Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Состав и строение растительной биомассы 8
1.1 Основные компоненты растительной биомассы 8
1.2 Строение и физико-химические свойства целлюлозы 9
1.3 Гемицеллюлозы и пектины 14
1.4 Лигнин 15
Глава 2 Свойства и роль целлобиогидролаз 17
2.1 Целлюлазы и их место в классификации гликозид-гидролаз 17
2.2 Особенности структуры целлобиогидролаз 21
2.3 Строение активных центров целлобиогидролаз 23
2.4 Структура и роль ЦСМ 26
2.5 Функция линкера 27
2.6 Механизм действия целлюлазного комплекса 28
2.7 Молекулярные и физико-химические характеристики грибных целлобиогидролаз 32
Экспериментальная часть 36
3.1 Объекты исследования и реактивы 36
3.2 Выделение и очистка ферментов 37
3.3 Аналитические методы 38
3.4 Определение физико-химических и каталитических параметров ферментов 39
3.5 Гидролиз различных целлюлозосодержащих субстратов 4,1
3.6 Масс-спектрометрический анализ пептидов и построение трехмерных моделей ферментов 43
Результаты и их обсуждение 45
Глава 4 Выделение и очистка целлобиогидролаз C.lucknoweme и Т. reesei 45
4.1 Выделение целлобиогидролаз С. lucknowense 45
4.2 Выделение целлобиогидролаз Т. reesei 50
Глава 5 Масс-спектрометрический анализ целлобиогидролаз С. h/cknowense и их
аминокислотные последовательности 54
5.1 ЦБПаиГЬ 7-й семьи гликозид-гидролаз 54
5.2 ЦБГ Па и lib 6-й семьи гликозид-гидролаз 68
Глава 6 Свойства целлобиогидролаз С. lucknowense и Т. reesei 76
6.1 Субстратная специфичность и каталитические свойства целлобиогидролаз 76
6.2 Адсорбционные характеристики целлобиогидролаз 80
6.3 Термостабильность ферментов 81
6.4 Влияние температуры и рН на активность ферментов 84
Глава 7 Рациональный дизайн мультиферментных смесей для высокоэффективного гидролиза целлюлозосодержащих материалов 87
7.1 Сравнение эффективности действия различных целлобиогидролаз на МКЦ 87
7.2 Синергизм между целлюлазами С. lucknowense 89
7.3 Гидролиз целлюлозных субстратов комбинациями целлюлаз 93
7.4 Гидролиз целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства смесями очищенных целлюлаз 97
Выводы 107
Список литературы 109
- Основные компоненты растительной биомассы
- Целлюлазы и их место в классификации гликозид-гидролаз
- Объекты исследования и реактивы
Введение к работе
Сжигание огромного количества нефти, угля и газа приводит к так называемому «парниковому эффекту» вследствие выбросов двуокиси углерода в атмосферу и общему ухудшению экологической обстановки на Земле. Кроме того, в последнее время резко возросли цены на нефть и другие энергоносители. Одним из решений этих проблем является использование альтернативных видов топлива (этанола, бутанола и др.), получаемых из возобновляемой растительной биомассы путем ее ферментативного гидролиза с последующим сбраживанием получаемых Сахаров [1, 2]. Это помогло бы решить еще одну мировую проблему, такую как утилизация целлюлозосодержащих отходов промышленности и сельского хозяйства.
Главным компонентом растительной биомассы является целлюлоза. Ферменты, осуществляющие биодеградацшо целлюлозы, занимают центральное место в круговороте органического углерода. Основными микроорганизмами, продуцирующими целлюлазы, являются микроскопические грибы - возбудители мягкой, белой и бурой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий.
Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз различные штаммы грибов рода Trichoderma (Т. reesei, Т. viride, Т. longibrachiatutn) играют ведущую роль [3]. Это обусловлено их высокой секреторной способностью, а также разнообразием продуцируемых ферментов с различной субстратной , специфичностью, что делает эти продуценты универсальным объектом для использования по различным направлениям. Известно, что эффективность ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов зависит от качественного состава мультиферментного целлюлазного комплекса и свойств его компонентов [4]. В свою очередь, среди свойств индивидуальных компонентов основными являются: удельная активность фермента по отношению к целлюлозному субстрату, его стабильность, а также толерантность по отношению к продуктам реакции, которые могут ингибировать активность фермента. Активность целлюлаз по различным целлюлозосодержащим субстратам может существенно различаться в зависимости от степени кристалличности субстрата, наличия в его составе примесей (лигнина и гемицеллюлоз), а также ряда других факторов. Поэтому, по-видимому, не существует идеального целлюлазного комплекса, который является оптимальным для любого вида целлюлозосодержащего сырья. Тем не менее, в литературе весьма распространена точка зрения, что целлюлазные комплексы, продуцируемые мутантными штаммами гриба Т. reesei (71 longibrachiatum) являются наиболее эффективными разрушителями природной целлюлозы и их практически невозможно
превзойти по скорости и глубине гидролиза субстрата [5, б]. Целлюлазные комплексы Т. reesei (Т. longibrachiatiim) в основном состоят из двух целлобиогидролаз - ЦБГ I (40-60% от общего количества секретирусмого белка) и ЦБГ II (12-20%), и двух эндоглюкапаз - ЭГ I и ЭГ II, суммарное содержание которых составляет 10-20%. Наиболее существенным недостатком данного продуцента целлюлаз является, как правило, низкое содержание р-глюкозидазы [7], отвечающей за конверсию промежуточных продуктов ферментативного гидролиза целлюлозы в конечный продукт - глюкозу.
Ключевыми ферментами целлюлазного комплекса, ответственными за глубокий гидролиз нерастворимой целлюлозы в растворимые сахара, являются целлобиогидролазы. Основным продуктом действия этих ферментов является целлобиоза (димер глюкозы) Целлобиогидролазы I и II Г. reesei относятся к наиболее изученным ферментам, разрушающим природные полисахариды. Только по этим двум ферментам в литературе можно найти сотни публикаций. Достаточно много информации опубликовано также о целлобиогидролазах из таких грибных продуцентов целлюлаз, как Humicola insolens, Phanerochaete chrysosporium и некоторых других, в тоже время о свойствах других грибных целлобиогидролаз известно значительно меньше, несмотря на то, что в базах данных белков имеется значительное количество их аминокислотных последовательностей, транслированных из генов.
В результате совместных исследований ИБФМ РАН и кафедры химической энзимологии МГУ был найден перспективный продуцент целлюлаз и гемицеллюлаз -гриб Chrysosoporium lucknowense, на основе которого были получены новые мутантные штаммы, отличающиеся высокой секреторной способностью. По уровню секреции внеклеточного белка (50-80 г/л) некоторые штаммы С. lucknowense не уступают, либо превосходят лучшие известные промышленные продуценты целлюлаз. Ранее в нашей лаборатории (физнко-химии ферментативной трансформации полимеров кафедры химической энзимологии МГУ) были выделены и детально исследованы эндоглюканазы и ксиланазы С. lucknowense [8, 9], однако свойства целлобиогидролаз не изучались, хотя были получены предварительные данные об их наличии в составе ферментного комплекса данного гриба.
Учитывая актуальность исследования целлобиогидролаз, продуцируемых различными микроорганизмами, как ключевых ферментов при гидролизе природной целлюлозы, а также необходимость поиска новых целлюлаз, способных осуществлять высокоэффективный гидролиз целлюлозосодержащих материалов, в данной работе были поставлена следующая цель: выделить и изучить биохимические и физико-химические свойства всех целлобиогидролаз, секретируемых грибом С. lucknowense, а также оценить
Основные компоненты растительной биомассы
Наиболее важные химические компоненты клеточных стенок растений - это полисахариды [10] - очень длинные неразветвленные молекулы, существующие в основном в кристаллической форме, которые в клеточной стенке агрегированы в пучки, называемые микрофибриллами [12, 13, 14]. Наиболее распространенным микро фибриллярным полисахаридом растительной биомассы является целлюлоза. Микрофибриллы заключены в матрикс, состоящий из полисахаридов второй категории, которые не имеют кристаллической структуры. Полисахариды матрикса в свою очередь по химической структуре и растворимости делятся на пектины и гемице ллю лозы. Пектины хорошо экстрагируются кипящей водой, в то время как гемицеллюлозы растворимы лишь в 4 М растворе КОН (микрофибриллярные полисахариды не растворимы ни в кипящей воде, ни в щелочи). Полисах аридную структуру клеточной стенки можно сравнить со структурой железобетона; при этом целлюлозные кристаллические микрофибриллы эквивалентны стальным стержням арматуры, а полисахариды матрикса - окружающему их бетону. Следует заметить, что полисахаридиый состав матрикса у различных типов растений может быть неодинаковым, поэтому не существует стандартных методов, с помощью которых можно было бы разделить полисахариды этих классов на подклассы; каждый биологический материал требует своей специфической обработки. В то же время указанные полисахариды могут быть классифицированы по химической структуре.
