Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы
Глава 1 Обзор литературы 8
1.1. Современные представления о классификации карбогидраз 8
1.2. Структура и функции ксилоглкжана клеточных стенок растений 11
1.3. Ферменты гидролизующие ксилоглюкан .. 16
1.4. Структура и функции нецеллюлозных р-глюканов 23
1.5. Ферменты гидролизуюгцие р-глюканы 26
1.6. Ферменты Aspergillus 30
II. Экспериментальная часть
Глава 2. Объекты исследования и методика эксперимента 35
2.1. Использованные вещества 35
2.2. Хроматографическое фракционирование и очистка ферментов 36
2.2.1. Разделение препарата AJaponicus 37
2.2.2. Хроматографический анализ препаратов AJaponicus 38
2.2.3. Разделение препарата T.reesei 39
2.3. Определение ферментативной активности и белка ... 42
2.4. Определение биохимических характеристик ферментов 43
2.5. Определение рН-зависимости активности ферментов 43
2.6. Изучение термостабильности ферментов 44
2.7. Определение кинетических параметров действия ферментов 44
2.8. Проведение гидролиза Р-глюкавд, ксилоглкжана и арабиноксилава под действием ферментов 44
2.9. Исследование изменения молекулярно-массового распределения полисахаридов... 44
2.10. Исследование состава низкомолекулярных продуктов гидролиза полисахаридов 44
2.11. Определение вискозиметрической активности по р-глюкану и карбоксиметилцеллюлозе с одновременным определением выхода ВС 45
2.12. Масс спектрометрический анализ пептидного фингерпринта выделенных белков 45
Обсуждение результатов.
Глава 3. Выделение и очистка ферментов AJaponicus 47
3.1. фракционирование исходного препарата AJaponicus с помощью ионообменной хроматографии на Source 15Q 47
3.2. Очистка р-глюканазы 28 кДа и ксиланазы 35 кДа 60
3.3. Очистка ксиланазы 22 кДа с помощью гидрофобной хроматографии на Phenyl-Superose 62
3.4. Очистка ксилоглюканазы 32 кДа с помощью ионообменной хроматографии на MonoQ 64
3.5. Очисткаарабиноксилан-арабинофурангидролазы 33 кДа 65
Глава 4. Идентификация выделенных ферментов с помощью протеолиза трипсином с последующей масс-спектрометрией пептидов 70
Глава 5. Изучение свойств выделенных ферментов A.japonicus 81
5.1. Активность и кинетические параметры действия ферментов на различные субстраты .. 81
5.2. рН-зависимости и термостабильность ферментов 89
5.3. Механизм гидролиза р-глкжана под действием р-глюканаз, эндоглюканаз и экзо-р-глюкозидазы 96
5.3.1. Изучение продуктов гидролиза с помощью ГПХ 96
5.3.2. Изучение продуктов исчерпывающего гидролиза р-глюкана 102
5.3.3. Сравнение продуктов исчерпывающего гидролиза р-глюкана BG 28 A.japonicus и лихеназойДвмбй/ш 105
5.3.4. Изучение начальной стадии гидролиза р-глюкана с помощью вискозиметрии 112
5.4. Механизм гидролиза ксилоглюкана под действием ксилоглюкаиаз и эндоглюканаз 116
5.4.1. Изучение продуктов гидролиза ксилоглюкана с помощью ГПХ... 116
5.4.2. Изучение продуктов исчерпывающего гидролиза ксилоглюкана 122
Глава 6. Анализ качественного и количественного состава ферментных препаратов A.japonicus 128
6.1.. Характеристики исходных препаратов 128
6.2. Хроматографическое разделение и определение активности фракций 131
6.3, Анализ состава и содержания ферментов в препаратах , 146
6.3.1. Идентификация известных ферментов Ajaponicus 146
6.3.2. Оценка количественного содержания индивидуальных ферментов 151
Выводы 156
Список литературы
- Структура и функции ксилоглкжана клеточных стенок растений
- Хроматографическое фракционирование и очистка ферментов
- Очистка р-глюканазы 28 кДа и ксиланазы 35 кДа
- Механизм гидролиза р-глкжана под действием р-глюканаз, эндоглюканаз и экзо-р-глюкозидазы
Введение к работе
В настоящее время ферменты, расщепляющие полисахариды (карбогядразы), находят все более широкое применение в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства: для конверсии растительной биомассы, обработки текстильных изделий, в целлюлозно-бумажной промышленности, в пищевой промышленности, в качестве добавок, улучшающих питательные свойства кормов для животных [1,2, 3, 4].
Широкое разнообразие и повсеместная распространенность ферментов-карбогидраз обуславливается разнообразием структур полисахаридов, встречающихся в природе, а также узкой субстратной специфичностью ферментов к типу моносахаридного остатка, типу связи между остатками, и ближайшему окружению расщепляемой связи. Одними из самых распространенных в природе являются полисахариды клеточных стенок растений. Они могут быть условно разделены на три группы: целлюлоза, гемицеллюлозы и пектины [5].
