Введение к работе
Актуальность темы. Сжигание огромного количества ископаемых видов топлива, таких как нефть, газ и уголь, привело в последнее десятилетие к так называемому «парниковому эффекту» и общему ухудшениею экологической обстановки на Земле. Кроме того, в послденее время резко возросли цены на нефть и другие энергоносители.. В связи с этим возник интерес к альтернативным источникам топлива, например, этанолу и бутанолу, которые можно получить из возобновляемой растительной биомассы путем ее ферментативного гидролиза с последующим сбраживанием получаемых Сахаров.
Ферменты, осуществляющие биодеградцию целлюлозы в природе, продуцируются в основном микроскопическими грибами и бактериями. Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз различные штаммы грибов Trichoderma (Т. reesei, Т. longibrachiatum) играют ведущую роль. В научной литературе преобладает точка зрения, что целлюлазные комплексы, продуцируемые мутантными штаммами Т. reesei, являются наиболее эффективными разрушителями природной целлюлозы и их практически невозможно превзойти по скорости и глубине гидролиза субстрата. Однако, существенным недостатком этого продуцента целлюлаз является низкая секреция Р-глюкозидазы, отвечающей за конверсию промежуточных целлоолигосахаридов в конечный продукт — глюкозу.
Ключевыми ферментами целлюлазного комплекса, ответственными за глубокий гидролиз кристаллической целлюлозы, являются целлобиогидролазы (ЦБГ, КФЗ.2.1.91), основным продуктом действия которых является целлобиоза. Целлобиогидролазы I и II Т. reesei являются наиболее изученными ферментами. Довольно много информации опубликовано о ферментах данного типа действия из грибов Humicola spp, Phanerochaete chrysosporium и некоторых других. О свойствах целобиогидролаза из других грибных продуцентов (особенно термофильных) известно значительно меньше, несмотря на то, что в базах данных имеется довольно большое количество их аминокислотных последовательностей, транслированных из генов.
В результате совместных исследований, проведенных в Институте Биохимии и Физиологии Микроорганизмов РАН и на кафедре химической энзимологии МГУ, был найден перспективный термофильный продуцент целлюлаз и гемицеллюлаз — гриб Chrysosporium lucknowense, на основе которого были получены мутантные штаммы, отличающиеся высокой секреторной способностью. Ранее в нашей лаборатории были изучены свойства ксиланаз и эндоглюканаз из С. chrysosporium, в то время как исследования целлобиогидролаз не проводилось, несмотря на то, что были получены предварительные данные об их наличии в составе целлюлазного комплекса данного продуцента. Актуальность данного исследования продиктована как необходимостью системного изучения свойств целлобиогидролаз из новых источников (в частности С. lucknowense), так и возможностью в перспективе использовать их для гидролиза целлюлозосодержащего сырья.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение биохимических и физико-химических свойств всех целлобиогидролаз, секретируемых грибом С. lucknowense, а также оценка эффективности их
действия на различные виды целлюлозосодержащих материалов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Выделить все секретируемые грибом С. lucknowense целлобиогидролазы в гомогенном виде и изучить их свойства в сравнении со свойствами ЦБГ I и II Т. reesei, которые являются типичными и наиболее изученными представителями данного класса ферментов.
Исследовать возможный синергизм между целлобиогидролазами с эндоглюканазами С. lucknowense.
Оценить эффективность действия различных целлобиогидролаз на целлюлозные субстраты и на основе разработать на основе целлобиогидролаз и других ферментов С. lucknowense подход для создаия ферментных композиций (смесей) для высокоэффективного гидролиза лигноцеллюлозных материалов.
Научная новизна. Впервые выделены и охарактеризованы целлобиогидролазы из С. lucknowense: две формы ЦБГ 1а (Се17А), ЦБГ lb (Се17В), ЦБГ Па (Се16А) и ЦБГ ПЬ (СеІбВ). На основании анализа субстратной специфичности и аминокислотных последовательностей ферменты классифицированы по их принадлежности к 6-й и 7-й семьям гликозид-гидролаз.
Показано, что выоскомолекулярная форма ЦБГ 1а и ЦБГ ПЬ состоят из каталитического домена и целлюлозо связывающего модуля (ЦСМ), соединенных пептидным линкером, в то время как у ЦБГ lb, ЦБГ Па и низкомолекулярной формы ЦБГ 1а, образующейся путем ограниченного протеолиза полноразмерного фермента, ЦСМ отсутствует. Выявлены ключевые аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активных центрах целлобиогидролаз С. lucknowense. Выявлен ярко выраженный синергизм между ЦБГ 1а и ЦБГ lib при гидролизе хлопка, сопоставимый по масштабу с синергизмом между целлобиогидролазами и эндоглюканазами.
Практическая значимость работы. Найдены термо стабильные высокоактивные целлобиогидролазы С. lucknowense (ЦБГ 1а, ЦБГ ПЬ), существенно превосходящие по стабильности ферменты Т. reesei. ЦБГ lib также превосходила все изученные целлобиогидролазы (включая Т. reesei) по эффектиновсти гидролиза кристаллической целлюлозы.
Разработан подход для рационального дизайна ферментных смесей для высокоэффективного гидролиза различных лигноцеллюлозных материалов. Показана принципиальная возможность создания на основе целлобиогидролаз и других ферментов С. lucknowense мультифермернтных композиций, превосходящих по гидролитической эффективности ферментные препараты Т. reesei, а в ряде случаев и искусственные смеси, составленные из наиболее активных целлюлаз Т. reesei.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: международной конференции «Биокатализ-2007» (Москва-Санкт-Петербург, 2007), четвертом международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» Москва 2007, международных конференциях «Биокатализ-2005» (Санкт-Петербург, 2005), «Энергия из
биомассы» (Киев, 2004), 22 конференция «Генетика грибов» (Асиломар, Калифорния, СШФ), 7-ая Европейская конференция «Генетика грибов» (Копенгаген, Дания).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), экспериментальной части (1 главы), четырех глав, в которых приведены результаты и их обсуждения , выводов и списка цитируемой литературы, включащего 160 источников. Работы изложена на 125 страницах машинописного текста, включает 47 рисунка и 20 таблиц.