В клетках растений также содержится лигнин (до 40%) - нерастворимый фенольнын полимер, который особенно распространен в клетках деревьев, где он ассоциирован с первичной и вторичной клеточными стенками.
Полисахаридный состав лигноцеллюозных материалов, полученных из разных источников представлен в табл. 1.
Как видно из таблицы, в травах, лиственных и хвойных деревьях содержание целлюлозы приблизительно одинаковое, в то время как содержание других полисахаридов сильно различается. В лиственных породах деревьев целлюлоза ассоциирована в основном с ксиланом, а в хвойных содержание ксилана значительно меньше, зато относительно много маннанов и галактанов. В травах содержится много ксилана и арабинана.
Строение и физико-химические свойства целлюлозы
Целлюлоза - это линейный полимер, ангидроглюкозные звенья которого связанны между собой p-l,4-D-nnoK03HfliibiMii связями. В зависимости от растительного источника количество глюкозных звеньев в целлюлозе может достигать 15000 остатков [15]. Благодаря Р-связям, целлюлоза представляет собой вытянутую ленту с винтовой осью, и каждый глюкопиранозный остаток повернут примерно на 180 относительно ближайших соседей. В результате этого повторяющейся структурной единицей целлюлозы является целлобиозный остаток, а не глюкозный (рис. 1).
Целлюлоза - классический пример полимера, макромолекулы которого имеют линейное строение и который характеризуется повышенной скелетной жесткостью. Конфигурация макромолекулы целлюлозы дает возможность реализации внутри- и межмолекулярных взаимодействий. Современная точка зрения на структуру целлюлозы имеет в своей основе теорию аморфно-кристаллического ее состояния и основывается на данных электронографических, рентгенографических и других исследований [12, 16, 17, 18]. В природе целлюлозные цепи упакованы упорядочено, образуя нерастворимые микрофибриллы, стабилизированные перекрестными межмолекулярными водородными связями. Макромолекулы целлюлозы в первичных фибриллах образуют однородные высокоупорядоченные кристаллические зоны (кристаллиты), которые чередуются с неоднородными менее упорядоченными аморфными зонами [19]. Первичная фибрилла представляет собой наименьшее надмолекулярное звено целлюлозы. Общепринятой в настоящее время является модель первичной фибриллы Денниса и Престона (рис. 2) [12].
Рисунок 2. Модель первичной (элементарной) фибриллы целлюлозы по Деннису и Престону: а - поперечное сечение, в центре кристаллическое ядро, вокруг - аморфная зона; 6 - продольное сечение, сплошные линии обозначают макромолекулы целлюлозы. Пунктиры - неглюкозные полимеры.
Между первичными фибриллами в микрофибрилле находится лигнин и гемицеллюлоза. Микрофибриллы образуют кристаллы с различными параметрами кристаллической решетки, при этом от типа упаковки кристалла зависят физические и, в особенности, химические свойства целлюлозы. Каждому типу целлюлозы с определенной кристаллической решеткой присвоены римские цифры. На рис. 3 показаны превращения различных типов целлюлозы друг в друга [19].
Целлюлазы и их место в классификации гликозид-гидролаз
Ферментативный гидролиз целлюлозы осуществляется в природе системой различающихся по субстратной специфичности ферментов, которая получила название целлюлазного комплекса [27]. Целлюлолитические ферменты относятся к классу р-1,4-глюканаз, т.е. карбогидраз (гликозид-гидролаз), гидролизующих Р-1,4-связи в О-глюкозидных соединениях. По типу действия на субстраты целлюлазы делят на эндо-1,4-р-глюканазы (КФ 3.2.1.4), экзо-целлобиогидролазы (КФ 3.2.1.91), экзо-1,4-Р-глюкозидазы (КФ 3.2.1.74) и р-глюкозидазы (целлобиазы) (КФ 3.2.1.21) [15, 28].
