Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. КСИЛАНЫ И КСИЛАНОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ФЕРМЕНТОВ 9
1.1. Структура и распространение ксиланов 10
1.2. Ферменты, участвующие в конверсии ксиланов 13
ГЛАВА 2. Эндо-1,4-р-КСИЛАНАЗЫ 16
2.1. Классификация, особенности молекулярного строения и механизм действия ксиланаз
2.2. Свойства ксиланаз из различных источников 28
2.3. Белковые ингибиторы ксиланаз в злаках 30
ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КСИЛАНАЗ 37
3.1. Ксиланазы в целлюлозно-бумажной промышленности 37
3.2. Использование ксиланаз в качестве компонента кормовых добавок 38
3.4. Другие перспективные направления применения ксиланаз 40
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 41
ГЛАВА 4. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ 41
4.1. Используемые ферменты и препараты 41
4.2. Субстраты и реактивы 41
4.3. Методы выделения ксиланаз С. lucknowense 43
4.4. Хроматографический анализ ферментных препаратов 44
4.5. Определение ферментативной активности, концентрации ВС и белка 45
4.6. Вискозиметрический метод определения общей эндодеполимеразной
46 активности ксиланаз
4.7. Определение рН- и температурного оптимумов действия ферментов 47
4.8. Изучение термостабильности ксиланаз 48
4.9. Исследование адсорбции ферментов на МКЦ 48
4.10. Исчерпывающий гидролиз полимерных субстратов под действием ферментов
4.11. Анализ молекулярно-массового распределения (ММР) продуктов гидролиза арабиноксилана
4.12. Анализ низкомолекулярных продуктов гидролиза ксиланов 49
4.13. Трипсинолиз белков и подготовка проб для масс-спектрометрии 50
4.14. Масс-спектрометрический анализ Сахаров и трипсиновых гидролизатов белков
4.15. Метод оценки влияния белковых ингибиторов ржи на активность ксиланаз
4.16. Оценка способности ферментов снижать вязкость экстрактов ржаной
муки (in vitro тест, имитирующий работу фермента в качестве кормовой добавки)
4.17. Оценка способности ферментов к биоотбеливанию небеленой целлюлозы 53
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 54
ГЛАВА 5. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА КСИЛАНАЗ С. LUCKNOWENSE 54
5.1. Компонентный состав и общая характеристика ферментного комплекса С. lucknowense
5.2. Выделение ксиланаз и их биохимические характеристики 58
5.3. Свойства гомогенных ксиланаз С. lucknowense 70
5.3.1. Специфичность ксиланаз и механизм их действия на полимерные
субстраты
5.3.2. Физико-химические свойства ксиланаз С. lucknowense 80
ГЛАВА 6. КЛАССИФИКАЦИЯ И МОЛЕКУЛЯРНОЕ СТРОЕНИЕ КСИЛАНАЗ 86
6.1. Масс-спектрометрический анализ выделенных белков и аминокислотные последовательности их пептидов
6.2. Аминокислотные последовательности и строение ХупЮА и ХупЮВ -гликозид-гидролаз 10-й семьи
6.3. Аминокислотные последовательности и строение Xynl 1А и Xynl 1С -гликозид-гидролаз 11-й семьи
109
ГЛАВА 7. КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ И СВОЙСТВА ПРЕПАРАТОВ С КЛОНИРОВАННЫМИ КСИЛАНАЗАМИ С. LUCKNOWENSE
7.1. Общая характеристика и свойства препаратов на основе штаммов гриба с мультикопированными генами ксиланаз
7.2. Анализ компонентного состава ферментных препаратов с увеличенным содержанием ХупЮА, Xynl 1А и ХупЮВ
3
ГЛАВА 8. ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КСИЛАНАЗ С. LUCKNOWENSE В КАЧЕСТВЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ И В ЦЕЛЛЮЛОЗНО-БУМАЖНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ 120
8.1. Влияние белковых ингибиторов злаков на активность выделенных ксиланаз
8.2. Оценка эффективности действия индивидуальных ксиланаз и ксиланазных 123 препаратов при их использовании в качестве добавки к кормам на основе ржи
8.3. Сравнение способности индивидуальных ксиланаз и препаратов С. lucknowense к биоотбеливанию небеленой целлюлозы
ВЫВОДЫ 134
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 136
- Структура и распространение ксиланов
- Классификация, особенности молекулярного строения и механизм действия ксиланаз
- Ксиланазы в целлюлозно-бумажной промышленности
Введение к работе
В настоящее время развитие современной энзимологии осуществляется по двум направлениям. Первое вкшочает в себя накопление фундаментальных знаний и углубленное изучение механизма действия ферментов. Второе связано с поиском возможности их использования в качестве биокатализаторов в различных биотехнологических процессах. Необходимость перехода на более новые экономичные и безопасные с точки зрения экологии технологические процессы способствует интенсивному изучению прикладных аспектов ферментативного катализа.