Целлюлоза является основным компонентом клеточной стенки и представляет собой линейный полимер, состоящий из остатков D-глкжозы, соединенных р-1,4-связями. Полимеры целлюлозы присутствуют как упорядоченные структуры (арматура) и их основная функция — обеспечение жесткости клеточной стенки растений [5,6].
Гемицеллюлозы - группа структурно различных гетерополисахаридов, часто встречающихся вместе с целлюлозой. Основным гемицеллюлозным полимером злаков и лиственных деревьев является ксилан. Основная цепь ксилана построена из остатков D-ксилозы, соединенных р-1,4-связями, и может содержать различные заместители (или короткие боковые цепи), такие как L-арабинозу, D-глюкуроновую кислоту, D-ксилозу, а также ацетил- ферулоил- и и-кумароильные группы [7].
Другими распространенными гемицеллюлозными полимерами являются галактоманнаны и галактоглюкоманнаны. Они составляют основную фракцию гемицеллюлоз хвойных деревьев [8], а также служат запасными полисахаридами, например, в семенах бобовых [9].
К гемицеллюлозам относят также ксилоглюканы и р-глюканы, основная цепь которых содержит остатки D-глюкозы, соединенные р-1,4-связями в случае ксилоглюкана,' и большое количество боковых заместителей или остатки глюкозы, соединенные р-1,4, р-1,3-связями в случае р-глюканов злаков. В семенах некоторых растений эти полисахариды выполняют также функцию углеводного запаса [5, 9].
Пектины образуют следующую группу гетерополисахаридов. В зависимости от растительного источника структура пектинов может достаточно сильно различаться. Общим в структуре пектинов является линейная последовательность а-1,4-галактуронана, которая перемежается встроенными участками линейного рамногалактуронана, к которому в свою очередь присоединены боковые цепи, что делает структуру пектинов разветвленной. В качестве боковых цепей наиболее часто присутствуют линейные и разветвленные о>1,5-арабинофурананы, несущие ответвления в позициях 02 и 03, а также арабино-р-1,4-галактаны и арабино-р-1,3-1,6-галактаны, которые содержат большее или меньшее количество арабинофуранозы в виде боковых заместителей и в виде последовательностей а-1,5-арабинофуранана. Указанные арабинаны и галактаны часто содержатся и в ковалентно-несвязанном с пектином виде [5, 6, 9].
На сегодняшний день выделено и охарактеризовано большое количество ферментов - карбогидраз из различных источников. На основании гомологии их первичной аминокислотной последовательности они разбиты на семьи гиликозил-гидролаз [10, 11], причем, часто микроорганизм продуцирует несколько ферментов одного типа действия. Например, гриб-продуцент целлюлаз Trichoderma reesei продуцирует 5 эндоглюканаз (I - V), две целлобиогидролазы (I, II) и три ксиланазы (I, П, III) [11, 12]. Представители рода Aspergillus часто продуцируют по нескольку разных ксиланаз и полигалактуроназ [13].
Ксиланазы расщепляют гликозидные связи в основной цепи (3-1,4-ксилана. Массированное изучение ксиланаз происходит на протяжении более 50 лет. В настоящее время становится все более актуальной фундаментальная задача выявления особенностей действия на субстрат ферментов с одинаковой специфичностью, но принадлежащих к разным семьям гликозил-гидролаз. Кроме этого, задача поиска новых ферментов, не имеющих гомологии с известными ксиланазами и, возможно, обладающих новыми важными свойствами и особенностями действия на сложный гетерополисахарид, остается актуальной.
Основную цепь таких полисахаридов как ксилоглюкан и р-глюкан злаков могут расщеплять по эндо-деполимеразному механизму многие эндо-Р-1,4-глюканазы (целлюлазы). Однако, ферменты, специфичные только к данному полисахариду (Р-глюкану или ксилоглюкану) и неактивные по отношению к другим р-1,4-глюканам, крайне мало изучены. Исключением являются бактериальные лихеназы (эндо-р-1,3-1,4-
глюканазы), расщепляющие Р-глюканы. В случае же ксилоглкжаназ довольно хорошо изучены лишь специфические ферменты растений - ксилоглюкан-эндо-трансглккозилазы. Только недавно (в 1999-2004 гг.) появились первые сообщения о специфичных грибных ксилоглюканазах и р-глюканазах.
В нашей лаборатории на протяжении ряда лет изучается мицелиальный гриб Aspergillus japonicus — продуцент ксиланаз, Р-глюканаз, пектиназ и других карбогидраз. Однако, систематического изучения ферментного комплекса данного гриба ранее не проводилось и сведения, касающиеся ферментов, которые он продуцирует, в научной литературе практически отсутствуют.
