Содержание к диссертации
Введение
I. Литературный обзор 8
ГЛАВА 1. Целлюлоза и р-глюканы 8
ГЛАВА 2. Компонентный состав и свойства целлюлазных комплексов 10
2.1. Классификация, субстратная специфичность и биохимические свойства целлюлаз 10
2.2. Механизм действия целлюлаз 14
2.3. Доменная структура целлюлаз 19
2.4. Современные представления о классификации гликозил-гидролаз 21
ГЛАВА 3. Грибные и бактериальные продуценты «нейтральных» целлюлаз 22
ГЛАВА 4. Применение целлюлаз в текстильной промышленности 24
И. Экспериментальная часть 27
ГЛАВА 5. Материалы и методы 27
5.1. Ферментные препараты 27
5.2. Субстраты и реактивы 27
5.3. Определение концентрации белка 30
5.4. Хроматографическое разделение ферментов 30
5.5. Определение биохимических характеристик индивидуальных ферментов, титрование белков ферментного комплекса 31
5.6. Методы определения активности ферментов 32
5.6.1. Определение активности по отношению к полисахаридным субстратам 32
5.6.2. Определение активности по полисахаридным субстратам с помощью планшетного метода 32
5.6.3. Определение активности по n-нитрофенильным производным Сахаров 33
5.6.4. Определение активности по л-нитрофенильным производным Сахаров на планшете 34
5.7. Изучение зависимостей активности ферментов от рН и температуры 34
5.8. Изучение термостабильности ферментов 35
5.9. Определение состава низкомолекулярных продуктов гидролиза полимерных
субстратов 35
5.10. Адсорбционная способность ферментов 35
5.11. Изучение кинетики гидролиза хлопка и МКЦ 36
5.12. Определение тополитической активности целлюлаз 36
5.13. Оценка влияния целлюлаз на ресорбцию индиго 37
5.14. Масс-спектрометрический анализ пептидов 37
5.15. Методы компьютерного моделирования структуры белка 38
III. Результаты и их обсуждение 39
ГЛАВА 6. Хроматографическое разделение ферментного комплекса с. lucknowense 39
6.1. Определение компонентного состава ферментного комплекса С. lucknowense...39
6.2. Анализ увеличения экспрессии мультикопированных ферментов 48
ГЛАВА 7. Выделение и очистка индивидуальных компонентов целлюлазного комплекса с. lucknowense 57
ГЛАВА 8. Свойства эндоглкжаназ с. lucknowense 69
8.1. Субстратная специфичность и классификация целлюлаз 69
8.2. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов ЭГ 44 кДа и ЭГ 51 кДа 73
8.3. Основные биохимические свойства эндоглюканаз 75
8.4. Кинетические параметры действия выделенных эндоглюканаз 81
8.5. Состав низкомолекулярных продуктов при глубоком гидролизе р-глюкана 82
8.6. Адсорбционная способность целлюлаз. Действие ферментов на МКЦ 83
8.7. Тополитические свойства ферментов 85
8.8. Изучение влияния целлюлаз С. lucknowense наресорбцию индиго 90
ГЛАВА 9. Молекулярное строение ЭГ III и ЭГ V С. lucknowense 92
9.1. Аминокислотные последовательности ЭГ III и ЭГ V С. lucknowense 92
9.2. Моделирование вторичной и третичной структур ЭГ III и ЭГ V С lucknowense. 100
Выводы 110
Список литературы 112
- Механизм действия целлюлаз
- Хроматографическое разделение ферментов
- Анализ увеличения экспрессии мультикопированных ферментов
- Основные биохимические свойства эндоглюканаз
Введение к работе
Целлюлолитические ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы,
самого распространенного биополимера на Земле, занимают центральное место в
круговороте органического углерода [I]. Основными микроорганизмами,
продуцирующими целлюлазы, являются грибы - возбудители мягкой и бурой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий. История исследования целлюлаз насчитывает уже более 50 лет. В течение этого периода важнейшим свойством, характеризующим целлюлазный комплекс, считалась его способность к глубокой деструкции целлюлозосодержащих субстратов (так называемая «сахаролитическая» активность). Поэтому исследования, в основном, были направлены на поиск ферментных препаратов и их продуцентов, эффективно осуществляющих гидролиз целлюлозы до глюкозы. Целлюлазы, выделенные из этих препаратов, как правило, проявляли максимальную активность в кислой среде (рН 4-5) [2], но различались по субстратной специфичности, адсорбционной способности и термостабильности [3,4, 5].
