Содержание к диссертации
Введение
1. Целлюлоза и р-глюканы 8
2. Компонентный состав и свойства целлюлазных комплексов 10
2.1. Классификация, субстратная специфичность и биохимические свойства целлюлаз 10
2.2. Механизм действия целлюлаз 14
2.3. Доменная структура целлюлаз 19
2.4. Современные представления о классификации гликозил-гидролаз 21
3. Грибные и бактериальные продуценты «нейтральных»целлюлаз 22
4. Применение целлюлаз в текстильной промышлен ности 24
5. Материалы и методы 27
5.1. Ферментные препараты 27
5.2. Субстраты и реактивы 27
5.3. Определение концентрации белка 30
5.4. Хроматографическое разделение ферментов 30
5.5. Определение биохимических характеристик индивидуальных ферментов, титрование белков ферментного комплекса 31
5.6. Методы определения активности ферментов 32
5.6.1. Определение активности по отношению к полисахаридным субстратам 32
5.6.2. Определение активности по полисахаридным субстратам с помощью планшетного метода 32
5.6.3. Определение активности по и-нитрофенильным производным Сахаров 33
5.6.4. Определение активности по «-нитрофенильным производным Сахаров на планшете 34
5.7. Изучение зависимостей активности ферментов от рН и температуры 34
5.8. Изучение термостабильности ферментов 35
5.9. Определение состава низкомолекулярных продуктов гидролиза полимерных субстратов 35
5.10. Адсорбционная способность ферментов 35
5.11. Изучение кинетики гидролиза хлопка и МКЦ 36
5.12. Определение тополитической активности целлюлаз 36
5.13. Оценка влияния целлюлаз на ресорбцию индиго 37
5.14. Масс-спектрометрический анализ пептидов 37
5.15. Методы компьютерного моделирования структуры белка 38
6. Хроматографическое разделение ферментного комплекса с. Lucknowense 39
6.1. Определение компонентного состава ферментного комплекса С. lucknowense 39
6.2. Анализ увеличения экспрессии мультикопированных ферментов 48
7. Выделение и очистка индивидуальных компонентов целлюлазного комплекса с. Lucknowense 57
8. Свойства эндоглюканаз с. Lucknowense 69
8.1. Субстратная специфичность и классификация целлюлаз 69
8.2. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов ЭГ 44 к Да и ЭГ 51 кДа 73
8.3. Основные биохимические свойства эндоглюканаз 75
8.4. Кинетические параметры действия выделенных эндоглюканаз 81
8.5. Состав низкомолекулярных продуктов при глубоком гидролизе р-глюкана 82
8.6. Адсорбционная способность целлюлаз. Действие ферментов на МКЦ 83
8.7. Тополитические свойства ферментов 85
8.8. Изучение влияния целлюлаз С. lucknowense наресорбцию индиго 90
9. Молекулярное строение ЭГ IIIИ ЭГ V С. lucknowense 92
9.1. Аминокислотные последовательности ЭГ III и ЭГ V С. lucknowense 92
9.2. Моделирование вторичной и третичной структур ЭГ III и ЭГ V С. lucknowense 100
Выводы 110
- Механизм действия целлюлаз
- Определение концентрации белка
- Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов ЭГ 44 к Да и ЭГ 51 кДа
- Изучение влияния целлюлаз С. lucknowense наресорбцию индиго
Введение к работе
Целлюлолитические ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы,
самого распространенного биополимера на Земле, занимают центральное место в
круговороте органического углерода [1]. Основными микроорганизмами,
продуцирующими целлюлазы, являются грибы - возбудители мягкой и бурой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий. История исследования целлюлаз насчитывает уже более 50 лет. В течение этого периода важнейшим свойством, характеризующим целлюлазный комплекс, считалась его способность к глубокой деструкции целлюлозосодержащих субстратов (так называемая «сахаролитическая» активность). Поэтому исследования, в основном, были направлены на поиск ферментных препаратов и их продуцентов, эффективно осуществляющих гидролиз целлюлозы до глюкозы. Целлюлазы, выделенные из этих препаратов, как правило, проявляли максимальную активность в кислой среде (рН 4-5) [2], но различались по субстратной специфичности, адсорбционной способности и термостабильности [3,4, 5].
Целлюлазы находят все более широкое применение в текстильной, целлюлозно-бумажной, пищевой и других отраслях промышленности [6]. В последнее время усилия исследователей направлены на поиск целлюлолитических ферментов, способных мягко воздействовать на поверхность целлюлозного субстрата, не приводя к глубокой деструкции целлюлозной матрицы (для обозначения этой способности целлюлаз мы предлагаем использовать термин «тополитическая» активность) [7, 8]. Обнаружение ферментов с тополитической активностью открыло новые возможности их применения: например, для депигментации джинсовых изделий с целью придания им более привлекательных потребительских свойств (альтернатива традиционным химическим способам «варки», а также обработке пемзой); для биополировки текстильных материалов с целью удаления микродефектов и ворса; как компонента моющих средств и т. д. [9, 10, 11, 12]. Важно отметить, что замена известных химических способов обработки целлюлозных материалов на ферментативные приводит к проведению процесса в более мягких условиях и уменьшает ущерб, наносимый окружающей среде.