Целью работы являлось изучение состава ферментного комплекса, секретируемого грибом Ajaponicus и выявление наиболее важных и перспективных ферментов. Далее мы поставили цель подробно изучить свойства обнаруженных нами ксиланаз, Р-глюканазы и ксилоглюканазы и сравнить их со свойствами аналогичных ферментов из других источников. Для двух последних ферментов в качестве «стандарта для сравнения» выбрали хорошо изученные эндо-р-1,4-глюканазы І, П и III мицелиального гриба Trichoderma reesei и лихеназу (эндо-|3-1,3-1,4-глюканазу) из Bacillus subtilis, а также мало изученные ксилоглюканазы из Т, reesei и Chrysosporium lucknowense.
Для достижения указанных целей в рамках диссертационной: работы было необходимо решить следующие задачи:
Выделить основные (мажорные) карбогидразы ферментного комплекса Ajaponicus.
Разработать схему экспрессного хроматографического анализа качественного и количественого состава ферментных препаратов, продуцируемых мутантными штаммами Ajaponicus.
Изучить свойства и механизм действия специфичных р-глюканазы и ксилоглюканазы Ajaponicus и сравнить их действие с эндо-Р-1,4-глюканазами T.reesei и лихеназой B.suhtiHs, а также ксилоглюканазами T.reesei и C.htcknoweme.
Структура и функции ксилоглкжана клеточных стенок растений
Общее строение ксилоглюкана. Ксилоглюкан - полисахарид из растительных клеточных стенок, состоящий в основном из D-глюкозы и D-ксидозы в соотношении примерно 4:3 а также меньших количеств D-галактозы; часто обнаруживают также остатки L-фукозы и L-арабинозы. В результате исследования ксилоглюканов разных растений стало ясно, что, в основном, их структура одинакова.
Основная цепь состоит из p-l-4-связанной D-глюкопиранозы. К каждым трем из четырех остатков глюкозы присоединены единичные остатки D-ксилопиранозы с помощью а-1-6-связей (рис. 1). Боковые группы распределены упорядоченно - три заместителя подряд, затем пропуск. Часть остатков ксилозы содержит заместители - D-галактопиранозу, присоединенную р-1-2-связями, некоторые остатки галактопиранозы дополнительно содержат L-фукогшранозильные заместитетели, присоединенные а-1-2-связями [21].
Таким образом, можно выделить основной структурный мотив ксилоглюкана -гептасахарид Xyl з Glc 4. Другие заместители,, присоединенные к ксилозе, также могут быть распределены упорядоченно, однако количество и характер замещения зависит от вида растения и даже от популяции.
Была предложена упрощенная .система представления структуры как полисахарида, так и олигосахаридов ксилоглюкана [22]. Согласно этой номенклатуре незамещенные остатки глюкозы обозначаются буквой G, остатки глюкозы содержащие ксилозильный заместитель буквой X, остатки, содержащие заместитель ксилозил галактозу буквой L, и сегмент, содержащий фукозу буквой F (обозначения для других вариантов боковых цепей, известных на сегодняшний день, на сайте http://www.ccrc.uga.edu/MTiaoyxyloglc/xtext.h.tm). Фрагмент молекулы, представленный на рис. 1, можно записать как XLFGXXXG.
Ксилоглюканы из разных источников. Первоначально ксилоглюканы были обнаружены в семенах растений, где они служат запасными полисахаридами клеточных стенок, так же как галактоманнанЫ, гаяактаны и другие [23]. Эти ксилоглюканы давали синий комплекс с йодом и получили название амилоиды [24, 25].
Наиболее изучен и промышленно используется ксилоглюкан, получаемый из семядолей семян тамаринда {Tamarindus indicd) [26, 27]. Ксилоглюкан тамаринда содержит, в основном, структурный мотив ХуЬ Glc4 (XXXG) и небольшое количество более коротких звеньев с вероятной структурой ХуЬ GIC3 (XXG) [28]. В ксилоглюканах семян растений, в том числе тамаринда, не обнаружены фукозильные заместители [21]. В расположении галактозильных заместителей наблюдается закономерность: ксилозильныи остаток дальний от восстанавливающего конца строительного звена XXXG никогда не содержит галактозильного заместителя, остальные два ксилозных остатка могут содержать заместители, расположение которых отличается от случайного [26, 27]. Таким образом, строительный блок ксшгоглкжана тамаринда можно представить как X (X или L)(X или L)G.
В большом количестве ксилоглюкан содержится в первичных клеточных стенках двудольных растений, составляя до 20-25 % первичной клеточной стенки [21]. Основным отличием от ксилоглюканов семян является наличие фукозильных заместителей. Эти заместители могут быть присоединены к галактозильному остатку, ближайшему к восстанавливающему концу мономерного звена [23],
Ксилоглюкан хлопка состоит из четырех типов звеньев: декасахарида (Glc/Xyl/Gal/Fuc, 4:3:2:1), нонасахарида (Glc/Xyl/Gal/Fuc, 4:3:1:1), октасахарида (Glc/Xyl/Gal, 4:3:1) и гептасахарида (Glc/Xyl, 4:3) в соотношении 2:7:1:3 [29].