Целлюлазы находят все более широкое применение в текстильной, целлюлозно-бумажной, пищевой и других отраслях промышленности [6]. В последнее время усилия исследователей направлены на поиск целлюлолитических ферментов, способных мягко воздействовать на поверхность целлюлозного субстрата, не приводя к глубокой деструкции целлюлозной матрицы (для обозначения этой способности целлюлаз мы предлагаем использовать термин «тополитическая» активность) [7, 8]. Обнаружение ферментов с тополитической активностью открыло новые возможности их применения: например, для депигментации джинсовых изделий с целью придания им более привлекательных потребительских свойств (альтернатива традиционным химическим способам «варки», а также обработке пемзой); для биополировки текстильных материалов с целью удаления микродефектов и ворса; как компонента моющих средств и т. д. [9, 10, 11, 12]. Важно отметить, что замена известных химических способов обработки целлюлозных материалов на ферментативные приводит к проведению процесса в более мягких условиях и уменьшает ущерб, наносимый окружающей среде.
Следует подчеркнуть, что для упомянутых выше целей предпочтительны ферменты, сохраняющие высокую активность и стабильность в условиях проведения процесса - как правило, это нейтральные или щелочные значения рН и повышенная температура [И, 13]. В связи с этим наиболее перспективными для использования являются так называемые «нейтральные» целлюлазы, демонстрирующие высокую
активность и стабильность при значениях рН, близких к нейтральным, (рН 6-8) и температурах 50С и выше. Поэтому актуальными направлениями исследований в этой области становятся поиск новых штаммов-продуцентов «нейтральных» целлюлаз, получение мутантных штаммов при помощи методов классического мутагенеза или генной инженерии, а также вьщеление и исследование свойств ключевых тополитических ферментов.
В Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН был осуществлен скрининг продуцентов целлюлаз, высокоактивных и стабильных при нейтральных и щелочных значениях рН, в результате чего был найден мицелиальный гриб Chrysosporium lucknowense, целлюлазный комплекс которого ранее не исследовался. Гриб С. lucknowense, относящийся к классу аскомицетов, был выделен из щелочной почвы Дальнего Востока, и далее путем классического мутагенеза были получены мутантные штаммы, отличающиеся повышенным уровнем секреции целлюлаз и гемицеллюлаз. Ферментные препараты на основе данного продуцента продемонстрировали высокую эффективность при обработке хлопчатобумажной ткани [14]. Однако данные, касающиеся состава и особенностей функционирования ферментного комплекса С. lucknowense, а также сведения по ферментам, продуцируемым другими видами грибов рода Chrysosporium, практически отсутствуют в научной литературе.
Основной целью данной работы было выделение и изучение свойств ферментов
целлюлазного комплекса, продуцируемого мутантным штаммом гриба С. lucknowense. В
цели работы также входило выявление ключевых целлюлаз, отвечающих за высокую
эффективность ферментных препаратов С. lucknowense при обработке
хлопчатобумажной ткани с целью создания ферментных препаратов с улучшенными биотехнологическими характеристиками.
Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:
Определить компонентный состав ферментного комплекса С. lucknowense
Выделить в гомогенном виде все целлюлазные ферменты комплекса и изучить их свойства.