Следует подчеркнуть, что для упомянутых выше целей предпочтительны ферменты, сохраняющие высокую активность и стабильность в условиях проведения процесса - как правило, это нейтральные или щелочные значения рН и повышенная температура [И, 13]. В связи с этим наиболее перспективными для использования являются так называемые «нейтральные» целлюлазы, демонстрирующие высокую
активность и стабильность при значениях рН, близких к нейтральным, (рН 6-8) и температурах 50С и выше. Поэтому актуальными направлениями исследований в этой области становятся поиск новых штаммов-продуцентов «нейтральных» целлюлаз, получение мутантных штаммов при помощи методов классического мутагенеза или генной инженерии, а также выделение и исследование свойств ключевых тополитических ферментов.
В Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН был осуществлен скрининг продуцентов целлюлаз, высокоактивных и стабильных при нейтральных и щелочных значениях рН, в результате чего был найден мицелиальный гриб Chrysosporium lucknowense, целлюлазный комплекс которого ранее не исследовался. Гриб С. lucknowense, относящийся к классу аскомицетов, был выделен из щелочной почвы Дальнего Востока, и далее путем классического мутагенеза были получены мутантные штаммы, отличающиеся повышенным уровнем секреции целлюлаз и гемицеллюлаз. Ферментные препараты на основе данного продуцента продемонстрировали высокую эффективность при обработке хлопчатобумажной ткани [14]. Однако данные, касающиеся состава и особенностей функционирования ферментного комплекса С. lucknowense, а также сведения по ферментам, продуцируемым другими видами грибов рода Chrysosporium, практически отсутствуют в научной литературе.
Основной целью данной работы было выделение и изучение свойств ферментов
целлюлазного комплекса, продуцируемого мутантным штаммом гриба С. lucknowense. В
цели работы также входило выявление ключевых целлюлаз, отвечающих за высокую
эффективность ферментных препаратов С. lucknowense при обработке
хлопчатобумажной ткани с целью создания ферментных препаратов с улучшенными биотехнологическими характеристиками.
Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:
Определить компонентный состав ферментного комплекса С. lucknowense
Выделить в гомогенном виде все целлюлазные ферменты комплекса и изучить их свойства.
Выявить ключевые тополитические целлюлазы С. lucknowense.
Получить и проанализировать свойства ферментных препаратов на основе штаммов С. lucknowense с мультикопированными генами собственных целлюлаз, обладающих наибольшей тополитической активностью.
Механизм действия целлюлаз
Собственно гидролитической стадии предшествует стадия адсорбции ферментов на поверхности нерастворимого субстрата. Скорость адсорбции ферментов достаточно велика по сравнению со скоростью гидролиза, и перенос ферментов к поверхности субстрата не является лимитирующей стадией процесса расщепления нерастворимого субстрата [53, 54]. Эффективность гидролиза полисахаридного субстрата зависит от сбалансированности состава ферментного комплекса и уровня активности компонентов, то есть от качественного и количественного состава комплекса [15]. Характерной особенностью компонентов целлюлазного комплекса является наличие синергизма в действии их компонентов. Синергизмом называют увеличение эффективности действия двух или несколько компонентов системы при их совместном присутствии по сравнению с суммарным (аддитивным) проявлением действия этих компонентов по отдельности [15, 43]. Природа синергизма обусловлена реализацией кинетических закономерностей последовательно (или последовательно-параллельно) действующей полиферментной системы, когда продукт действия одного из ферментов является субстратом для другого (без каких-либо дополнительных взаимодействий между ферментами). Взаимодействие ЭГ и ЦБГ служит примером реализации «последовательного» механизма: первый из ферментов осуществляет деполимеризацию целлюлозы и таким образом увеличивает концентрацию концевых групп, являющихся субстратом для второго фермента [15]. Существуют два основных механизма, посредством которых карбогидразы расщепляют гликозидную связь (рис 2). Эти механизмы дискриминируются стереохимическими характеристиками продуктов реакции: в одном случае при гидролизе происходит обращение конфигурации аномерного углерода, в другом случае конфигурация аномерного углерода сохраняется. «Обращающие» ферменты действуют по механизму одностадийного замещения, при котором молекула воды атакует непосредственно аномерный центр, замещая таким образом уходящую группу. Такой механизм протекает посредством общего кислотно-основного катализа в активном центре фермента через оксикарбокатионное переходное состояние (две карбоксильные группы, осуществляющие катализ расположены на расстоянии 9-10 А [55]). «Сохраняющие» ферменты действуют по механизму двухстадийного замещения (рис. 2) через образование гликозил-фермента в качестве ковалентного интермедиата [56, 57, 58].