После гидролиза ксилоглюкана гороха эндоглюканазой обнаружены нонасахарид (Glc/Xyl/Gal/Fuc, 4:3:1:1) и гептасахарид (Glc/Xyl, 4:3) в соотношении 1:1. Причем установлено, что эти звенья строго чередуются. Структуру полисахарида можно представить как (XXFGXXXG)n [21].
Ксилоглюкан клеточных стенок сои состоит из блоков XXXG, XXLG, XXFG, XLXG, XLLG, XLFG в соотношении 24:16:27:1:2:3 [30].
Ксилоглюкан яблок на 80 % состоит из блоков XXXG, XLXG, XXFG, XLFG в соотношении 4:2:3:4. Среди оставшихся 20% присутствует меньшие блоки XXG, FG, (F B.mG)G и другие, не до конца охарактеризованные [31].
Первичные клеточные стенки однодольных растений принципиально отличаются по своему строению и содержащимся полисахаридам от клеточных стенок двудольных растений [5, б]. Они содержат ксилоглюкан в меньшем количестве чем двудольные, но соотношение ксилоглюкан : целлюлоза остается приблизительно таким же, как и у двудольных. Строение ксилоглюкана однодольных растений отличается от ксилоглюкана двудольных. Как правило, их ксилоглюкан не содержит фукозильных заместителей, содержит меньше ксилозы и много меньше галактозы [21]. Гидролиз эндоглюканазой разных образцов ксилоглюканов, в том числе ячменя, риса, бамбука, давал в основном пентасахарид (Glc/Xyl, 3:2) и глюкозу, а таюке меньшие количества гексасахарида (Glc/Xyl, 4:2), трисахарида (Glc/Xyl, 2:1) и целлобиозы. Авторы [21] предполагают, что первоначально, эти ксилоглюканы содержали больше ксилозильных и галактозил-ксилозильных заместителей, которые были удалены в процессе роста, благодаря присуствующим а - ксилозидазной и р - галактозидазной активностям. Показано, что некоторые однодольные, например Allium сера и лук, содержат ксилоглюканы очень похожие на ксилоглюканы двудольных.
В последенее время накоплены данные, свидетельствующие, что ксилоглюканы растений семейства пасленовых (наиболее изучены ксилоглюканы картофеля, томата и табака) отличаются от наиболее распространенного ксилоглюкана XXXG - типа. Основным структурным мотивом ксилоглюкана пасленовых является блок XXGG-тшіа [32]. Другой их особенностью является высокое содержание арабикозы, потому их иногда называют арабинокшлоглюканами. До 60% остатков ксилозы в таких ксилоглюканах несут заместитель — арабинозу в положении 02: a-L-Ara(l —»2)-a-D-Xylp-({— 6)-P-D-Glcp [33]. Такой сегмент ксилоглюкана обозначается буквой "S".
В настоящее время продолжают находить новые структурные фрагменты ксилоглюканов. Так, недавно в ксилоглкжане из листьев дерева Argania spinosa охарактеризована серия олигосахаридов, содержащих два остатка ксилозы в боковой цели: фрагмент P-D-Xylp-fl—»2)-a-D-Xylp-fl— 6)-p-D-Glcp обозначаемый буквой "U" [34].
Отмечается, что ксилоглюканы из клеточных стенок могут быть О-ацетилированы так же, как другие полисахариды, например, пектины или ксиланы. Однако, при выделении с помощью экстракции щелочью эти эфиры гидролизуются [21]. В работе [35] на внекленочном ксилоглюкане явора установлено, что ацетйлированы в основном галактозильные остатки повторяющегося звена нонасахарида. Были найдены моно- и ди-ацетильные производные, ацетилирование наблюдали в положениях Об, 04 и ОЗ в соотношении 55-60% , 15-20%, 20-25% соответственно.
Конформация молекулы ксшіоглюкана. В результате изучения ксилоглюкана гороха методом рентгеновского рассеяния, а также моделирования структуры и расчета энергии, предложена вероятная конформация молекул ксилоглюкана [21].
Конформация основной цепи из Р(1 4) связанной глюкозы фиксирована водородными связями и представляет собой ленту, где каждое звено повернуто на 180 относительно предыдущего, как и в целлюлозе. В то же время, ксилозильные заместители имеют высокую степень подвижности. Заместители, идущие друг за другом, находятся по разные стороны ленты в результате поворотов звеньев основной цепи рис. 2. Показано также, что ксилозильные, галактозильные и фукозильные остатки не влияют на конформацию основной цепи. Предполагается, что ксилоглкжаны из других источников имеют такую же конформацию.
Хроматографическое фракционирование и очистка ферментов
Широко распространены и изучены грибные, бактериальные и растительные эндо-р-1,4-глюканазы (целлюлазы) КФ 3.2.1.4, обладающие способностью гидролизовать р-глюканы, содержащие последовательности р-1,4 связанной глюкозы. (более подробные сведения о некоторых эндоглюканазах приведены ниже).