Выявить ключевые тополитические целлюлазы С. lucknowense.
Получить и проанализировать свойства ферментных препаратов на основе штаммов С. lucknowense с мультикопированными генами собственных целлюлаз, обладающих наибольшей тополитической активностью.
Механизм действия целлюлаз
Молекулярная масса целлобиаз варьирует в широких пределах. Например, в гомогенном состоянии получены целлобиазы с молекулярной массой около 50 кД и молекулярной массой 100-300 кД. Большинство целлобиаз из микроорганизмов представляют собой кислые белки с pi 3.1-5.9, однако, целлобиазы из Monilia sp., Т. viride и Т. reesei имеют значение pi до 8.3. Большинство целлобиаз гликозилировано. Содержание углеводов варьирует от 10 до 65% [23,43].
В качестве субстратов /3-глюкозидазы обычно используют целлобиозу или пНФГ. Константы Михаэлиса для целлобиаз из различных источников варьируют в пределах 0.75-30 мМ (субстрат - целлобиоза) или в пределах 0.095-44 мМ (субстрат -пНФГ) [15]. Многие р-глюкозидазы способны гидролизовать наряду с целлобиозой также и олигосахариды с более высокой СП, причем обычно их каталитическая активность уменьшается с увеличением СП олигосахарида. Некоторые Д-глюкозидазы могут катализировать расщепление как /3-1,4, так и других типов гликозидных связей. Так, целлобиаза из Л. phoenicis способна гидролизовать, помимо целлобиозы, также и Д/З-трегалозу (/ї-1,1-связь), гентиобиозу (j3-1,6-связь), ламинарибиозу ((3-1,3-связь), софорозу (#-1,2-связь). Продукт реакции (глюкоза) ингибирует целлобиазу (Kj=0.5-16.4 мМ). Отмечается также ингибирование субстратом - целлобиозой (К;=27-41 мМ) [23, 43]. Тип ингибирования различается для целлобиаз из различных источников: в литературе сообщается о конкурентном, неконкурентном и смешанном типах ингибирования глюкозой [51, 52].
Как уже отмечалось выше, jS-глюкозидазы способны осуществлять реакцию трансгликозилирования, т.е., перенос глюкозного остатка на молекулу акцептора, Акцепторами могут быть как сахара, так и другие соединения (спирты, фенолы). Следует отметить, что трансгликозилирование обычно проявляется в заметной степени при достаточно высоких (10-2-10-1 М) концентрациях акцептора [23,43].
Собственно гидролитической стадии предшествует стадия адсорбции ферментов на поверхности нерастворимого субстрата. Скорость адсорбции ферментов достаточно велика по сравнению со скоростью гидролиза, и перенос ферментов к поверхности субстрата не является лимитирующей стадией процесса расщепления нерастворимого субстрата [53, 54].
Эффективность гидролиза полисахаридного субстрата зависит от сбалансированности состава ферментного комплекса и уровня активности компонентов, то есть от качественного и количественного состава комплекса [15]. Характерной особенностью компонентов целлюлазного комплекса является наличие синергизма в действии их компонентов. Синергизмом называют увеличение эффективности действия двух или несколько компонентов системы при их совместном присутствии по сравнению с суммарным (аддитивным) проявлением действия этих компонентов по отдельности [15, 43]. Природа синергизма обусловлена реализацией кинетических закономерностей последовательно (или последовательно-параллельно) действующей полиферментной системы, когда продукт действия одного из ферментов является субстратом для другого (без каких-либо дополнительных взаимодействий между ферментами).
Взаимодействие ЭГ и ЦБГ служит примером реализации «последовательного» механизма: первый из ферментов осуществляет деполимеризацию целлюлозы и таким образом увеличивает концентрацию концевых групп, являющихся субстратом для второго фермента [15].