Ксиланазы и в целом ксиланолитическая система ферментов участвуют в биодеградации гемицеллюлоз, а именно ксиланов, которые являются одними из наиболее распространенных полисахаридов на Земле [1]. Источником этих ферментов служат микроскопические грибы, различные виды аэробных и анаэробных бактерий, а также дрожжи.
Фундаментальные исследования ксиланаз начались около 50 лет назад (несколько позже, чем целлюлаз). Эти ферменты в первую очередь рассматривались в качестве биокатализаторов для глубокой конверсии возобновляемого растительного сырья, ферментативного получения глюкозы и ксилозы и, в конечном счете, биотоплива - этанола [2]. Однако только к концу 1980-х годов ксиланазы заняли свою, хотя и небольшую, но прочную нишу среди промышленных ферментов. Можно выделить ряд технологических процессов, в которых ксиланазы играют ключевую роль. Среди них: биоотбеливание целлюлозы в целлюлозно-бумажной промышленности; использование ксиланаз в качестве добавки к комбикормам; хлебопечение; производство соков и вин; переработка отходов сельскохозяйственных и пищевых производств; конверсия гемицеллюлозного сырья с целью получения ксилита и этанола [1-3,4]. Применение биокатализаторов в каждом из перечисленных процессов обосновано как с экономической, так и с экологической точки зрения.
По оценкам специалистов современный рынок промышленных ферментов составляет около 2 млрд. долларов США, при этом доля карбогидраз, гидролизующих некрахмалистые полисахариды (целлюлаз, ксиланаз и пектиназ), составляет более 20% [2,5]. Ксиланазные препараты выпускаются во многих странах ведущими компаниями — производителями промышленных ферментов, в частности, Novozymes (Дания), PrimAlko (Финляндия), Diversa Corporation (США), BASF (ФРГ), АВ Enzymes Gmbh (ФРГ), Alltech (США) и др. Подавляющие большинство ксиланазных препаратов производится на основе различных штаммов грибов Trichoderma reesei (Т. longibrachiatum), Humicola insolens, Aspergillus niger, а также бактерий Bacillus sp. С развитием генной инженерии для получения ксиланаз широко начали использовать трансгенные конструкции, полученные путем клонирования генов бактериальных ксиланаз в грибные штаммы-продуценты.
Безусловно, от ферментов, применяемых в промышленности, требуется наличие определенных свойств, таких как высокая активность в нужном диапазоне рН, стабильность и, для некоторых процессов, устойчивость к воздействию ингибиторов растительного происхождения. Этот факт стимулирует поиск новых источников ксиланаз и поддерживает развитие фундаментальных знаний о строении, классификации и особенностях механизма действия этих ферментов.
В середине 1990-х годов в нашей лаборатории совместно с коллегами из Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН был найден новый перспективный продуцент целлюлаз и ксиланаз - мицелиальный гриб Chrysosporium lucknowense [б]. Данный продуцент обладает рядом преимуществ по сравнению с другими известными источниками карбогидраз, например, Т. reesei. Гриб способен расти в широком диапазоне рН (4,5-9,0) и температуры (25-43С). Наиболее продуктивные штаммы С. lucknowense секретируют до 50-80 г/л внеклеточного белка, основная часть которого — ферменты, участвующие в конверсии полисахаридов. Серьезным преимуществом данного продуцента является способность секретировать карбогидразы, обладающие высокой активностью и стабильностью в нейтрально-щелочной среде, что делает его ферменты перспективными для использования в ряде биотехнологических процессов, например, в случае ксиланаз, для биоотбеливания целлюлозы в целлюлозно-бумажной промышленности.