Основными продуцентами целлюлаз в природе являются микроскопические грибы и бактерии. Целлюлолитические ферменты также найдены в растениях, моллюсках, червях и других наземных и морских беспозвоночных, а также у некоторых насекомых (в частности, в термитах) [29, 30, 31, 32]. Однако целлюлазы этих организмов исследованы намного хуже, чем микробные ферменты.
Эндо-1,4-Р-глюканазы (ЭГ) - ферменты, гидролизующие внутренние (3-1,4-глюкозидные связи, удаленные от концов полимерной цепи целлюлозы (а также лихенана, Р-глюкана злаков, карбоксиметилцеллюлозы - КМЦ) с образованием фрагментов полимерного субстрата и целлоолнгосахаридов, что сопровождается резким уменьшением степени полимеризации (СП) субстрата. ЭГ, как правило, гидролизуют аморфные участки целлюлозы, но известны ЭГ, гидролизующие и кристаллическую целлюлозу [28, 33]. ЭГ часто делят на ферменты «менее упорядоченного» и «более упорядоченного» типа действия [28, 34]. Первые вызывают более резкое уменьшение СП субстрата с образованием крупных олигосахаридов (без образования моно- или дисахаридов). ЭГ «более упорядоченного» действия одновременно с деполимеризацией отщепляют MOHO-, ди- и трисахариды и не столь существенно уменьшают СП полимера.
Целлобиогидролазы (ЦБГ) отщепляют остатки целлобиозы с концов полимерных молекул нативной или частично гидролизованной целлюлозы. В отличие от эндоглюканаз, ЦБГ могут гидролизовать как аморфную, так и кристаллическую целлюлозу, причем считается, что из всех целлюлаз способность гидролизовать кристаллическую целлюлозу характерна именно для ЦБГ [15, 35].
Экзо-1,4-Р-глюкозидазы (1,4-Р-Б-глюкан глюкогидролазы) гидролизуют Р-1,4-связи в 1,4-р-0-глюканах и целлоолигосахаридах с последовательным отщеплением глюкозных остатков, причем скорость гидролиза увеличивается с увеличением числа глюкозидных остатков в олигосахариде [15, 28]. Очень медленно данные ферменты могут гидролизовать целлобиозу. Следует отметить, что к настоящему времени известно очень мало истинных экзо-1,4-(3-глюкозидаз. Все они были выделены либо из растительных источников [36, 37], либо из бактерий [38, 39]. В литературе был описан также дрожжевой фермент с подобной специфичностью [40]. Существование экзо-1,4-3 глюкозидаз в грибах остается до настоящего времени под вопросом, и, по-видимому, достоверно известен всего лишь один такой фермент [41].
р-Глюкозидазы (целлобиазы) отщепляют концевые нередуцирующие остатки Р-D-глюкозы от целлобиозы и олигосахаридов, причем скорость гидролиза, как правило, уменьшается с увеличением числа глюкозидных остатков в олигосахариде [15, 28]. В отличие от эндоглюканаз и целлобиогидролаз, специфичность действия р-глюкозидаз, как правило, более широкая, и часто они способны расщеплять не только Р-1,4-, но и Р-1,2-, р-1,3-, р-1,6-глюкозидные связи. Некоторые ферменты способны также гидролизовать P-D-галактозиды, a-L-арабинозиды или p-D-ксилозиды. Кроме того, многие р-глюкозидазы могут отщеплять терминальные гликозидные остатки от арил- и алкил-гликозидов.
Указанная выше традиционная классификация целлюлаз по типу действия на полимерный субстрат (эндо- или окзо-тип действия) была подвергнута критике, причем не всегда справедливой, и в конце 1980-х годов Хенриссатом с соавторами была предложена новая общая классификация целлюлаз, основанная на данных гидрофобного кластерного анализа (ГКА) [42]. Метод ГКА базируется на сравнении двумерной топологии и распределения двумерных кластеров аминокислот вдоль полипептидной цепи белка. К тому времени уже были накоплены данные по аминокислотным последовательностям целлюлаз из различных источников и было обнаружено, что многие ферменты имеют доменную (модульную) структуру, т.е. состоят из каталитического домена и целлюлозосвязывающего модуля (ЦСМ), которые соединены пептидным линкером [43, 44] (более подробно об этом см. раздел 2.2). Согласно данным ГКА, авторы работы [42] разделили каталитические домены целлюлаз на 6 семейств: «A»-«F». Несколько позже тем же Хенриссатом было предложено классифицировать целлюлазы (и, в общем случае, гликозид-гидролазы) по гомологии первичных аминокислотных последовательностей и структурным особенностям с учетом доменной организации молекулы белка [45]. Таким образом аминокислотные последовательности каталитических доменов гликозид-гидролаз (всего 291 последовательность), представляющих 39 отдельных позиций (номеров) в «Номенклатуре ферментов», были разделены на 35 семей. Семьи целлюлаз от А до F получили номера 5, 6, 7, 8, 9 и 10, соответственно. В дальнейшем количество семей постоянно увеличивалось [46, 47, 48].