Существуют два основных механизма, посредством которых карбогидразы расщепляют гликозидную связь (рис 2). Эти механизмы дискриминируются стереохимическими характеристиками продуктов реакции: в одном случае при гидролизе происходит обращение конфигурации аномерного углерода, в другом случае конфигурация аномерного углерода сохраняется.
«Обращающие» ферменты действуют по механизму одностадийного замещения, при котором молекула воды атакует непосредственно аномерный центр, замещая таким образом уходящую группу. Такой механизм протекает посредством общего кислотно-основного катализа в активном центре фермента через оксикарбокатнонное переходное состояние (две карбоксильные группы, осуществляющие катализ расположены на расстоянии 9-10 А [55]).
«Сохраняющие» ферменты действуют по механизму двухстадийного замещения (рис. 2) через образование гликозил-фермента в качестве ковалентного интермедиата [56, 57, 58]. Первая стадия включает атаку аномерного центра ферментным нуклеофилом (глутаминовый или аспарагиновый аминокислотный остаток [59, 60, 61, 62, 56]). Замещение уходящей группы катализируется по общему кислотному механизму протонированным аминокислотным остатком, находящимся на противоположной стороне активного центра (карбоксильные группы, выполняющие функции нуклеофила кислотно-основного катализатора расположены на расстоянии 5.5 А [63]). Эта стадия сопровождается образованием промежуточного ковалентного ацильного интермедиата гликозил-фермента. Наличие уходящей группы указывает на то, что образование интермедиата протекает относительно быстро, поэтому гликозил-фермент накапливается. На второй стадии вода атакует аномерный центр гликозил-фермента. Атака воды катализируется депротонированным аминокислотным остатком по общему основному механизму. В результате образуется продукт, а фермент возвращается в исходное состояние. Обе стадии протекают через промежуточные состояния оксикарбокатионного характера [56, 57, 58].
Хроматографическое разделение ферментов
В работе использовали ферментные препараты в виде высушенных концентратов культуральной жидкости. Навеску препарата растворяли в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,0, в течение 15 минут при перемешивании на магнитной мешалке. Навеску ферментного препарата брали из расчета 40 мг белка на 1 мл буфера. Полученные растворы центрифугировали (4С, 5000 об/мин, 10 мин) и удаляли нерастворимый осадок. Супернатант обессоливавали методом ГПХ на колонках с биогелем Р4, уравновешенных 0,025 М Bisris-HCl буфером (рН 6,6). Элюцию белка вели при скорости 1 мл/мин на жидкостном хроматографе низкого давления Есопо System фирмы «Bio-Rad» (США). В полученном растворе ферментного препарата определяли концентрацию белка методом Лоури.
Для фракционирования и выделения основных компонентов комплекса использовали жидкостной хроматограф среднего давления FPLC фирмы «Pharmacia» (Швеция). Обе системы - Есопо System и FPLC - состояли из автоматического контроллера процесса, насоса, ультрафиолетового проточного детектора и коллектора фракций. В процессе выделения концентрацию белка определяли спектрофотометрически при 280 нм.
Для фракционирования ферментных препаратов использовали анионообменную и катионообменную хроматографию. Анионообменную хроматографию проводили на колонке Mono Q HR 5/5 (5 х 50 мм, объем геля 1 мл) «Pharmacia» (Швеция). Препаративное разделение проводили на колонках HR 16/5 (16 х 50 мм) «Pharmacia» (Швеция) Omnifit (36 х 50 мм) (США) на носителе Source 15 Q. Ферментный препарат в стартовом буфере наносили из расчета 10 мг белка по Лоури на 1 мл геля. Для проведения катионообменной хроматографии использовали колонку Mono S HR 5/5 (5 х 50 мм, объем геля 1 мл) Скорость потока 1 мл/мин.
Обессоливание промежуточных объединенных фракций (методом ГПХ низкого давления) проводили на колонке (1 х 30 см) с биогелем Р4, уравновешенной буферным раствором с требуемым значением рН.