Первая стадия включает атаку аномерного центра ферментным нуклеофилом (глутаминовый или аспарагиновый аминокислотный остаток [59, 60, 61, 62, 56]). Замещение уходящей группы катализируется по общему кислотному механизму протонированным аминокислотным остатком, находящимся на противоположной стороне активного центра (карбоксильные группы, выполняющие функции нуклеофила кислотно-основного катализатора расположены на расстоянии 5.5 А [63]). Эта стадия сопровождается образованием промежуточного ковалентного ацильного интермедиата гликозил-фермента. Наличие уходящей группы указывает на то, что образование интермедиата протекает относительно быстро, поэтому гликозил-фермент накапливается. На второй стадии вода атакует аномерный центр гликозил-фермента. Атака воды катализируется депротонированным аминокислотным остатком по общему основному механизму. В результате образуется продукт, а фермент возвращается в исходное состояние. Обе стадии протекают через промежуточные состояния оксикарбокатионного характера [56, 57, 58]. Среди целлюлаз хорошо изучены механизм действия и структура активного центра ЦБГ II из Т. reesei [56]. В трехмерной структуре каталитического домена ЦБГ II выявлена туннельная организация активного центра с четырьмя адсорбционными центрами связывания субстрата (гликопиранозид-связывающими субсайтами). Существует общее правило для карбогидраз, согласно которому субсайты нумеруются от места разрыва гликозидной связи: положительными числами в направлении восстанавливающего конца молекулы, т.е. уходящей группы или агликона, и отрицательными - в направлении невосстанавливающего конца, остающегося связанным с каталитическим центром [64] (либо, по устаревшей уже схеме, использовавшейся для описания активного центра лизоцима, латинскими буквами «А», «В», «С», «D» и т.д., см. рис. 5 [65]). ЦБГ II атакует невосстанавливающий конец целлюлозы, расщепляя Р-1,4-гликозидные связи с обращением конфигурации аномерного углерода. Предполагается, что механизм катализа ЦБГ II является «одностадийным», в нем участвуют 2 аспарагиновьгх остатка (Asp1 и Asp22l). По-видимому, расщепление происходит между подцентрами связывания субстрата В и С (нумерация по типу лизоцима), где 2 аспарагиновьгх остатка расположены ближе друг к другу на одной и той же стороне активного центра. Остаток Asp 175 имеет тенденцию находиться в ионизированном состоянии, в то время как Asp22 легче протонируется. Следовательно, Asp221 выступает в качестве донора протона, а роль остатка Asp 175 заключается в стабилизации положительно заряженного интермедиата.
Связывание субстрата в активном центре ЦБГ II происходит за счет трех типов взаимодействий: водородных связей, «солевого мостика» и гидрофобного взаимодействия различных триптофановых остатков, в частности Тгр135 в подцентре А, где более гидрофобная р-сторона глюкозы «упаковывается в него». Остальные триптофаны выстраиваются в линию с сс-стороной глюкозы во время продуктивного связывания [56]. Для определения «ключевых» аминокислотных остатков самыми распространенными методами являются сайт-направленный мутагенез и химическая модификация. Методом направленного мутагенеза было, например, установлено, что ключевую роль в катализе углеводных субстратов ферментами целлюлазного комплекса Т. reesei играют остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот активного центра: Glu 1" и Glu200 у ЭГ III [66], Asp10 и Asp121 у ЭГ V из Humicola insolens [68, 69], Glu212 и Glu217 у ЦБГ I [58], Aspl75 и Asp221 у ЦБГ П. Более 40 лет назад Элвин Риз предложил свою «d-Cx» гипотезу, чтобы объяснить причину, по которой некоторые грибные целлюлазные системы обладают способностью гидролизовать нерастворимую кристаллическую целлюлозу до глюкозы, в то время как другие — только аморфную или растворимые производные целлюлозы (например, КМЦ [69]). Согласно гипотезе Риза, целлюлазы, способные гидролизовать кристаллическую целлюлозу, содержат в своей структуре некий «С і-фактор», отвечающий за физическое связывание фермента с целлюлозой, и каталитический «Сх-фактор». Целлюлазы, лишенные Сі-фактора, неспособны осуществлять гидролиз кристаллической целлюлозы [69, 70]. По сути, Риз постулировал наличие двух функциональных доменов в целлюлазах такого типа. Результаты опытов по протеолизу целлюлаз (в частности, папаином), рентгеноструктурные и генетические исследования основных компонентов из различных целлюлазных комплексов - прежде всего, ЦБГ и ЭГ из Т. reesei [69, 71-75], а также других целлюлаз из Т. harzianum [56], С. thermocellum [56], Н. insolens [56], С. fimi [71, 75], P. fluorescens [71], A. niger [76] доказали наличие у целлюлаз реальных функциональных и структурных доменов. Наиболее хорошо изучены структурные особенности ферментов целлюлазного комплекса, секретируемого грибом Т. reesei [76]. Неполный протеолиз папаином основных компонентов Т. reesei - ЦБГ I и II, ЭГ I и II - приводит к разделению двух функциональных доменов: каталитического и адсорбционного. Эти ферменты Т. reesei имеют общую структуру: небольшой целлюлозосвязывающий домен (ЦСД или, в общем случае, субстратсвязывающий домен — ССД), отвечающий за адсорбцию на нерастворимой целлюлозе, соединен гликозилированным участком фермента, так называемым «линкером», с каталитическим доменом (КД), имеющим в своем составе активный центр ферментов (рис. 3) [72]. После удаления ЦСД, КД сохраняет свою активность по отношению к растворимым субстратам, но в значительной степени утрачивает способность адсорбироваться на нерастворимых субстратах и гидролизовать их. ЦСД (после удаления КД) не обладает каталитической активностью, но сохраняет сорбционную способность на нерастворимых субстратах [74]. Важно отметить, что делеция части линкера ведет к снижению каталитической активности по отношению к нерастворимым субстратам, а также уменьшает устойчивость фермента к действию протеаз.
