Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Полисахариды клеточной стенки 9
1.1. Микрофибриллярные полисахариды 10
1.2. Полисахариды матрикса
1.2.1. Гемицеллюлозы 12
1.2.2. Пектины 17
1.3. Р-Глюканы 19
ГЛАВА 2. Особенности биосинтеза ферментов trichoderma Reesei . 20
2.1. Влияние условий ферментации на эффективность биосинтеза ферментов Т. п reesei
2.2. Получение генетически измененных штаммов Т. reesei 23
ГЛАВА 3. Состав и свойства ферментов, продуциремых Т. Reesei ... 26
3.1. Современные представления о механизме каталитического действия , карбогидраз
3.2. Современные представления о классификации карбогидраз 30
3.3. Структурная организация карбогидраз 31
3.4. Ферментный комплекс Т. reesei
3.4.1. Целлюлазы Т. reesei 33
3.4.2. Гемицеллюлазы Т. reesei 39
ГЛАВА 4. Использование карбогидраз в различных биотехнологических процессах
4.1. Использование ферментов для отбеливания целлюлознобумажной пульпы... 46
4.2. Применение ферментов в текстильной промышленности
4.2.1. Биоотварка хлопчатобумажных тканей 47
4.2.2. Биодепигментация и биополировка хлопчатобумажных изделий 9
4.3. Использование ферментов в качестве кормовых добавок 49
П. Экспериментальная часть 53
ГЛАВА 5. Объекты исследования и методы экспериментов 53
5.1. Использованные вещества 53
5.1.1. Ферментные препараты 53
5.1.2. Субстраты и реактивы 54
5.1.3. Хроматографические носители 56
5.2. Методы 57
5.2.1. Аналитические методы
5.2.2. Выделение и очистка индивидуальных компонентов Т. reesei 57
5.2.3. Определение активностей ферментов 58
5.2.4. Определение рН- и температурного оптимумов действия ферментов... "О
5.2.5. Изучение рН- и термостабильности ферментов 60
5.2.6. Исчерпывающий гидролиз полимерных субстратов под действием ферментов... "1
5.2.7. Ограниченный протеолиз ферментов папаином 61
5.2.8. Определение адсорбционных характеристик ферментов 61
5.2.9. Анализ молекулярно-массового распределения продуктов гидролиза высокомолекулярных субстратов ферментами
5.2.10. Оценка способности ферментов к биоотварке суровой хлопчатобумажной ткани 5.2.11. Оценка способности ферментов к биодепигментации окрашенной индиго /- хлопковой ткани 5.2.12. Оценка способности ферментов к биополировке окрашенной хлопковой ткани 4
5.2.13. Оценка способности ферментов к биоотбеливанию целлюлозной пульпы "5
5.2.14. Вискозиметрический метод определения общей эндодеполимеразной sc активности пектиназ
5.2.15. Оценка "кормовой" ценности ферментов 66
III. Результаты и их обсуждение 68
ГЛАВА 6. Изучение компонентного состава ферментных комплексов на основе мутантных штаммов Т. Reesei . 68
6.1. Разработка экспресс-метода эффективного разделения ферментных ,„ комплексов Т. reesei на компоненты
6.2. Сравнительный анализ компонентного состава препаратов мутантных ,-штаммов Т. reesei
6.2.1. Генеалогия мутантов Т. reesei 72
6.2.2. Сравнение компонентного состава различных ферментных препаратов Т. reesei 73
6.2.3. Количественная оценка содержания ферментов в препаратах Т. reesei 88
6.2.4. Влияние условий ферментации на биосинтез ферментов Т. reesei 88
6.3. Оптимизация препаративного метода выделения целлюлаз и гемицеллюлаз Q1
Т. reesei
ГЛАВА 7. Физико-химические и биохимические свойства выделенных ферментов 99
7.1. Физико-химические и биохимические свойства целлюлаз Т. reesei 99
7.1.1. Биохимические характеристики и субстратная специфичность выделенных gg целлюлаз 7.1.2. рН- и температурные оптимумы активности ферментов, стабильность, і Q2
устойчивость к термошоку 7.1.3. Адсорбционная способность ферментов наМКЦ 109
7.1.4. Ограниченный протеолиз ферментов папаином 110
7.2. Физико-химические и биохимические свойства гемицеллюлаз Т. reesei 112
V
7.2.1. Биохимические характеристики и субстратная специфичность выделенных 119 гемицеллюлаз
7.2.2. рН- и температурные оптимумы активности ферментов, стабильность, 11 /-устойчивость к термошоку
7.2.3. Адсорбционная способность ферментов наМКЦ 122
7.2.4. Исчерпывающий гидролиз ксиланов ферментами 122
7.3. Полигалактуроназа и экзо-р-1,3-глюкозидаза Т. reesei 124
ГЛАВА 8. Выявление ключевых "текстильных" ферментов Т. Reesei 130
8.1. Изучение способности ферментов к биодепигментации джинсовой ткани 130
8.2. Изучение способности ферментов к биоотварке хлопчатобумажной ткани 1 8.2.1. Оптимизация метода оценки способности ферментов к биоотварке і от хлопчатобумажной ткани
8.2.2. Сравнение способности ферментных препаратов к биоотварке 137 хлопчатобумажной ткани
8.2.3. Разработка микрометода оценки способности ферментов к биоотварке і43 хлопчатобумажной ткани
8.2.4. Сравнение способности индивидуальных ферментов к биоотварке і л с хлопчатобумажной ткани и выявление ключевых ферментов 8.3. Изучение способности ферментов к биополировке хлопчатобумажной ткани 147
8.3.1. Разработка миниметода оценки способности ферментов к биополировке 147
8.3.2. Сравнение способности ферментных препаратов к биополировке 153
8.3.3. Сравнение способности индивидуальных ферментов к биополировке и і«
выявление ключевых ферментов
ГЛАВА 9. Выявление ключевых ферментов т. reesei ответственных за биоотбеливание целлюлозной пульпы 157