Для тонкой очистки белков применяли: Хроматофокусирование (ионообменную хроматографию при низкой ионной силе с элюированием в градиенте рН) проводили на колонке Mono Р HR 5/20 (5 х 200 мм, объем геля — 4 мл). Для создания градиента рН колонку уравновешивали 0,025 М стартовым буфером с требуемым верхним значением рН (буферную систему выбирали согласно руководству к колонке), после чего проводили префокусирование с помощью 3 мл полибуфера РВ 96 или РВ 76, предварительно подкисленного 1 М НС1 до требуемого нижнего значения рН. После префокусирования на колонку наносили 3-5 мл раствора белка в стартовом буфере с концентрацией 1,0 мг/мл. Связавшиеся с носителем в стартовых условиях белки далее элюировали полибуфером (0,5-0,6 мл/мин). Анионообменную хроматографию на колонке MonoQ HR 5/5, уравновешенной 0,025 М имидазольным буфером при необходимом значении рН. ГПХ на колонке Superose 12 HR 10/30 (10 х 300 мм) фирмы «Pharmacia» (Швеция): элюент - 0,1 М ацетатный буфер, рН 5,0, скорость 0,3 мл/мин; Гомогенные ферменты хранили при +4С в виде растворов в 0,1 М ацетатном буфере, рН 4,5-5,0.
Аналитическое изоэлектрофокусирование белков проводили на приборе Model 111 Cell (фирма "ВІо-Rad", США), руководствуясь методикой к прибору. Электрофорез проводили в 12% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия на приборе Mini Protean (фирма "Bio-Rad", США), согласно руководству к прибору. Определение кривых титрования белков ферментного комплекса С. lucknowense проводили на приборе FBE3000 («Pharmacia», Швеция), руководствуясь методикой к прибору.:
Активности препаратов по отношению к полисахаридным субстратам определяли по начальным скоростям образования восстанавливающих Сахаров (ВС) методом Шомоди-Нелъсона [185]. Авицелазную активность определяли по начальной скорости образования ВС (методом Шомоди-Нельсона) при гидролизе МЮД по методике [186]. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль ВС в минуту в рН-оптимуме действия фермента при концентрации субстрата 5 г/л и оптимальной температуре. Эндоглюканазную активность определяли также вискозиметрическим методом [187] по скорости уменьшения вязкости 0,5%-ной КМЦ (40, рН 5,0).
Так как анализ активности большого количества фракций, полученных после разделения ферментного препарата, по отношению к широкому кругу субстратов методом Шомоди-Нельсона занимает много времени, в нашей лаборатории был разработан метод определения активности в планшетах, Количество ВС, образующихся в ходе ферментативного гидролиза полимерных субстратов, определяли бицинхонинатным методом [188]. Суть метода заключается в количественном взаимодействии ВС с солью двухвалентной меди, которая восстанавливается до Си+. Катионы Си+ образуют интенсивно окрашенные комплексы с бицинхонинатом натрия. Интенсивность окраски пропорциональна количеству ВС.
Анализ проводили с использованием 96-луночных планшетов для иммуноферментного анализа. Для удобства использовались многоканальные пипетки.
В лунку планшета вносили 30 мкл воды, 40 мкл запасного раствора субстрата (10 г/л в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,0) и инкубировали на термостатируемом шейкере при 50С в течение 10 мин и скорости вращения 300 об/мин. Затем добавляли 10 мкл фермента и быстро перемешивали реакционную смесь. Через 15 мин инкубации при 50С отбирали 10 мкл реакционной смеси во второй планшет, куда предварительно было внесено 190 мкл бицинхонинатного реагента.