Определение концентрации белка
Содержание белка в пробах определяли методом Лоури. Для ферментов с известным коэффициентом экстинции концентрацию белка определяли спектрофотометрически по поглощению на длине волны 280 нм. При спектрофотометрических измерениях использовали спектрофотометр Shimadzu UV-150 02. 5.4. Хроматографическое разделение ферментов: В работе использовали ферментные препараты в виде высушенных концентратов культуральной жидкости. Навеску препарата растворяли в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,0, в течение 15 минут при перемешивании на магнитной мешалке. Навеску ферментного препарата брали из расчета 40 мг белка на 1 мл буфера. Полученные растворы центрифугировали (4С, 5000 об/мин, 10 мин) и удаляли нерастворимый осадок. Супернатант обессоливавали методом ГПХ на колонках с биогелем Р4, уравновешенных 0,025 М Bisris-HCl буфером (рН 6,6). Элюцию белка вели при скорости 1 мл/мин на жидкостном хроматографе низкого давления Есопо System фирмы «Bio-Rad» (США). В полученном растворе ферментного препарата определяли концентрацию белка методом Лоури. Для фракционирования и выделения основных компонентов комплекса использовали жидкостной хроматограф среднего давления FPLC фирмы «Pharmacia» (Швеция). Обе системы — Есопо System и FPLC - состояли из автоматического контроллера процесса, насоса, ультрафиолетового проточного детектора и коллектора фракций. В процессе выделения концентрацию белка определяли спектрофотометрически при 280 нм. Для фракционирования ферментных препаратов использовали анионообменную и катионообменную хроматографию. Анионообменную хроматографию проводили на колонке Mono Q HR 5/5 (5 х 50 мм, объем геля 1 мл) «Pharmacia» (Швеция). Препаративное разделение проводили на колонках HR 16/5 (16 х 50 мм) «Pharmacia» (Швеция) Omnifit (36 х 50 мм) (США) на носителе Source 15 Q. Ферментный препарат в стартовом буфере наносили из расчета 10 мг белка по Лоури на 1 мл геля. Для проведения катионообменной хроматографии использовали колонку Mono S HR 5/5 (5 х 50 мм, объем геля 1 мл) Скорость потока 1 мл/мин. Обессоливание промежуточных объединенных фракций (методом ГПХ низкого давления) проводили на колонке (1 х 30 см) с биогелем Р4, уравновешенной буферным раствором с требуемым значением рН. Для тонкой очистки белков применяли: Хроматофокусирование (ионообменную хроматографию при низкой ионной силе с элюированием в градиенте рН) проводили на колонке Mono Р HR 5/20 (5 х 200 мм, объем геля - 4 мл).
Для создания градиента рН колонку уравновешивали 0,025 М стартовым буфером с требуемым верхним значением рН (буферную систему выбирали согласно руководству к колонке), после чего проводили префокусирование с помощью 3 мл полибуфера РВ 96 или РВ 76, предварительно подкисленного 1 М НС1 до требуемого нижнего значения рН. После префокусирования на колонку наносили 3-5 мл раствора белка в стартовом буфере с концентрацией 1,0 мг/мл. Связавшиеся с носителем в стартовых условиях белки далее элюировали полибуфером (0,5-0,6 мл/мин). Анионообменную хроматографию на колонке MonoQ HR 5/5, уравновешенной 0,025 М имидазольным буфером при необходимом значении рН. ГПХ на колонке Superose 12 HR 10/30 (10 х 300 мм) фирмы «Pharmacia» (Швеция): элюент - 0,1 М ацетатный буфер, рН 5,0, скорость 0,3 мл/мин; Гомогенные ферменты хранили при +4С в виде растворов в 0,1 М ацетатном буфере, рН 4,5-5,0. 5.5. Определение биохимических характеристик индивидуальных ферментов, титрование белков ферментного комплекса: Аналитическое изоэлектрофокусирование белков проводили на приборе Model 111 Cell (фирма "Bio-Rad", США), руководствуясь методикой к прибору. Электрофорез проводили в 12% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия на приборе Mini Protean (фирма "Bio-Rad", США), согласно руководству к прибору. Определение кривых титрования белков ферментного комплекса С. lucknowense проводили на приборе FBE3000 («Pharmacia», Швеция), руководствуясь методикой к прибору. Активности препаратов по отношению к полисахаридным субстратам определяли по начальным скоростям образования восстанавливающих Сахаров (ВС) методом Шомоди-Нельсона [185]. Авицелазную активность определяли по начальной скорости образования ВС (методом Шомоди-Нельсона) при гидролизе МКЦ по методике [186]. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль ВС в минуту в рН-оптимуме действия фермента при концентрации субстрата 5 г/л и оптимальной температуре. Эндоглюканазную активность определяли также вискозиметрическим методом [187] по скорости уменьшения вязкости 0,5%-ной КМЦ (40, рН 5,0). 5.6.2. Определение активности по полисахаридным субстратам с помощью планшетного метода: Так как анализ активности большого количества фракций, полученных после разделения ферментного препарата, по отношению к широкому кругу субстратов методом Шомоди-Нельсона занимает много времени, в нашей лаборатории был разработан метод определения активности в планшетах. Количество ВС, образующихся в ходе ферментативного гидролиза полимерных субстратов, определяли бицинхонинатным методом [188]. Суть метода заключается в количественном взаимодействии ВС с солью двухвалентной меди, которая восстанавливается до Си+. Катионы Си+ образуют интенсивно окрашенные комплексы с бицинхонинатом натрия. Интенсивность окраски пропорциональна количеству ВС. Анализ проводили с использованием 96-луночных планшетов для иммуноферментного анализа.