Повсеместно распространены р-1,3-глюканазы, продуцируемые грибами и дрожжами [68]. Внутри этого класса различают эндо-Р-1.3-глюканазы (КФ 3.2.1.39) -гидролизуют внутренние Р-1,3 связи в последовательности р-1,3-глюкана и ламинариназы (КФ 3.2.1.6), которые гидролизуют внутренние р-1,3 или р-1,4 связи в смешанных р-1,3-1,4-глюканах. Для гидролиза ламинариназами необходимо, чтобы соседний остаток глюкозы (в сторону невосстанавливающего конца молекулы), был присоединен р-1,3-связью [62].
Среди бактериальных продуцентов широко распространены лихеназы КФ 3.2.1.73 - эндо-р-1,3-1,4-глюканазь1 [62, 69]. Они гидролизуют р-1,4-связь в смешанных Р-1,3-1,4-глюканах, причем для катализа необходимо, чтобы соседний остаток глюкозы (в сторону невосстанавливающего конца молекулы) был присоединен р-1,3-связью (см. рис. 5). Это свойство роднит их с ламинариназами (см. выше), отличие заключается в том, что лихеназы не способны расщеплять р-1,3-связь между остатками глюкозы.
Более редко встречаются и менее изучены эндо-р-1,6- и эндо-р-1,2-глюканазы [62]. Эндо-[3-1,4-глкжаназы. В нашей работе использовались эндо-рМ,4-глюканазы гриба T.reesei. На сегодняшний день известны 5 эндоглюканаз продуцируемых этим грибом, условно обозначаемые EG I - EG V. Для всех установлены аминокислотные последовательности, а для EG I и EG Ш - трехмерные структуры методом рентгеноструктурного анализа [11, 12, 52]. Эндоглюканазы, как правило, проявляют активность по р-глюкану из злаков наряду с активностью по традиционному субстрату для измерения эндоглюканазной активности - КМЦ. В случае EG I, EG II и EG III T.reesei их активность до р-глюкану из ячменя приблизительно равна или превышает активность по КМЦ в 1,5 - 1,9 раз [52]. В случае эндоглюканаз C.lucknowense их активность была равна или отличалась от активности по КМЦ в 1,5-3 раза. Однако, в случае EG III C.lucknowense (Cel 12A) активность по р-глюкану ячменя значительно превышала активность по КМЦ (в 11 раз) [54]. Сообщается, что значительно более высокая активность по р-глюкану ячменя присуща эндоглюканазам A.niger EglA 12 семьи и Egffi 5 семьи гликозил-гидролаз (р-глкжаназная актвность в 20 и 3 раза выше чем активность по КМЦ [48]). Одна из эндоглюканаз Thermotoga maritima Cel 74 имела в 5,8 раз более высокую Р-глюканазную активность по сравнению с КМЦазной [55]. Чем объясняется существенно более высокая Р-глюканазная активность некоторых эндоглюканаз на сегодняшний день не ясно.
Бактериальные лихеназы (эндо-Р-1,3-1,4 глюканазы). Рассмотрим более подробно свойства лихеназ (эндо-р-153-1,4-глюканаз, КФ 3.2.1.73). Бактериальные лихеназы принадлежат 16 семье гликозил-гидролаз и отличаются по структуре от ферментов с такой же специфичностью из растений принадлежащих к 17 семье гликозил-гидролаз [11, 70].
Для многих бактериальных лихеназ известны кодирующие их гены и аминокислотные последовательности (B.subtilis, B.amyloliquefaciens, B.macerans, B.circulans, B.potymixa, B.Hcheniformis, B.brevis, алкалофильного Bacillus sp. №137). Нужно сказать, что известны лихеназы не только из бацильных продуцентов, однако последние наиболее изучены. Определенная сложность состоит в том, что в 16 семью гликозил-гидролаз входят не только лихеназы, но и ферменты с иной специфичностью, в частности, ламинариназы. Ламинарнназы, как описано выше, способны расщеплять и р-1,4 и р-1,3 связь по соседству с 3-О-замещенным остатком глюкозы. Высказывается предположение, что между этими двумя ферментами в 16 семье нельзя провести четкую границу, так как обнаружены ферменты, проявляющие наряду с лихеназной большую или меньшую ламинариназную активность [69].
Бацилъные лихеназы характерны тем, что не имеют ламинариназной, КМЦ-азной или какой-либо другой активности, кроме активности к лихенану и структурно-родственным полисахаридам типа р-глюканов злаков. Все эти лихеназы — однодоменные белки с небольшой ММ около 25-30 кДа и pi 7,5-9,1. Их рН-оптимум, как правило, находится в диапазоне рН 6-7,5. Величины Км лежат в диапазоне 1,2-1,5 мг/мл для В-глюкана ячменя и 0,8-2,0 мг/мл для лихенана [69]. Удельные активности сравнивать довольно сложно, так как разные группы исследователей используют разные условия для определения ферментативной активности.