В настоящий момент достаточно хорошо изучен лишь целлюлазный комплекс ферментов, продуцируемый С. lucknowense [7], однако системного исследования ксиланаз не проводилось. Сведения, относящиеся к ним, отсутствуют в научной литературе и белковых базах данных. Поэтому актуальность данного исследования продиктована как необходимостью системного изучения фундаментальных свойств и особенностей функционирования ксиланаз С. lucknowense, так и возможностью в перспективе использовать некоторые из них в качестве промышленных биокатализаторов.
Исходя из этого, в диссертационной работе были поставлены следующие цели и задачи: выделить и детально охарактеризовать все секретируемые грибом
С. lucknowense ксиланазы, включая изучение их субстратной специфичности, особенностей механизма действия, биохимических и физико-химических свойств; получить информацию по аминокислотным последовательностям белков (или отдельных пептидов), на основании которой ферменты могли бы быть классифицированы с точки зрения принадлежности к той или иной семье гликозид-гидролаз; исследовать свойства ферментных препаратов на основе штаммов гриба с мультикопированными генами собственных ксиланаз; среди выделенных ферментов выявить наиболее перспективные с точки зрения возможности их применения в целлюлозно-бумажной промышленности и в качестве добавки к комбикормам.
Структура и распространение ксиланов
Гемицеллюлозы составляют в среднем около 20% растительной клеточной стенки [8,11,12]. Функциональная роль гемицеллюлоз, как полисахаридов матрикса, заключается в осуществлении связи между основными компонентами клеточной стенки за счет образования переходного слоя между ними. В первичной клеточной стенке гемицеллюлозы объединяют пектины и целлюлозу, во вторичной -целлюлозу и лигнин. Большинство изученных гемицеллюлоз являются гетерополисахаридами, в состав звеньев основной цепи которых могут быть включены: D-ксилоза, D-манноза, D-галактоза, D-глюкоза. Наиболее распространены среди гемицеллюлоз ксиланы [8,12].
Ксиланы - это сложные гетерополимеры, основная цепь которых построена из остатков D-ксилопиранозы, соединенных р-1,4-гликозидными связями. Классификацию этой большой группы полисахаридов проводят, основываясь на общем содержании и природе боковых заместителей, в качестве которых чаще всего присутствуют L-арабинофураноза, D-глюкуроновая (4-0-метил-Б-глюкуроновая) кислота, а также остатки феруловой, и-кумаровой и уксусной кислот (табл. 1.1) [12].
Полисахарид Источник жание,% Состав связи СП
Гомоксилан (родименан) Морские водоросли - p-D-Xvlp 1-Й 1н 3 —
Арабиноксилан Однолетние растения 20-40 p-D-Xvto oc-L-Ara/4-O-Me-a-D-GlcA Ферулоил л-Кумароил О-Ас 1-й 1-+31-+2,3 1-+2 70 Арабино-4-О-метил- Хвойная p-D-Xvlp 1-й 120 глюкуроноксилан древесина 7-8 4-O-Me-a-D-GlcA a-L-Ага/ 1-+2 l- 3 О-ацетил-4-О- Лиственная 10-35 p-D-Xvlp 1-й 200 метилглюкуроно- древесина 4-O-Me-a-D-GlcA 1-+2 ксилан O-Ac Ac - ацетил-, Ага/- арабинофуранозид; GlcA - глюкуроновая кислота; Xylp - ксилопиранозид; Подчеркнуто звено основной цепи.
Арабиноглюкуроноксилан (арабиноксилан) — гетерополисахарид, составляющий 7-8% сухой массы мягкой (хвойной) древесины. Основная цепь его построена из 1,4-Р-Б-ксилопиранозных звеньев, а боковые группы представляют собой 4-0-метил-Б-глюкуроновую кислоту (а-1,2-связь, 20%) и L-арабинофуранозу (а-1,2 и а-1,3-связь, 10-15%) [12,13].