9.1. Сравнение способности ферментных препаратов к биоотбеливанию - -7 целлюлозной пульпы 9.2. Сравнение способности индивидуальных ферментов к биоотбеливанию - целлюлозной пульпы и выявление ключевых ферментов
ГЛАВА 10. Сравнительный анализ способности ферментов к увеличению питательной ценности кормов животных и птиц... 164
10.1. Разработка in vitro тестов оценки способности ферментов к увеличению м
питательной ценности кормов
10.1.1. Тест на основе анализа образования восстанавливающих Сахаров в ходе гидролиза природных кормов
10.1.2. Применение вискозиметрического метода при изучении падения вязкости экстракта ржи под действием ферментов
10.2. In vitro "кормовые" испытания препаратов и индивидуальных ферментов на fi7
различных типах кормов
10.2.1. Результаты теста с использованием анализа ВС 167
10.2.2. Исследование изменения вязкости экстракта ржи под действием ферментных j 73 препаратов и индивидуальных ферментов
10.3. Влияние растительных ингибиторов на ксиланазы Т. reesei 182
Выводы 186
Список литературы
- Полисахариды матрикса
- Получение генетически измененных штаммов Т. reesei
- Структурная организация карбогидраз
- Биодепигментация и биополировка хлопчатобумажных изделий
Введение к работе
Актуальность проблемы. История развития фундаментальных знаний о ферментах неразрывно взаимосвязана с разработкой и оптимизацией способов практического использования этих уникальных биокатализаторов. С одной стороны, открытие высокоселективных реакций, катализируемых специфическими ферментами, приводит к появлению новых промышленных процессов. С другой - возрастающие потребности современных отраслей промышленности, а также необходимость внедрения экологически безопасных производственных схем, способствуют целенаправленному поиску новых ферментов. В течение последних 15 лет мировое производство промышленных ферментов выросло более, чем в два раза, а объем их продаж превысил 1 млрд. долларов. Среди используемых в современной биотехнологии ферментов целлюлазы и гемицеллюлазы, продуцируемые микроскопическими грибами, отличаются необычайно широким диапазоном применения.
Можно выделить следующие основные области применения целлюлаз и гемицеллюлаз:
глубокая биоконверсия возобновляемого растительного сырья, позволяющая, в
конечном итоге, получить топливо, кормовые и пищевые продукты;
пищевая промышленность - такие отрасли, как виноделие, пивоварение,
производство осветленных соков;
биополировка и "биоотварка" (биоскоринг) текстильных изделий, приводящие к
умягчению их поверхности, а также увеличению их смачиваемости;
ферментативная "отварка" (биодепигментация) хлопчатобумажных и льняных
изделий, сопровождающаяся изменением их цветности;
биоотбеливание целлюлозной массы, позволяющее уменьшить вредные выбросы
хлорных производных разложения лигнина и сократить расход хлора;
использование ферментов в качестве добавок к кормам животных и птиц. Среди микроскопических грибов - продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз, Trichoderma reesei занимает ведущую роль. Это обусловлено высоким уровнем развития секреторной способности данного продуцента, а также разнообразием продуцируемых ферментов различной субстратной специфичности. Несмотря на указанные достоинства, масштабы использования ферментных комплексов, продуцируемых Т. reesei, недостаточны и во многом не соответствуют их высокому потенциалу. В значительной степени это объясняется двумя причинами: во-первых, недостаточны фундаментальные знания о протеоме секретируемых в различных условиях ферментных комплексов Т. reesei. Во-вторых, применение целлюлаз и гемицеллюлаз в разных биотехнологических процессах часто связано с диаметрально отличным типом воздействия на субстрат и предъявляет различные требования к свойствам компонентов, определяющих действие комплекса в целом, поэтому каждая область применения требует создания ферментных комплексов с определенным компонентным составом. В свяэя-тгanММ ^Фйга^^ВДЦстлизЗДия
. Р 'библиотека |
любого из вышеперечисленных ферментативных процессов с участием целлюлаз и гемицеллюлаз невозможна без выявления компонентов, играющих ключевую роль в конкретном биотехнологическом процессе, детального изучения физико-химических и биохимических свойств данных компонентов, а также оценки их вклада в действие ферментного комплекса в целом.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось исследование компонентного состава новых ферментных комплексов на основе мутантных штаммов Т. reesei, сравнение в лабораторных условиях их эффективности при практическом применении в различных биотехнологических процессах, выявление ферментов, играющих ключевую роль в данных процессах, изучение их физико-химических и биохимических свойств, а также определение их вклада в эффективность действия ферментного комплекса в целом. Среди широкого спектра различных промышленно значимых процессов с участием ферментных комплексов Т. reesei в данной работе для детального изучения были выбраны следующие: биоденигментация, биоотварка и биополировка хлопчатобумажных тканей, биоотбеливание целлюлозной пульпы, использование ферментов в качестве кормовых добавок. Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:
Разработать эффективный и экспрессный метод сравнения компонентного состава ферментных комплексов Т. reesei.