Для лихеназы Bsubtilis, использованной нами в данной работе, биохимические параметры таковы: молекулярная масса 24 кДа, рі 8Д и 8,4 (две изоформы), рН -оптимум 6,5-7,0, температурный оптимум 60С (при рН 6,5), удельная активность 118 ед/мг, фермент стабилен при 60С и при рН 2,5-9.0 (20С, 20ч). Км 0,3 мг/мл (по р-глюкану ячменя) [71, 72].
С помощью рентгеноструктурного анализа получены трехмерные структуры для лихеназ из B.licheniformis [73], B.macerans [74] и гибридного белка B.macerans/Bac. amyloliquefaciens [75, 76] обладающего повышенной термостабильностью. Их структура описывается как лектиноподобная (конковалин A) jellyroll архитектура, состоящая из антипараллельных р-листов. Найден сайт связывания иона Са2+, стабилизирующего нативную конформацию этих белков, а также сайт связывания иона Na+ уменьшающего термостабильность фермента [77]. По данным рентгеноструктурного анализа, активный центр гибридной бацильной лихеназы представляет собой ущелье, в котором находятся каталитически активные остатки [76].
Механизм катализа бацильных лихеназ изучен довольно подробно. Они действуют по механизму двухстадийного замещения (сохраняют конфигурацию). Glu 134 выступает в роли нуклеофила, a Glu 138 - как общий кислотно-основной катализатор (а.к. остатки даны в нумерации B.licheniformis) [78].
Очистка р-глюканазы 28 кДа и ксиланазы 35 кДа
Более того, очевидно, что в кислой области рН эта ксиланаза играет доминирующую роль (рис 3.6), так как при рН 3,3 ксиланаза 35 кДа практически неактивна, а ксиланаза 22 кДа сохраняла около 30 % активности по сравнению с рН 5,0.
Таким образом, именно эта кислая ксиланаза отвечает за наличие «плеча» в кислой области на рН — зависимости ксиланазной активности исходного препарата (рис. 3.22).
Невысокая экзо-р-ксилозидазная активность (по пНФ-р-Ху!) выходила широким пиком с несколькими максимумами во фракциях 19-28 (до 0,25 ед/мл), рис. 3.16.
Рассмотрим активность фракций по отношению к полисахаридам на основе р-1,4- и Р-1,3-1,4-глюканов. Большая часть активности по р-глюкану (76%) выходила в несвязавшейся фракции №1 (рис. 3.7) и обусловлена присутствием мажорной р-глкжаназы 28 кДа (ВО 28). Остальная часть активности выходила широкими пиками в ряде фракций в начале и середине градиента. Интересно, что удельная активность фракции №1 по Р-глюкану существенно выше, чем по КМЦ (75 и 0,6 ед/мл, соответственно), что отличает содержащуюся в ней BG 28 от типичных грибных эндоглюканаз, активности которых по р-глюкану и КМЦ близки. В остальных фракциях (25-28) наблюдались небольшие уровни активности по КМЦ и р-глюкану (рис. 3.7, 3.9), что говорит, по-видимому, о присутствии в этих фракциях минорной эндоглюканазы. Ксилоглюканазная активность у этих фракций отсутствовала (рис. 3.8).
Интересной оказалась фракция №37, представляющая пик в конце градиента при 0,31М NaCl, которая обладала высокой активностью по ксилоглюкану (6 ед/мл ). Необычным было то, что данная фракция проявляла незначительную., в 10-30 раз меньшую, активность по КМЦ и р-глюкану (см. рис.3.7, 3.8, 3.9). Таким образом, фермент содержавшийся в этой фракции, отличается от известных эндоглюканаз и, по-видимому, является специфичной ксидоглюканазой. В дальнейшем его выделили хроматографией на MonoQ при более низком значении рН 4,1. Данная ксилоглюканаза (XG 32) имела молекулярную массу 32 кДа.
Для дальнейшего описания комплекса ферментов, гидролизующих Р-1,3-1,4-глюканы, интересно рассмотреть активности ферментов экзо-деполимераз, которые расщепляют олигосахариды. Мы изучали активности фракций по выходу глюкозы с помощью глюкозооксидазно-пероксидазного метода при гидролизе целлобиозы и олигомеров р-глюкана, долученых под действием бацильной лихеназы (Глава 1, рис.5 Б),. Профиль активности по целлобиозе приведен на рис. ЗЛО. Эта активность выходила широким пиком с максимумом во фракциях 22-24 и совпадала с активностью по олигомерам Р-глюкана (данные приведены только в табл 1 приложения А), а также с профилями активности по пНФ-р-Б-глюкопиранозиду и пНФ-р-О-целлобиозиду (рис. 3.11, 3.12). Активность была выше всего по целлобиозе (до 9 ед/мл), немного ниже по олигомерам р-глюкана (до 6 ед/мл), затем по пНФ-p-D-Glc (до 3 ед/мл) и пНФ-p-D-Cell (до 0,5 ед/мл). Очевидно, что в данном случае этот фермент представлял Р-глюкозидазу (целлобиазу). Интересно, что в этих же фракциях присутствовал небольшой пик активности по ламинарину (р-1,3-глюкану) - до 1 ед/мл (рис. 3.17) и р-глкжану (до 2 ед/мл), так что возможно, что этот фермент имеет небольшую активность и по полимерным субстратам.