Для удобства использовались многоканальные пипетки. В лунку планшета вносили 30 мкл воды, 40 мкл запасного раствора субстрата (10 г/л в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,0) и инкубировали на термостатируемом шейкере при 50С в течение 10 мин и скорости вращения 300 об/мин. Затем добавляли 10 мкл фермента и быстро перемешивали реакционную смесь. Через 15 мин инкубации при 50С отбирали 10 мкл реакционной смеси во второй планшет, куда предварительно было внесено 190 мкл бицинхонинатного реагента. Термостатировали второй планшет при температуре 80 С в течение 60 мин. Интенсивность образующейся окраски регистрировали с помощью микроплашечного ридера на длине волны 533 нм. Плашечный метод использовали также и для определения активности во фракциях по отношению к МКЦ. При этом реакционную смесь пропорционально увеличивали в два раза, реакцию проводили при 40С с использованием стальных мешалок и скорости вращения 800 об./ мин. Активность проб к полимерным субстратам, определенную бицинхонинатным методом, рассчитывали по формуле: A = D533 к 103 R R / (t 180), где А — активность фермента, ед/мл, D533 - оптическая плотность реакционной смеси при 630 нм, к — калибровочный коэффициент, 103 — коэффициент, учитывающий переход единиц измерения (от моль/л к мкмоль/мл), R — предварительное разбавление фермента, R — разбавление фермента в реакционной смеси (в условиях метода равно 8), t — время ферментативной реакции (в условиях метода равно 15 мин), 180 - молекулярная масса глюкозы, г/моль. 5.6.3. Определение активности по отношению к я-нитрофениль-ным производным Сахаров: Активность по отношению к и-нитрофенильным производным Сахаров определяли при рН 5,0 and 40. Аликвоту (0,05 мл) запасного раствора субстрата (10 мМ) смешивали с 0,85 мл 0,1 М Na-ацетатного буфера, смесь предварительно прогревали при 40 в течение 5 мин, и далее начинали ферментативную реакцию путем внесения 0,1 мл предварительно разбавленного и подогретого таким же образом раствора фермента. Ровно через 10 мин инкубации раствора при 40 реакцию останавливали путем добавления 0,5 мл 1 М раствора соды. Далее на спектрофотометре измеряли поглощение раствора на длине волны 400 нм относительно кюветы сравнения, в которой находился контрольный раствор субстрата, приготовленный точно таким же образом, но в который вносили 0,1 мл ацетатного буфера вместо раствора фермента. Рассчитывали количество выделившегося /і-нитрофенола с использованием его коэффициента экстинкции, и далее рассчитывали ферментативную активность.
Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов ЭГ 44 к Да и ЭГ 51 кДа
В ходе изучения биохимических свойств выделенных эндоглюканаз было сделано предположение о том, что ЭГ 44 кДа является каталитическим доменом полноразмерной ЭГ 51 кДа без ЦСД. Ферменты проявляли очень похожие свойства при гидролизе растворимых субстратов (удельные активности и кинетические параметры, состав низкомолекулярных продуктов, рН-профили активности) и отличались только степенью адсорбции и активностью при гидролизе МКЦ. Подробнее эти данные обсуждаются ниже. Для подтверждения данной гипотезы была проведена обработка белковых полос гелей после ДДС-электрофореза, соответствующих конкретным ферментам, трипсином с последующей экстракцией смеси пептидов из геля и их анализом методом масс-спектрометрии [191] (эти эксперименты проводились в отделе протеомных исследований НИИ Биомедицинской химии РАМН). Анализ полученных масс-спектров с помощью программы MASCOT (http://www.matrixscience.com) в базе данных NCBI (США) не выявил какой-либо идентичности полученых пептидов фрагментам трипсиновой деструкции известных ферментов из других источников. Однако полученные данные позволили однозначно установить, что ЭГ 44 кДа и ЭГ 51 кДа представляют собой две формы одного фермента, так как масс-спектры трипсиновых гидролизатов данных ферментов оказались практически идентичными. На рис. 22 представлены масс-спектры трипсиновых гидролизатов ЭГ 44 кДа и ЭГ 51 кДа. Как видно из рисунка, молекулярные массы мажорных пептидов из обоих ферментов полностью совпадают (пептиды с m/z: 980,5, 1029,6, 1304,7, 1415,7, 1533,8, 1839,0, 2355,0,2367,0,2560,0 и 3284,1) Очень похожая ситуация наблюдалась в случае ЦБГ I С. lucknowense, которая также представлена двумя формами: 52 кДа и 65 кДа. Ранее в нашей лаборатории [190] было показано, что низкомолекулярная форма ЦБГ I образуется в результате протеолитического отщепления ЦСД и гликозилированного линкера от полноразмерной (65 кДа) ЦБГ I при посттрансляционной модификации. 8.3. Основные биохимические свойства эндоглюканаз. С. lucknowense был обнаружен в ходе поиска продуцентов нейтральных целлюлаз. Как видно из рис. 23, ферментные препараты на основе мутантных штаммов С. lucknowense проявляют существенно более высокую активность в нейтральной и слабощелочной среде по сравнению, например, с препаратом BioAce, полученным на основе классического продуцента целлюлаз Т. reesei.
Высокая активность при нейтральных и щелочных значениях рН не является свойством, типичным для грибных целлюлаз, однако оно имеет важное значение в случае применения ферментов в некоторых биотехнологических процессах, в частности, при ферментативной обработке хлопчатобумажных тканей, а также при использовании целлюлаз в качестве добавок к моющим средствам [6,14]. Таким образом, важно было понять, какие ферменты ответственны за относительно высокую для грибных целлюлаз активность ферментных препаратов С. lucknowense в нейтральной и щелочной среде. Зависимости активности очищенных эндоглюканаз и целлобиогидролаз от рН представлены на рис. 24. Все выделенные эндоглюканазы проявляли максимальную активность в кислой среде (рН 4,5 - 6,0). В нейтральной среде все выделенные эндоглюканазы проявляли заметную активность ( 50%). Важно отметить, что два фермента (ЭГ V и ЭГ 47 кДа) сохраняли высокую активность в слабощелочной среде, 66 % и 67 % при рН 8,0 соответственно. Следует обратить внимание на рН-зависимости активности ЭГ 51 кДа и ЭГ 44 кДа. Для этих ферментов получены похожие рН-профили. При этом рН-профиль ЭГ 51 кДа напоминает зависимость, полученную для исходного ферментного препарата FibreZyme L #838 (штамм UV18-25), полученного на основе штамма UV 18-25. Это предположение объясняет тот факт, что увеличение экспрессии ЭГ III и ЭГ V в препаратах, полученных на основе штаммов с мультикопированными генами ферментов, не привело к существенному изменению рН-зависимости КМЦазной активности препаратов по сравнению с исходным UV 18-25 (рис. 23). Как видно из рисунка, кривая, полученная для препарата BTREg5 14-7-9 #837 (штамм UV18-25::Eg5#27), в котором содержание ЭГ V увеличено в три раза, сдвинулась не более чем на пол-единицы рН. Таким образом, наиболее щелочными зависимостями обладают ЭГ V и ЭГ 47 кДа, при этом, по-видимому, основной вклад в формирование рН-зависимость активности всего препарата вносит ЭГ 51 кДа. Температурные оптимумы активности по КМЦ для всех исследованных в работе эндоглюканаз лежали в пределах 60-70С. Полученные температурные зависимости представлены на рис. 25. Для ЭГ V, ЭГ 51 кДа и ЭГ 44 кДа получены относительно узкие зависимости активности от температуры. Оптимумы активности лежат существенно выше 50С. Таким образом, стандартная КМЦазная активность, измеренная при этой температуре (таблица 5), составляет для этих ферментов соответственно всего 55%, 35% и 31% от максимальной активности. ЭГ III, ЭГ 47 кДа и ЭГ 60 кДа, напротив, проявляют высокую активность в существенно более широком диапазоне температур. При температуре 50С все три фермента проявляют свьппе 80% активности.