Анализ увеличения экспрессии мультикопированных ферментов
Данные, полученные при аналитическом разделении ферментного препарата CL1-09 #648.2.2, позволили примерно оценить долю обнаруженных целлюлаз в изучаемом ферментном комплексе. Содержание ферментов оценивали, определяя площади соответствующих хроматографических пиков после аналитического разделения препарата и содержание во фракциях выделяемых белков. Площадь пиков определяли взвешиванием вырезанных из хроматограммы пиков, содержание выделяемого белка во фракции оценивали по интенсивности полос на пластинах ДЦС-гельэлектрофореза. Следует отметить, что указанный метод является весьма приблизительным, однако он позволяет получить представление о том, какие из ферментов секретируются в качестве «мажорных» компонентов, а какие в качестве «минорных». Полученные данные представлены в таблице 4.
В ходе исследования ферментного комплекса С. lucknowense, кроме перечисленных целлюлаз, были также обнаружены ксиланазы с массами 60 кДа, 51 кДа, 30 кДа и 23 кДа, пектат-лиаза 32 кДа, а также щелочная протеаза 31 кДа. Ксиланазы и пектат-лиаза были выделены с помощью последующей гидрофобной хроматографии на колонке Phenyl Superose. Протеаза 31 кДа, pi 8,9 была выделена гидрофобной хроматографией с последующей катионообменной хроматографией на колонке Mono S. Для препаративного выделения фермента удобно ферментный препарат нанести на колонку с анионообменным носителем Source Q или Macro Prep Q, уравновешенную при рН 8,3 - 8,6. В этих условиях большая часть белков связывается с носителем, а протеаза, обладающая высоким значением pi, оказывается в несвязавшейся фракции. Таким образом, можно получить достаточные для препаративного выделения количества обогащенной выделяемым белком фракции. Детальная характеристика и исследование свойств указанных ферментов не входили в задачи данной диссертационной работы.
Анализ увеличения экспрессии мультикопированных ферментов. Как уже отмечалось выше, ферментные препараты С. lucknowense продемонстрировали высокую эффективность при обработке хлопчатобумажной ткани, В экспериментах с индивидуальными ферментами наибольший эффект при обработке ткани показала ЭГ 25 кДа (см. раздел 8.5). Для увеличения экспрессии ЭГ 25 кДа было решено определить нуклеотидную последовательность гена, кодирующего данный фермент, и мультикопировать его в геноме С. lucknowense. Данная работа была проведена фирмой TNO Nutrition and Food Research (Голландия). Анализ гомологии аминокислотной последовательности белка, вычисленной на основании генетической информации, позволил однозначно отнести фермент к 45 семье гликозил-гидролаз (Се1145А, или ЭГ V), Ген фермента был мультикопирован под ранее определенным промотором целлобиогидролазы I (pcbhl), в результате чего был получен штамм UV18-25::Eg5#27. В ходе этих исследований в геноме С. lucknowense был также обнаружен ген гликозид-гидролазы 12 семьи (Се112А, или ЭГ III). ЭГ Ш представляла особый интерес, т.к. гликозил-гидролазы 12 семьи хорошо зарекомендовали себя в текстильной промышленности. Ярким примером являются ферментные препараты фирмы «Genencor» (США) на основе ЭГ III из Т. reesei. К моменту обнаружения гена фермента у нас не было данных, позволяющих однозначно отнести какую-либо из известных эндоглюканаз С. lucknowense к гликозил-гидролазам 12 семьи. Не было уверенности, что данный белок вообще секретируется микроорганизмом. Обнаруженный ген ЭГ III был мультикопирован, в результате чего был получен штамм UV18-25::Eg3#la. Анализ гомологии аминокислотных последовательностей ЭГ III и ЭГ V С. lucknowense с известными эндоглюканазами из других источников приведен в главе 9.