Заметная активность по пНФ-Р-Е)-целлобиозиду (0,3 ед/мл), но не по пНФ-p-D-Glc, присутствовала в несвязавшейся фракции. Эта активность обусловлена ксиланазой 35 кДа, которая, как оказалось, проявляет небольшую активность по данному субстрату.
Коротко рассмотрим также профили активностей по другим субстратам. Во фракции 29 находился максимум активности по разветвленному арабинану и пНФ-a-L-арабинофуранозиду (рис. 3.14, 3.15). Этот пик обусловлен присутствием a-L-арабинофуранозидазы 64 кДа (АГ 64), описанной ранее [123]. В этом же пике присутствовала и глюкоамилаза 140 кДа (GA 140) [124, 125], которую можно определить по ее активности к растворимому крахмалу (рис 3.21); белковая полоса данного фермента таюке видна на ДДС-электрофорезе фракции 29 (рис. 3,3, дорожка 10).
Ферменты - пектиназы Ajaponicus были подробно описаны в работе [126]. Поэтому в нашей работе мы измеряли только полигалактуроназную активность, наибольшее количество которой (41%) выходило в несвязавшейся фракции (PG)(pHc. 3.18). Остальная часть активности выходила несколькими пиками в градиенте сопи.
Небольшая активность по галактану выходила двумя пиками во фракциях 17-19 и 39, 40, рис. 3.13. Важные для применения препарата в кормах, достаточно высокие а- и р-галактозидазные активности (по пНФ-a-Gal и пНФ-P-Gal), выходили широкими пиками в начале градиента с максимумами во фракциях 13-16 (до 6 ед/мл) и 9-11 (до 4 ед/мл), соответственно (рис. 3.19, 3.20). 3.2. Очистка Р-глюканазы 28 кДа и ксиланазы 35 кДа. Несвязавшуюся фракцию после первой стадии (фр. № 1) подвергали гидрофобной хроматографии на колонке Source Isopropyl (объемом 8 мл). Хроматограмма приведена на рис. 3.23, активности фракций - в табл. 2 приложения А. Почти вся активность по р-глюкану и ксипану выходила одним пиком при 1 1 М сульфата аммония (фр. №6), который содержал, по данным ДДС-электрофореза, две белковых полосы (28 и 35 кДа), которые были и в исходной фракции (рис. 3.3 А, дорожка 1). Таким образом, произошла очистка от некоторых минорных примесей и пигмента, но разделения двух основных белков не произошло.
Механизм гидролиза р-глкжана под действием р-глюканаз, эндоглюканаз и экзо-р-глюкозидазы
Дополнительная информация о механизме действия ферментов была получена при изучении состава низкомолекулярных продуктов исчерпывающего гидролиза р-глюкана исследуемыми ферментами. Пробы, отобранные в конечной точке гидролиза (с использованием 10-кратного количества фермента), анализировали при помощи ВЭЖХ на колонке с привитой аминофазой.
В случае лихеназы B,subtilis наблюдали 2 пика, выходящих несколько раньше, чем целлотри- и целлотетрасахарид (рис. 5.10, кривая №1). Из литературы известно, что при действии на р-1,3-р-1,4-глюканы бактериальные лихеназы расщепляют р-1,4- связь следующую за (3-1,3- связью. Таким образом, из р-глюкана ячменя может образоваться только 2 основных продукта: три- (А) и тетрасахарнд (В) с Р-1,3 связью на восстанавливающем конце, причем трисахарида должно быть в 2-3 раза больше (см. литературный обзор).
Именно такая картина наблюдалась в нашем случае. Поэтому, в случае лихеназы мы идентифицировали полученные нами 2 пика как продукты А и В, которые можно использовать как стандарты, наряду с целлоолигосахаридами и ламинарибиозой (дисахарид p-Glc-(1 3)-p-Glc).
В случае р-глюканазы 28 кДа наблюдали те же два пика, что и в случае лихеназы, в том же соотношении (рис. 5.10, кривая №2). Очевидно это тоже три- и тетрасахарид, содержащие одну р-1,3 связь, однако достоверно определить, что это продукты А и В с р-1,3 связью на восстанавливающем конце нельзя, поскольку нам неизвестно время удерживания три- и тетрасахаридов с другим положением р-1,3 связи.
В случае других ферментов продукты были иными. Экзо-р-глюкозидаза Т. reesei образовывала глюкозу в качестве единственного продукта гидролиза, что вполне соответствует проведенной классификации данного фермента и экзо-характеру деполимеризации. Все эндоглюканазы T.reesei образовывали глюкозу и целлобиозу и также три- и/или тетрасахариды. Важно отметить, что ламинарибиоза в числе продуктов гидролиза Р-глюкана отсутствовала. Обе формы EG I давали только тетрасахарид, a EG П только трисахарид, EG III давала трисахарид и небольшое количество тетрасахарида.