Особое внимание следует обратить на температурную зависимость активности ЭГ III. Фермент сохраняет свыше 50% активности при температуре 30С, в то время как все остальные целлюлазы комплекса проявляют не более 25% активности в таких условиях. Высокая активность при невысоких температурах имеет большое значение в биотехнологии целлюлаз. Исследование термостабильности ферментов показало, что все выделенные ферменты обладают высокой стабильностью при 50С и значениях рН 5,0 и 7,0 (таблица 6). При указанных условиях ферменты сохраняли более 90% активности в течение 5 часов, за исключением ЭГ III и ЭГ 47 кДа. ЭГ III была стабильна при рН 5,0, однако при рН 7,0 фермент терял 25% активности через 5 часов инкубации. Наименее термостабильным ферментом оказалась ЭГ 47 кДа. В течение 5 часов инкубации при рН 5,0 и рН 7,0 фермент терял 40% и 20 % активности соответственно. Следует обратить внимание на то, что данный фермент был более стабилен при рН 7,0, в то время как большинство грибных целлюлаз, в том числе и все остальные целлюлазы комплекса С. lucknowense, обладали более высокой термостабильностью в слабокислой области, чем при нейтральном значении рН. Кинетические параметры (Кт и VmaX) действия эндоглюканаз были определены из зависимостей начальных скоростей реакций (при 50С и оптимальных значениях рН) от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка. С учетом концентрации белка в реакционной смеси и молекулярных масс ферментов из значений Vmax были рассчитаны каталитические константы (kcat). Найденные значения кинетических параметров приведены в таблице 4. Из-за невозможности определить молекулярную массу субстрата Km выражали в г/л. ЭГ 44 кДа и ЭГ 51 кДа характеризовались наименьшими значениями Кт и наиболее высокими k t (по обоим субстратам) по сравнению с остальными ферментами. Важно отметить, что для обеих эндоглюканаз были получены близкие значения k t, при этом Кт для ЭГ 51 кДа была несколько больше. Для ЭГ III кДа Кт по /3-глюкану была меньше Кт по КМЦ на два десятичных порядка, при этом kcat по /3-глюкану была более чем в три раза выше. Полученные кинетические параметры объясняют причину крайне высокой /3-глюканазной активности ЭГ III. Для ЭГ 47 кДа и ЭГ 60 кДа получены высокие значения Кт по КМЦ, при этом Кт по /3-глюкану были на порядок меньше. КМЦ является синтетическим субстратом, в среднем на каждые 10 остатков глюкозы приходится одна карбоксиметильная группа, которая, по-видимому, препятствует эффективному связыванию субстрата в активном центре данных эндоглюканаз. 8.5. Состав низкомолекулярных продуктов при глубоком гидролизе В-глюкана. С помощью ВЭЖХ на колонке с привитой аминофазой был определен состав низкомолекулярных продуктов при исчерпывающем гидролизе В-глюкана очищенными эндоглюканазами. Полученные хроматограммы представлены на рис. 26. Как видно из сравнения со стандартом (глюкоза, целлобиоза и мальтоолигосахариды), в качестве низкомолекулярных продуктов гидролиза образовывались олигосахариды со степенью полимеризации от 2 до 4, а также глюкоза.
Изучение влияния целлюлаз С. lucknowense наресорбцию индиго
Эксперименты по изучению ресорбции индиго на поверхности ткани проводили по методу [9] с использованием модельных образцов белой хлопчатобумажной ткани. Для каждого фермента определяли индекс ресорбции индиго (ИРИ), соответствующий интенсивности окраски ткани красителем в присутствии данного фермента (концентрация белка 0,05 мг/мл, 50С, рН 5,0, 30 мин). В качестве контроля использовали ферментный препарат АСЕ 210.27 (Т. reesei). Данный ферментный препарат на протяжении нескольких лет используется в нашей лаборатории в качестве внутреннего стандарта в экспериментах по изучению эффекта ресорбции индиго. Полученные данные представлены на рис. 30. Чем ниже ИРИ фермента (ферментного препарата), тем более высокое потребительское качество ткани может быть получено при обработке данным ферментом. Для ЭГ V, хорошо проявившей себя в экспериментах по депигментации джинсовой ткани, был получен удовлетворительный ИРИ. То же можно сказать о ЭГ 60 кДа, ЦБГ I 52 кДа, ЭГ Ш и ЭГ 44 кДа. Наибольшими ИРИ обладали ЭГ 51 кДа, ЭГ 47 кДа и ЦБГ I 65 кДа. Необходимо отметить, что все три фермента являются мажорными белками комплекса и таким образом должны оказывать влияние на ИРИ исходного комплекса. Методы генной инженерии позволяют создавать ферментные препараты с высокой тополитической активностью. Основной подход, используемый при создании подобных препаратов - клонирование индивидуальных тополитических ферментов в штаммы-суперпродуценты белка. Наиболее характерными примерами являются монокомпонентные ферментные препараты фирмы "Genencor" (США) на основе ЭГ III из Т. reesei [181] и фирмы Novozyme (Дания) на основе ЭГ V из Н. insolens [182]. В ходе изучения эффективности целлюлаз С. lucknowense в процессе депигментации джинсовой ткани было показано, что наибольшей тополитической активностью обладает ЭГ 25 кДа. Для создания на основе С. lucknowense высокоэффективного ферментного препарата для применения в текстильной промышленности было решено создать штамм с увеличенной экспрессией ЭГ 25 кДа. Для этого необходимо было выяснить нуклеотидную последовательность гена, кодирующего данный белок, и мультикопировать ген ЭГ 25 кДа под эффективным промотором. В качестве промотора был выбран ранее определенный промотор ЦБГI. Образец ЭГ 25 кДа был подвергнут гидролизу под действием трипсина, с последующим разделением и секвенированием полученных пептидов (данные эксперименты проводились в Институте Биоорганической Химии РАН). В результате были определены аминокислотные последовательности двух пептидов.