На основе указанных штаммов были получены ферментные препараты с увеличенным содержанием соответствующих ферментов: препарат СМ 1-152 #836.6 (представляющий собой культуральную жидкость штамма UV I8-25::Eg3#la с мультикопированным геном ЭГ III) и препарат BTREg5 14-7-9 #837 (представляющий собой культуральную жидкость штамма UV 18-25::Eg5#27 с мультикопированным геном ЭГ 25 кДа (ЭГ V)). Указанные ферментные препараты были проанализированны по изложенной в предыдущем разделе схеме. Кроме того, для сравнения, был проанализирован препарат FibreZyme L #838, полученный на основе штамма UV 18-25 одновременно с препаратами СМ1-152 #836.6 и BTREg5 14-7-9 #837 и приготовленный (формулированный) аналогично указанным препаратам. Активности проанализированных ферментных препаратов С. luchtowense по отношению к некоторым полимерным субстратам представлены в табл. 2.
Основные биохимические свойства эндоглюканаз
Для выделения ЭГ 44 кДа гораздо удобнее оказалось наносить несвязавшуюся после первой стадии очистки белковую фракцию сразу на колонку Source 15 Q при рН 7,6 (рис. 17), исключая таким образом стадию катионообменной хроматографии. ЭГ 44 кДа элгоировалась в градиенте соли, полученную фракцию подвергали хроматофокусированию в градиенте рН 7,3-6,0, что позволило получить фермент в гомогенном виде (рис. 18). Белок выходил в виде пика неправильной формы, иногда разделяясь на несколько неразрешенных пиков. При этом все фракции пика обладали одинаковыми удельными активностями и проявлялись в виде одной полосы на ДЦС-гельэлектрофорезе. ИЭФ фракций давало несколько отличающиеся значения р! (в пределах 6,0 - 6,4) . Было сделано предположение о существовании нескольких изоформ фермента. Согласно нашей гипотезе, ЭГ 44 кДа является каталитическим доменом ЭГ 51 кДа, лишенной ЦСД в ходе частичного протеолиза. Подробно данные обсуждаются в главе 8, здесь же мы отметим, что, возможно, пептидный линкер, соединяющий каталитический домен ЭГ 51 кДа с ЦСД, может подвергаться атаке протеазой по нескольким сайтам, что приводит к образованию нескольких изоформ ЭГ 44 кДа. Фракции, содержащие ЭГ 44 кДа, объединяли, полученный препарат рассматривали в дальнейшем как раствор гомогенного белка.
ЭГ 51 кДа проще всего было выделять из первой фракции, выходящей в градиенте NaCl, первой стадии очистки. Время удерживания ЭГ 51 кДа на первой стадии очистки в предложенной схеме разделения комплекса (рис. 15) очень чувствительно к стартовым условиям. Если фермент оказывается в несвязавшийся фракции, то приходится прибегать к дополнительной стадии анионообменной хроматографии при более высоком значении рН. Поэтому на первой стадии разделения ферментов С. lucknowense необходимо было особенно тщательно уравновешивать колонку, контролировать значение рН и ионную силу стартового буфера. Для уравновешивания колонки Source 15 Q рекомендуется использовать 0,025 М Bisris-HCl буфер, рН 6,6, в указанных условиях белок надежно связывается с носителем (рис 16). Получить ЭГ 51 кДа в гомогенном виде можно с помощью хроматофокусирования в градиенте рН 6,5-5,0. Хроматограмма представлена на рис. 18.
ЭГ III массой 28 кДа, pi 5,7 первоначально была выделена из фракции 6, полученной в градиенте соли на второй стадии аналитического разделения UV 18-25 CL1-09 # 648.2.2 (катионообменная хроматография на колонке Mono S). Фермент можно получить в гомогенном виде с помощью хроматофокусирования в градиенте рН 7,6-5,5. Однако, как и в случае ЭГ 51 кДа, использование катионообменной хроматографии приводило к необходимости привлечения дополнительной стадии очистки. Удобнее получать гомогенную ЭГ III, нанося несвязавшуюся на первой стадии очистки белковую фракцию на анионообменную колонку Mono Q при рН 7,1. При данном значении рН большая часть белков не связывается с носителем. Гомогенная ЭГ III элюируется в градиенте соли при концентрации NaCl 0,05 М. Хроматограмма представлена на рис. 19. Преимуществом анионообменной хроматографии на колонке Mono Q перед хроматофокусированием являются быстрота разделения и меньшая инактивации белков на носителе. Кроме того, использование колонки Mono Q позволяет получить большее количество выделяемого белка за один тур очистки. Преимуществом хроматофокусирования обычно является большая разрешающая способность, однако в данном случае использование колонки Mono Q позволяло получить белок в гомогенном виде.