Интересно, что во всех случаях времена удерживания три- и тетрасахарида совпадали со временем удерживания продуктов А и В, указанных выше, и, соответственно, отличались от целлотриозы и целлотетраозы. К сожалению, мы не можем показать, что во всех случаях это действительно продукты со структурами А и В. Можно лишь утверждать, что все Р-1,3- связи остались в три и тетрасахаридах (поскольку ламинарибиоза отсутствовала), либо были частично расщеплены ферментами, что не соответствует современным представлениям о механизме действия эндоглюканаз Т. reesei.
Как и следовало ожидать, в случае двух форм EG I (высоко- и низкомолекулярной) качественный состав продуктов гидролиза оказался одинаковым, а количественный - очень близким.
В случае ксилоглюканазы 78 кДа из C.lucknowense никаких, низкомолекулярных продуктов не было обнаружено для пробы, где глубина гидролиза составила 6% (предельная достигнутая в нашем случае глубина гидролиза), поэтому хроматограмма не приведена. Этот факт дополнительно свидетельствует в пользу классификации этого фермента при действии на [З-глкжан как эндо-деполимеразы.
Глубина исчерпывающего гидролиза и состав продуктов в количественном соотношении (по площадям пиков, что приблизительно, соответствует соотношениям по массам) отражены в таблице 5.3.
В предыдущем разделе мы определили, что BG 28 и лихеназа действуют на р-глюкан ячменя очень похожим образом. Продуктами исчерпывающего гидролиза являются два, по-видимому, одинаковых олигосахарида - А и В в одинаковом соотношении. В случае лихеназы эти продукты возникают из-за расщепления Р-1-4-гликозидной связи, следующей (в сторону восстанавливающего конца) после р-1-3-связи. Таким образом, получаются олигосахариды, построенные из остатков глюкозы, соединенных Р-1-4- связями, но с одной р-1-3- связью, которой присоединен восстанавливающий остаток глюкозы. Вследствие особенностей строения р-глюкана ячменя преобладающими продуктами являются трисахарид А и тетрасахарид В (см. предыдущий раздел). Однако, в случае BG 28 мы не смогли определить, только по данным хроматографии точное строение трисахарида (по времени удерживания похожего на «А») и тетрасахарида (похожего на «В»), полученных в результате действия фермента. В результате этого, точно неизвестно, какую именно р-1-4- связь расщепляет Р-глюканаза Ajaponicus, хотя очевидно, что положение расщепляемой связи привязано к положению единичных Р-1-3- связей в р-глюкане.
Для выяснения строения продуктов (условно «А» и «В») в случае BG 28 мы решили подвергнуть их дальнейшему гидролизу экзо-р-глюкозидазой T.reesei, отщепляющей единичные остатки глюкозы с невосстанавливающего конца олигосахаридов,. и проследить выход моно- и олигосахаридов (продуктов гидролиза), сравнив их с продуктами гидролиза олигосахаридов А и В, полученных под действием лихеназы.
exo-Gtu T.reesei - это экзо-р-глюкозндаза (некоторые авторы классифицируют ее как Р-глкжозидазу), 3-ей семьи гликозил-гидролаз (см. раздел 4), способная расщеплять как димеры, так и полимеры с различным типом связей исключительно по экзо-деполимеразному механизму [52,132]. Специфичность этого фермента к конфигурации расщепляемой связи изучена на примере димеров глюкозы, соединенных р-1-6, р-1-4, Р-1-3 и Р-1-2 связью. Наибольшая активность наблюдалась в случае ламинарибиозы (Р-1,3; 8,9 ед/мг), затем целлобиозы (Р-1,4; 7,3 ед/мг) и софорозы (р-1,2; 6,8 ед/мг) [52]. Наименьшей была активность по гентиобиозе (р-1,6; 2,5 ед/мг). В нашем случае важно, что фермент способен отщеплять с близкими скоростями остатки глюкозы, присоединенные как Р-1-3, так и Р-1-4 связями.
![9-фурилнафто[2,3-b]фураны : Синтез, свойства и реакции](/i/i/4412/311908.png "9-фурилнафто[2,3-b]фураны : Синтез, свойства и реакции Мельчин Владимир Викторович")
![Синтез новых гетероциклических систем на основе 3-аминотиено[2,3-b]пиридинов и их свойства](/i/i/4344/444254.png "Синтез новых гетероциклических систем на основе 3-аминотиено[2,3-b]пиридинов и их свойства Василин Владимир Константинович")
![Синтез и свойства тетразоло[1,5-b][1,2,4]триазинов](/i/i/4386/289117.png "Синтез и свойства тетразоло[1,5-b][1,2,4]триазинов Шестакова Татьяна Сергеевна")
