Содержание к диссертации
Список сокращенийГлава Литературный обзор
1.1 Свойства и классификация протеолитических ферментов
1.1.1 Сериновые протеиназы
1.1.2 Аспартильные протеиназы
1.1.3 Металлопротеиназы
1.1.4 Цистеиновые протеиназы
1.2 Влияние условий культивирования на секрецию протеаз
1.3 Грибы рода Colletotrichum , , 1.3.1 Антракноз, вызываемый представителями рода Colletotrichum
1.3.2 Микогербицидная активность некоторых видов рода Colletotrichum
1.4 Роль секретируемых протеаз патогенных грибов в инфекционном процессе
1.4.1 Участие секретируемых протеиназ патогенных грибов в инфекционном процессе у животных и человека
1.4.2 Участие секретируемых протеиназ патогенных грибов в инфекционном процессе у растений
1.5 Использование протеаз
1.6 Выделение протеаз
Глава Материалы и методы
Глава Результаты и обсуждение
3.1 Изучение роста колоний грибов Fusarium и gloeosporioides на твердых средах и в погруженной культуре
3.1.1 Изучение роста колоний Fusarium на твердых средах
3.1.1.1 Рост изолятов F.sporotrichioides на твердых средах
3.1.1.2 Рост изолятов F.heterosporum на твердых средах
3.1.1.3 Рост изолятов F.oxysporum на твердых средах
3.1.1.4 Рост изолятов F.culmorum на твердых средах
3.1.2 Изучение роста колоний gloeosporioides на твердых средах
3.1.3 Изучение роста колоний Fusarium и gloeosporioides при погруженном культивировании
3.2 Изучение секреции внеклеточной протеолитическои активности в погруженной культуре у изолятов Fusarium и gloeosporioides
3.3 Сравнение патогенности грибов рода Fusarium и уровня внеклеточной протеолитическои активности
3.4 Выделение, очистка и характеристика свойств наиболее представленных ферментов изученных грибов
3.4.1 Выделение протеиназы gloeosporioides из культуральной жидкости
3.4.2 Выделение ферментов F.oxysporum из культуральной жидкости
Выводы
Введение к работе
Актуальность темы. Протеолитические ферменты играют исключительно важную роль в регуляции различных биологических процессов на молекулярном, клеточном, тканевом и межорганном уровнях. В фундаментальных исследованиях они используются для изучения первичной структуры белков и пептидов, кинетики и специфичности ферментативных реакций, строения активных центров. В коммерческих целях применяются в легкой и пищевой промышленности, в медицине и фармакологии (Мосолов, 1971; Rao et al., 1998). Среди внеклеточных протеолитических ферментов микроорганизмов особое место занимают протеиназы, обладающие высокой фибринолитической и антикоагулянтной активностью, что предполагает их высокий терапевтический эффект при лечении тромбоэмболии (Батомункуева, Егоров, 2001; Peng et al., 2005). С участием грибных протеаз можно разрабатывать различные способы рециклизации отходов, оберегая окружающую среду. Из-за высокой ферментативной активности ферменты микроорганизмов предпочтительнее при разложении природных соединений (Мюллер, Лёффлер, 1995).
Возрастающий интерес к секретируемым протеазам грибов обусловлен также их участием в разнообразных формах патогенеза (St. Leger, 1995; Rhodes, 1995; Larcher et al., 1992). Ферменты могут участвовать в грибной инвазии, растворяя участки кутикулы насекомых, состоящей на 70% из белка (Ferron, 1978). Клинические исследования больных кератитом, вызываемым грибами, как Aspergillus fumigatus Fresen, Candida albicans (СР. Robin) Berkhout, Fusarium solani (Mart.) Sacc, Penicillium citreoviride Biourge, показали, что в роговице глаза, в тканях, сыворотке испытуемых увеличивается как количество грибного мицелия, так и количество металлопротеиназ ММР-8 и ММР-9 (Dong et al., 2005; Rohini et al., 2007). Следует также отметить работы по изучению роли секретируемых протеаз А. fumigatus в патогенезе аспергиллеза человека, в которых было показано, что штаммы, продуцирующие сериновую протеиназу субтилизинового типа, более патогенны для животных, чем непродуцирующие штаммы (Павлюкова и др., 1998). Однако функциональная роль протеиназ в этом процессе до конца, не выяснена. Предполагается, что протеазы могут участвовать в комплексе с другими ферментами в проникновении патогена внутрь растения-хозяина и обеспечивать его питание (Мосолов, Валуева, 2006), либо быть ответственными за регуляцию других ферментов, синтезируемых организмом.
Возможно, грибные протеазы непосредственно участвуют в патогенном процессе через взаимодействие со «сторожевым» белком или продуктом гена устойчивости (Biezen, Jones, 1999; Дьяков, 2005).
Цель работы: Сравнительное изучение физико-химичских, биохимических и функциональных свойств внеклеточных протеаз некоторых мицелиальных грибов Задачи:
1. Сравнение спектров внеклеточных протеаз на примере различающихся по патогенности мицелиальных грибов родов Fusarium Link и Colletotrichum Corda
2. Выделение и очистка секретируемых протеаз данных грибов
3. Характеристика наиболее представленных (основных) протеаз Fusarium' и Colletotrichum.
Научная новизна и практическая значимость. Проведена работа по подбору жидких сред с целью наибольшего выхода внеклеточной протеолитической активности ферментов у различных мицелиальных грибов. При погруженном культивировании видов Fusarium и Colletotrichum на средах с различными добавками показано, что сусло и казеин в большей степени индуцируют секрецию внеклеточных протеаз.
Впервые из культуральной жидкости гриба Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz & Sacc выделена сериновая протеиназа субгилизинового типа. Разработан метод получения данного фермента. В результате ряда последовательных стадий внеклеточная протеиназа gloeosporioides была очищена до гомогенного состояния, исследованы её физико-химические свойства, а также влияние белковых ингибиторов растительного и животного происхождения на очищенный препарат секретируемой протеиназы.
Впервые проведено сравнение уровня патогенности с внеклеточной протеолитической активностью у 15 изолятов Fusarium, принадлежащих к 4 видам. Показано, что у сильных фитопатогенов преобладает трипсиноподобная активность.Выделены и идентифицированы протеазы, секретируемые Fusarium oxysporum Schlecht. Показано, что они относятся к сериновым протеазам семейств субтилизина и химотрипсина. Были охарактеризованы некоторые их физико-химические свойства.
Полученные данные могут найти практическое применение в разработке новых методов защиты растений от фитопатогенов, для диагностики патогенных микроорганизмов и получения растений, трансформированных генами ингибиторов протеаз, с повышенной устойчивостью к патогенам.