Пептиді: CAWPGK Пептид П: FDWFQNADNPSVTFQEVACPSELTSK Поиск в базе данных Swiss-Prot с помощью программы BLAST2 выявил гомологию полученных пептидов (65-78%) с аминокислотными последовательностями эндоглюканаз из 45 семьи гликозил-гидролаз (см. ниже). Гомология с эндоглюканазами других семей не наблюдалась. Таким образом был сделан вывод, что ЭГ 25 кДа С. lucknowense относится к 45 семье гликозил-гидролаз и может быть классифицирована как Се145А. Эндоглюканазы 45 семьи в научной литературе часто называют ЭГ V, аналогично соответсвующим ферментам Н. insolens и Т. reesei [1]. По полученным пептидам I и II были синтезированы праймеры для использования в реакции амплификации участка ДНК фрагмента гена, кодирующего эндоглюканазу 25 кДа (данные эксперименты проводились в компании TNO Nutrition and Food Research, Нидерланды). В результате дальнейшей работы была получена полная нуклеотидная последовательность ДНК гена, кодирующего ЭГ V С. lucknowense. На основании полученной генетической информации была рассчитана аминокислотная последовательность белка (рис. 31). Полученная аминокислотная последовательность была проанализирована с помощью программы SignalP, входящей в состав пакета программ ExPAZy Proteomics tools Швейцарского Института Биоинформатики. На основании имеющейся в базе данных статистической информации программа определила наиболее вероятный сайт посттрансляционного протеолитического отщепления сигнального пептида: al a-QL. Таким образом ЭГ V состоит из 207 а.о. С помощью программы BLAST2 мы провели сравнение полученной аминокислотной последовательности с аминокислотными последовательностями, имеющимися в базе данных Swiss-Prot. Была выявлена гомология с большим количеством эндоглюканаз из 45 семьи гликозил-гидролаз. Некоторые результаты поиска представлены в таблице 7.
Степень гомологии достигала 82%. В числе гомологов были последовательности эндоглюканаз 45 семьи из М. albomyces и Н. insolens, для которых известны третичные структуры, определенные рентгеноструктурным анализом. Гомология с указанными ферментами составила 63% и 62% соответственно. Именно основываясь на гомологии аминокислотной последовательности, эндоглюканаза 25 кДа была окончательно классифицирована как Се145А (ЭГ V). Некоторые результаты данного анализа представлены на рис. 32. Полученная генетическая информации позволила (фирма TNO, Нидерланды) мультикопировать ген ЭГ V под промотором ЦБП (cbhl), в результате чего был получен штамм UV 18-25::Eg5#27. В ходе работы с геномом С. lucknowense (TNO, Нидерланды) был обнаружен ген гликозид-гидролазы 12 семьи (ЭГ III). Как уже отмечалось выше, ЭГ Ш из Т. reesei была использована фирмой "Genencor" (США) для получения высокоэффективного тополитического целлюлазного препарата. Учитьшая этот факт, ЭГ Ш изучаемого комплекса представляла особый интерес. К моменту обнаружения гена ЭГ Ш в геноме С. lucknowense у нас не было данных, позволяющих отнести какую-либо из известных эндоглюканаз комплекса к гликозид-гидролазам 12 семьи. Также нельзя было утверждать, что данный белок вообще секретируется микроорганизмом в заметных количествах. Ген ЭГ III был мультикопирован под контролем промотора ЦБГІ (cbhl), в результате чего был получен штамм UV18-25::Eg3#la, на основе которого был получен ферментный препарат СМ1-152 #836.6. В ходе работы с ферментным препаратом СМ1-152 #836.6, было показано, что ЭГ Ш соответствует выделенной нами ранее ЭГ 28 кДа (см. раздел 6.2). Основываясь на полученной генетической информации, была рассчитана аминокислотная последовательность белка (рис. 33). Для определения последовательности сигнального пептида, как и в случае последовательности ЭГ V, мы воспользовались программой SignalP. Поиск гомологичных аминокислотных последовательностей в базе данных Swiss-Prot выявил множество гомологичных эндоглюканаз из гликозид-гидролаз 12 семьи из различных источников. Некоторые результаты поиска представлены в таблице 8. Степень гомологии найденных ферментов с эндоглюканазой 28 кДа С. lucknowense составляла 56%-59% (рис. 34). Гомологии с эндоглюканазами других семей не было обнаружено. В числе гомологов была первичная структура ЭГ Ш из Т. reesei, для которой в работе [201] рентгеноструктурным анализом была определена третичная структура. Гомология аминокислотной последовательности ЭГ Ш из Т. reesei с ЭГ 28 кДа С. lucknowense составила 56%.