Химическое строение арабиноксиланов злаковых растений во многом зависит от их локализации. Арабиноксиланы, входящие в состав оболочки зерна, по структуре схожи с арабиноксиланом мягкой древесины. Арабиноксиланы, входящие в состав эндосперма, в качестве боковых заместителей содержат только L-арабинозу (а-1,3 и а-1,2-связь, а-1,3 доминирует, рис. 1.2А) [8,12]. Содержание арабинозы в качестве боковых заместителей в данном случае существенно выше, чем в арабиноксиланах хвойных пород деревьев. Это определяет высокую вязкость растворов арабиноксиланов зерен злаков.
Арабиноксиланы однодольных растений этерифицированы по гидроксильной группе С(5) атома L-арабинофуранозы феруловой или кумаровой кислотами [14,15]. Степень этерификации варьирует в зависимости от источника арабиноксилана. Так, например, доля феруловой и кумаровой кислот составляет 1/150 от пентозных остатков в арабиноксилане пшеничных отрубей и 1/240 в арабиноксилане соломы ячменя (в то же время доля боковых арабинозных остатков колеблется, соответственно, от 1/15 до 1/30). Степень полимеризации (СП) арабиноксиланов варьирует в пределах от 70 до 130 [12].
Ацетилглюкуроноксилан (глюкуроноксилан) - основной ксилан твердых (лиственных) пород деревьев (рис. 1.2Б). Содержание его варьирует от 15 до 30% от сухой массы древесины. В основной цепи глюкуроноксилан содержит D-ксилопиранозные остатки, соединенные р-1,4-связями, 70% которых ацилировано по гидроксильной группе С(2) или С(3) углеродных атомов ксилопиранозного кольца. Кроме того, в среднем к каждому десятому ксилозному звену в качестве боковой группы присоединена а-1,2-связью молекула 4-0-метил-Б-глюкуроновой кислоты. СП глюкуроноксилана твердых пород деревьев составляет 150-200 [12,13].
Гом о ксилан (родименан) - полисахарид, построенный исключительно из -P-D-ксилопиранозных звеньев (рис. 1.2В). Однако его основная цепь наряду с Р-1,4-гликозидными связями содержит в соотношении 2:1 также и р—1,3- связи. Источником родименана служат морские водоросли рода Rhodymenia. Благодаря своему уникальному строению, этот полисахарид часто используют в качестве модельного субстрата для изучения механизма действия ксиланаз [16,17].
Классификация, особенности молекулярного строения и механизм действия ксиланаз
Ксиланазы - это 0-гликозид-гидролазы, катализирующие гидролиз 1,4-р-ксилозидной связи в ксиланах по эндодеполимеразному механизму. Первая работа, посвященная ксиланазам бьша опубликована в 1955 году [32]. В 1961 году этот класс ферментов получил свой номер в номенклатуре ферментов — КФ 3.2.1.8, а также официальное название - эндо- 1,4-Р-ксиланазы. В литературе также можно встретить общеупотребимые синонимы этого названия: ксиланазы, эндоксиланазы, 1,4-P-D-ксилан-ксиланогидролазы, Р-1,4 ксиланазы [13].
Первая классификация ксиланаз бьша произведена Вонгом [33], согласно которой ферменты были разделены на две группы на основе различий их биохимических характеристик. Первая группа включала ферменты с низкими молекулярными массами ( 30 кДа) и высокими значениями pi ( 7), вторая группа объединяла ферменты с более высокими молекулярными массами и кислыми pi. Однако из-за большого количества встречающихся исключений ( 30%) данная классификация не прижилась.
