 2000) и «Биокатализ-2002» (Москва, 2002), втором международном конгрессе «Биотехнология: состояние и развитие» (Москва, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатньж работ, в том числе 4 статьи.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (1 глава), изложения результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 139 источников. Работа изложена на /??страницах машинописного текста, включает 82 рисунка и 27 таблиц.
![9-фурилнафто[2,3-b]фураны : Синтез, свойства и реакции](/i/i/4412/311908.png "9-фурилнафто[2,3-b]фураны : Синтез, свойства и реакции Мельчин Владимир Викторович")
![Синтез новых гетероциклических систем на основе 3-аминотиено[2,3-b]пиридинов и их свойства](/i/i/4344/444254.png "Синтез новых гетероциклических систем на основе 3-аминотиено[2,3-b]пиридинов и их свойства Василин Владимир Константинович")
![Синтез и свойства тетразоло[1,5-b][1,2,4]триазинов](/i/i/4386/289117.png "Синтез и свойства тетразоло[1,5-b][1,2,4]триазинов Шестакова Татьяна Сергеевна")