ЭГ V (25 кДа), ЭГ 47 кДа и ЭГ 60 кДа выделяли из соответствующих белковых фракций хроматофокусированием. При выделении ЭГ V использовали градиент рН 5,0-3,5. ЭГ 47 кДа подвергали хроматофокусированию в градиенте рН 5,5-4,0 и ЭГ 60 кДа в градиенте рН 4,0-3,5. Предварительно белковые фракции, содержащие ЭГ V и ЭГ 47 кДа, были переведены гельфильтрацией в 25 мМ пиперазин-НС1 буфер с соответствующим значением рН. Для выделения ЭГ 60 кДа использовали 25 мМ метилпиперазин-HCl буфер с рН 4,0. Хроматограммы представлены на рис. 19-20.
Мы установили, что ЦБГ I С. lucknowense существует в двух формах (65 кДа и 52 кДа). По нашему предположению, ЦБГ I 52 кДа является каталитическим доменом полноразмерной ЦБГ I 65 кДа, лишенным целлюлозосвязывающего домена (ЦСД) и гликозилированного линкера [190]. По видимому ЦБГ I 52 кДа и образуется из ЦБГ I 65 кДа путем частичного протеолиза в ходе ферментации. Соотношение двух форм ЦБГ варьирует в зависимости от условий ферментации и таким образом различно в получаемых препаратах. Первая стадия очистки позволяла добиться некоторого разделения двух форм ЦБГ I, однако выделить ферменты в гомогенном виде ни ионообменной, ни гидрофобной хроматографией не удалось. В итоге ЦБП 52 кДа и 65 кДа были выделены гельфильтрацией на колонке Superosel2 (Pharmacia), 0,1 М AcNa, рН 5,0, скорость потока 0,3 мл/мин (рис. 17). Разделение происходило из-за того, что белок массой 65кДа выходил значительно позже времени удерживания, рассчитанного исходя из молекулярной массы. Скорее всего этот факт объясняется наличием у белка ЦСД.
СВН I 52 кДа дочищали хроматофокусированием на колонке Mono Р (Pharmacia), уравновешенной 0,025 М пиперазиновым буфером, рН 5,0, в градиенте рН 5-3,5. Даже в том случае, если после гельфильтрации удавалось получить ЦБГ I 52 кДа удовлетворительной чистоты по данным ДЦС-гельэлектрофореза, стадия хроматофокусирования необходима, так как ЦБГ I 52 кДа всегда загрязнена ЭГ V. Хроматофокусирование в указанных условиях позволяет надеясно очистить фермент от эндоглюканазной (визкозиметрической) активности. Важно отметить, что все перечисленные методы не позволяют полностью очистить ЦБГ I от р-глюкозидазы, поэтому все дальнейшие кинетические эксперименты с выделенными целлобиогидролазами проводили либо с добавлением глюконолактона, являющегося конкурентным ингибитором р-глюкозидаз, либо с добавлением р-глюкозидазы А. japonicus для полного переведения продуктов действия ЦБГ І в глюкозу.
ЦБГ II была выделена анионообменной хроматографией. Соответствующую белковую фракцию после первой стадии очистки наносили на колонку Mono Q, уравновешенную 0,025 М пиперазин-HCl рН 5,5. Гомогенный белок элюировали в градиенте соли при концентрации NaCl 0,1 М.