Позднее бьша разработана более полная и упорядоченная система, которая позволила классифицировать не только ксиланазы, но и все гликозид-гидролазы в целом. Сначала, основываясь на анализе гидрофобных кластеров белков, а затем на гомологии их аминокислотных последовательностей все гликозид-гидролазы были объединены в семьи [34,35,36,37]. Данная классификация, предложенная Хенриссатом, в настоящий момент включает 106 семей гликозид-гидролаз. В результате дивергентной эволюции представители разных семьей гликозид-гидролаз стали обладать похожей архитектурой молекул. Исходя из чего было предложено объединять семьи в более высокие иерархические уровни — кланы (с GH-A по GH-N) [38]. В 1999 году был создан специальный веб-сайт, на котором находится и постоянно обновляется информация о всех известных на сегодняшний момент гликозид-гидролазах, гликозид-трансферазах, карбогидрат-эстеразах, а также углевод-связывающих модулях (УСМ). Информация на сайте содержит ссылки на статьи, патенты и белковые базы данных с кристаллическими структурами и аминокислотными последовательностями ферментов. Сайт имеет название -Carbohydrate-Active enZYme (CAZY сервер) на URL: http://afinb.cnrs-mrs.rr/CAZY/.
Поскольку строение и механизм действия ферментов находятся в прямой зависимости от их первичной структуры, классификация, предложенная Хенриссатом, оказалась удачной и отражает оба эти аспекта. Молекулы ферментов внутри конкретной семьи имеют одинаковый фолдинг и обладают сходным механизмом действия на полимерные и синтетические субстраты [37,39].
Если провести поисковый запрос в базе данных CAZY сервера по классификационному номеру 3.2.1.8, то ферменты, обладающие ксиланазной активностью, можно обнаружить в семьях 5, 8, 10, 11, 16, 52 и 62. Однако из этого списка ферменты из 16-й, 52-й и 62-й семьи являются бифункциональными, т.е. содержат несколько каталитических доменов, в том числе домены, принадлежащие 10-й и 11-й семье гликозид-гидролаз (http://afinb.cnrs-mrs.rr/CAZY/).
Таким образом, истинные эндо-1,4-Р-ксиланазы - ферменты, содержащие единственный каталитический домен и демонстрирующие преимущественно эндо-1,4-р-ксиланазную активность, согласно классификации Хенриссата представлены в следующих семьях: 5, 8, 10 и 11-й. Представители этих семей отличаются между собой физико-химическими свойствами, структурой и субстратной специфичностью. Подавляющее большинство известных ксиланаз принадлежат к 10-й и 11-й семьям гликозид-гидролаз (табл. 2.1).
Ксиланазы в целлюлозно-бумажной промышленности
На начальной стадии получения бумаги древесина подвергается сульфитной или щелочной варке, т.н. Крафт-процесс, при котором удаляется до 90% лигнина и гемицеллюлоз. Однако полученная целлюлозная пульпа имеет недостаточную белизну. Ее дополнительное отбеливание осуществляется различными окисляющими агентами, такими как хлор, оксид хлора, перекись водорода и озон [1,4,126]. Использование отбеливателей на основе хлора приводит к тому, что в качестве побочных продуктов процесса получаются токсичные вещества, такие как диоксины и полихлорфенолы. Применение после Крафт-процесса ферментативной обработки целлюлозы ("biobleaching") позволяет на 15-20% уменьшить расход и негативные последствия использования химических реагентов и улучшить качество отбеливания [1].
Впервые возможность применения ксиланаз для отбеливания целлюлозы была показана в 1986 году. Механизм, с помощью которого ферменты способствуют повышению эффективности последующего отбеливания, еще до конца не ясен. Возможно, ксиланазы, гидролизуя ксиланы, осажденные на волокнах целлюлозы, увеличивают пористость пульпы и, соответственно, ее доступность для отбеливающих агентов [127,128]. Существует также предположение, что ферменты способствуют высвобождению хромофоров или остаточного лигнина, ассоциированных или ковалентно связанных с углеводами [126,129,130]. Согласно последним данным [131], наблюдается корреляция между увеличением поглощения раствора над пульпой при длине волны 237 нм (после действия ксиланаз) и эффективностью последующего отбеливания. Авторы этого исследования считают, что одним из продуктов, выделяющихся при действии ксиланаз на пульпу, являются олигосахариды, содержащие гексенуроновую кислоту, имеющую максимум поглощения при 230-235 нм.