Объекты исследования и реактивы
Используемые ферменты и ферментные препараты. Гомогенные компоненты целлюлазного комплекса, секретируемые грибом Т. reesei, выделяли из мультикомпонентных ферментных препаратов BioACE #210.89 и АСЕ ULTRA L-1000 #210.60 фирмы «Dyadic, Inc.» (США). Целлобиогидролазы С. lucknoweme (штамм UV18-25) выделяли из препарата NCE L600 (ИБФМ РАН, Пущино). Очищенные эндоглюканазы, ксиланазы и В-глюкозидазы С. hicknowense были выделены и предоставлены аспирантами нашей лаборатории Ф.Е. Бухтояровым и Б.Б. Устиновым [8, 9]. В работе также использовали высокоочищенную Р-глюкозидазу Aspergillus japonicus (ВНИИ «Биотехника»),
Субстраты и реактивы. В работе были использованы следующие субстраты. Натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) средней вязкости, Р-глюкан, п-нитрофенил-р-О-лактозид, я-нитрофенил-р-Т глюкозид, я-нитрофенил-Р-О-целлобиозид производства фирмы «Sigma» (США), микрокристаллическая целлюлоза РН-105 (авицел) производства фирмы «Serva» (ФРГ), фильровальная бумага Ватман №1 (Watman). Хлопок предварительно обезвощивали в течение 4 суток смесью ацетон-этанол 1:1. Целлобиоза фирмы «Merck».
Образцы предобработанной лжецуги тиссолистной были предоставлены А. Берлиным и Д. Сэдлером (Университет Британской Колумбии, Канада). Багасса, предобработанная паровым взрывом в присутствии извести (#4) и предобработанные кукурузные початки (#40) были предоставлены фирмой Dyadic (США).
Для приготовления пластин с поли акрил амидным гелем для электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия, а также при изоэлектрофокусировании использовали реактивы фирмы «Reanal» (Венгрия), «Bio-Rad-laboratories» (США) и «ICN» (США). Окрашивание белка в пластинах геля проводили Кумасси бриллиантовым голубым (Coomassie-Brilliant Blue G 250) фирмы «Ferak» (ФРК). В качестве стандартов при проведении изоэлектрофокусирования и электрофореза использовали наборы фирмы «Sigma» (США).
Для приготовления буферных растворов и реагентов использовали реактивы марки хч и чда производства «Реахим» (Россия), «ICN» и «Sigma». Для определения глюкозы глюкозооксрщазно-пероксидазным методом использовали реактивы из набора «Фотоглюкоза» производства ООО «Импакт» (Россия). При калибровке методов использовали D-глюкозу производства «Реахим». При определении концентрации белка методом Лоури использовали реактивы марки хч производства «Реахим» и реагент Фолина фирмы «Sigma».
Хроматографичсские носители и элюенты. Для ГПХ низкого давления использовали колонку с носителем Биогель Р4 производства фирмы «Bio-Rad» (США). Хроматофокусирование проводили на колонке «Mono Р HR 5/20» фирмы «Pharmacia» (Швеция). Ионобменную хроматографию проводили на колонке Source 15Q (анионобменный носитель) фирмы «Pharmacia» (Швеция). Для гидрофобной хроматографии использовали колонку с носителем Source 15ISO фирмы «Pharmacia» (Швеция).
При приготовлении буферных растворов использовали реактивы марки хч производства фирм «Sigma» (США), «Pharmacia» (Швеция) и «Реахим» (Россия).
Похожие диссертации на Свойства целлобиогидролаз из грибов Chrysosporium lucknowense и Trichoderma reesei
