Введение к работе
Актуальность темы Сжигание огромного количества ископаемых видов топлива, таких как нефть, газ и уголь, привело в последние десятилетия к так называемому «парниковому эффекту» и общему ухудшению экологической обстановки на Земле Кроме того, в последнее время резко возросли цены на нефть и другие энергоносители В связи с этим возник интерес к альтернативным источникам топлива, например, этанолу и бутанолу, которые можно получить из возобновляемой растительной биомассы путем ее ферментативного гидролиза с последующим сбраживанием получаемых Сахаров
Ферменты, осуществляющие биодеградцию целлюлозы в природе, продуцируются в основном микроскопическими грибами и бактериями Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз различные штаммы грибов Trichoderma (Т reesei, Т longibrachiatum) играют ведущую роль В научной литературе преобладает точка зрения, чго целлюлазные комплексы, продуцируемые мутантними штаммами Т reesei, являются наиболее эффективными разрушителями природной целлюлозы и их практически невозможно превзойти по скорости и глубине гидролиза субстрата Однако, существенным недостатком этого продуцента целлютаз является низкая секреция р-глюкозидазы, отвечающей за конверсию промежуточных целлоолигосахаридов в конечный продукт — глюкозу
Ключевыми ферментами целлюлазного комплекса, ответственными за глубокий гидролиз кристаллической целлюлозы, являются целлобиогидролазы (ЦБГ, КФ 3 2 191), основным продуктом действия которых является целлобиоза Целлобиогидролазы I и II Г reesei являются наиболее изученными ферментами Довольно много информации также опубликовано о ферментах данного типа действия из грибов Humicola spp , Phanerochaete chrysosponum и некоторых других О свойствах целлобиогидролаз из других грибных продуцентов (особенно термофильных) известно значительно меньше, несмотря на то, что в базах данных имеется довольно большое количество их аминокислотных последовательностей, транслированных из генов
В результате совместных исследований, проведенных в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН и на кафедре химической энзимологии МГУ, был найден перспективный термофильный продуцент целлюлаз и гемицеллюлаз — гриб Chrysosponum lucknowense, на основе которого были получены мутантные штаммы, отличающиеся высокой секреторной способностью Ранее в нашей лаборатории были изучены свойства ксиланаз и эндоглюканаз из С lucknowense, в то время как исследования целлобиогидролаз не проводилось, несмотря на то, что были получены предварительные данные об их наличии в составе целлюлазного комплекса данного продуцента Актуальность данного исследования продиктована как необходимостью сие і ємної о изучения свойств целлобиогидролаз из новых источников (в частности С lucknowense), так и возможностью в перспективе использовать их для гидролиза целлюлозосодержащего сырья
Цель и задачи исследования Целью работы являлось изучение -биохимических и физико-химических свойств всех целлобиогидрола? V» секретируемых грибом С lucknowense, а также оценка эффективности их\Г)
действия на различные виды целлюлозосодержащих материалов
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи
Выделить все секретируемые грибом С lucknowense целлобиогидролазы в гомогенном виде и изучить их свойства в сравнении со свойствами ЦБГ I и II Т reesei, которые являются типичными и наиболее изученными представителями данного класса ферментов
Исследовать возможный синергизм между целлобиогидролазами и эндоглюканазами С lucknowense
Оценить эффективность действия различных целлобиогидролаз на целлюлозные субстраты, разработать подход для создания на основе целлобиогидролаз и других ферментов С lucknowense ферментных композиций (смесей) для высокоэффективного гидролиза лигноцеллюлозных материалов
Научная новизна. Впервые выделены и охарактеризованы целлобиогидролазы из С lucknowense две формы ЦБГ 1а (Се17А), ЦБГ lb (Се17В), ЦБГ Па (Се16А) и ЦБГ lib (СеІбВ) На основании анализа субстратной специфичности и аминокислотных последовательностей ферменты классифицированы по их принадлежности к 6-й и 7-й семьям гликозид-гидролаз Показано, что высокомолекулярная форма ЦБГ 1а и ЦБГ lib состоят из каталитического домена и целлюлозосвязывающего модуля (ЦСМ), соединенных пептидным линкером, в то время как у ЦБГ lb, ЦБГ Па и низкомолекулярной формы ЦБГ 1а, образующейся путем частичного прогеолиза полноразмерного фермента, ЦСМ отсутствует Выявлены ключевые аминокисчотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активных центрах целлобиогидролаз С lucknowense Выявлен ярко выраженный синергизм между ЦБГ 1а и ЦБГ ПЬ при гидролизе хлопка, сопоставимый по масштабу с синергизмом между целлобиогидролазами и эндоглюканазами
Практическая значимость работы. Найдены термостабильные высокоактивные целлобиогидролазы С lucknowense (ЦБГ 1а, ЦБГ ПЬ), существенно превосходящие по стабильности ферменты Т reesei ЦБГ ПЬ также превосходила все изученные целлобиогидролазы (включая Т reesei) по эффективности гидролиза кристаллической целлюлозы Разработан подход для рационального дизайна ферментных смесей способных осуществлять высокоэффективный гидролиз целлюлозосодержащих материалов Показана принципиальная возможность создания на основе целлобиогидролаз и других ферментов С lucknowense мультиферментных композиций, превосходящих по гидролитической эффективности ферментные препараты Т reesei, а в ряде случаев и искусственные смеси, составленные из наиболее активных целлюлаз Т reesei
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях международной конференции «Биокатализ-2007» (Москва-Санкт-Петербург, 2007), четвертом международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), международных конференциях «Биокатализ-2005» (Санкт-Петербург, 2005), «Энергия из
биомассы» (Киев, 2004), 22-й конференции по генетике грибов (Асиломар, Калифорния, США, 2003), Седьмой Европейской конференции по генетике грибов (Копенгаген, Дания, 2004)
Публикации По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (две главы), экспериментальной части (одна глава), четырех глав, в которых приведены результаты и их обсуждение , выводов и списка цитируемой литературы, включающего 160 источников Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, включает 47 рисунка и 20 таблиц.