После того, как целлюлозная масса прошла сульфатно-щелочную варку, ее отмывают водой, однако рН и температура среды при этом все еще остаются достаточно высокими. А поскольку процесс делигнификации идет непрерывно, это сильно ограничивает возможности применения ферментов. Это обстоятельство стимулирует "создание" и поиск ксиланаз, активных и стабильных в нейтрально-щелочных условиях. Специфичность ксиланаз в этом случае не имеет особого значения [13].
Хотя основную роль в биоотбеливании целлюлозы отводят ксиланазам, не исключено также участие и других ферментов, в частности р-маннаназ и эндоглюканаз, обладающих широкой специфичностью [132,133].
Использование ксиланаз в качестве компонента кормовых добавок
Применение ксиланаз в качестве премикса при производстве комбикормов является одним из первых направлений их использования. Введение ферментных препаратов в корма преследует две основные цели - повышение их усвояемости и увеличение продуктивности животных и птиц. [134]. В настоящее время во многих странах мира, включая Россию, использование ферментов для этих целей стало практически повсеместным. Основным стимулом для этого является возможность при добавлении ферментов переходить на более дешевые, но менее питательные рационы на основе трудноусвояемых злаков, таких как рожь, ячмень, овес.
Было показано, что замена кукурузы в кормовом рационе птиц на зерно ячменя или ржи, приводит к замедлению их роста и в редких случаях даже к гибели [135]. Главной причиной этого явления оказались водорастворимые некрахмалистые полисахариды (ВРНКП): арабиноксиланан (в случае ржи, пшеницы), р-глюкан (ячмень и овес), пектины (бобовые культуры) [136,137,138].
Причины отрицательного воздействия некрахмальных полисахаридов на пищеварительный процесс животных и птиц до конца не выяснены. Поэтому в литературе иногда встречаются различные, иногда даже противоречивые объяснения одних и тех же явлений [137-139]. У жвачных животных ВРНКП расщепляются ферментами микрофлоры рубца и не создают препятствий нормальному протеканию процесса пищеварения. У свиней и птиц частичное переваривание некрахмальных полисахаридов происходит лишь в толстом отделе кишечника, с помощью ферментов симбиотических организмов. В тонком кишечнике сильно набухающие полисахариды (ксиланы, р-глюканы, пектины) создают вязкую, гелеобразную структуру, в которой затруднен гидролиз основных питательных компонентов и всасывание продуктов гидролиза. Есть предположение, что .некрахмальные полисахариды выстилают стенки пищеварительного тракта, создавая механический барьер для всасывания питательных веществ. Гидролизу (усвоению) питательных компонентов также препятствует образование их комплексов с некрахмальными полисахаридами (белков — с ксиланами и пектином, липидов — с пектином). Липиды медленно расщепляются из-за слабого эмульгирования в вязкой среде, причем твердые животные жиры с высоким содержанием насыщенных жирных кислот эмульгируются труднее жидких растительных масел. Следствием низкой концентрации продуктов гидролиза и высокой вязкости среды является медленное всасывание питательных веществ. Витаминные компоненты (каротиноиды, токоферолы) и минеральные элементы не всасываются, будучи связаны с полисахаридами и нерасщепленным белком [140,141].
Как было показано, основной функцией ферментных препаратов является разрушение ВРНКП с целью снижения вязкости корма и предотвращения образования гелеобразных структур, затрудняющих пищеварение. Использование ксиланазных препаратов актуально в случае кормовых диет, включающих рожь и пшеницу, в зернах которых содержится большое количество арабиноксиланов. Животные и птицы не продуцируют собственных ксиланаз, поэтому добавление этих ферментов в кормовые рационы, особенно на ранних стадиях развития организма животного, позволяет добиться существенных результатов [134,142,143]. Наряду с ксиланазными ферментными препаратами в качестве премикса при производстве комбикормов также используют препараты Р-глюканаз, пектиназ, о галактозидаз, амилаз, фитаз и ферментов литического действия [135,137,144].