Исследовать с помощью данного метода компонентный состав современных ферментных препаратов на основе мутантных штаммов Т. reesei, изучить влияние условий ферментации на компонентный состав получаемых ферментных препаратов.
Разработать и оптимизировать способ препаративного выделения и очистки индивидуальных компонентов выбранных ферментных комплексов.
Изучить физико-химические и биохимические свойства выделенных ферментов.
Разработать методики оценки в лабораторных условиях эффективности действия ферментов и препаратов при практическом применении их в процессах биообработки текстильных материалов, биоотбеливания целлюлознобумажной пульпы, а также при использовании ферментов в качестве кормовых добавок.
На основе предложенных методик провести исследование препаратов Т. reesei и их индивидуальных компонентов с целью сравнения эффективности их действия по указанным направлениям.
На основе данных о компонентном составе оценить вклад индивидуальных компонентов в эффективность действия ферментного комплекса в целом. Определить взаимосвязь между компонентным составом и высокой эффективностью отдельных препаратов в рассмотренных биотехнологических процессах.
Научная новизна. Исследован компонентный состав ряда лабораторных и промышленных ферментных препаратов на основе новых мутантных штаммов Т. reesei. Установлено наличие модифицированных форм эндоглюканазы I (mod. EG I), эндоглюканазы II (mod. EG II), целлобиогидролазы I (mod. CBH I), не содержащих целлюлозосвязывающий домен (ЦСД), в ферментных комплексах, продуцируемых некоторыми мутантными штаммами Т. reesei. Изучено влияние условий ферментации на компонентный состав ферментных комплексов Т. reesei. Показано, что препараты Т. reesei по особенностям ферментационного процесса могут быть разбиты на две группы: "целлюлазные" и "ксиланазные". Установлено существенное различие в содержании отдельных ферментов в "целлюлазных" и "ксиланазных" препаратах. Изучены биохимические и физико-химические свойства (субстратная специфичность, температурный и рН-оптимумы действия, стабильность в различных условиях, адсорбционая способность, кинетика исчерпывающего гидролиза полимерных субстратов) индивидуальных очищенных ферментов: EG I, EG II, EG III, CBH I, CBH II, mod. EG I, mod. EG II, mod. CBH I, ксиланазы I (XYL I), ксиланазы II (XYL II), р-ксилозидазы ф-XYL), a-L-арабинофуранозидазы (a-L-Ага), а также двух наименее изученных ферментов Т. reesei - полигалактуроназы (PGU) и экзо-р-1,3-глюкозидазы (exo-p-l,3-Glu). Обнаружен синергизм при совместном действии на арабиноксилан эндоксиланаз, с одной стороны, и a-L-Ага и P-XYL с другой, а также антагонизм при совместном действии на глюкуроноксилан некоторых эндоксиланаз и a-L-Ara.
Практическая значимость работы. Разработан эффективный и экспрессный метод определения компонентного состава внеклеточных ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Т. reesei. Исследованы активности по различным субстратам и состав ферментных препаратов, полученных на основе широкого круга новых штаммов Т. reesei, включая современные промышленные препараты ведущих мировых производителей ферментов. Предложена схема препаративного разделения ферментных комплексов, позволяющая выделить все основные целлюлазы и гемицеллюлазы, а также exo-p-l,3-Glu и PGU Т. reesei. Разработаны лабораторные методы оценки способности ферментов к биоотварке и биоополировке хлопчатобумажной ткани, а также in vitro "кормовые" тесты, позволяющие сравнивать способность ферментов к увеличению питательной ценности кормов. Проведено сравнение эффективности очищенных ферментов Т. reesei в процессах ферментативной обработки текстильных изделий (биодепигментации джинсовой ткани, биоотварки суровой хлопчатобумажной ткани, биополировки окрашенной хлопчатобумажной ткани), в процессах биоотбеливания целлюлознобумажной пульпы, а также при действии ферментов на корма. Оценен вклад индивидуальных ферментов в эффективность действия ряда промышленных ферментных препаратов при их применении в вышеуказанных процессах. В результате проведения in vitro "кормовых" тестов выявлено, что эффективность ферментных препаратов при использовании их в качестве кормовых добавок определяется двумя факторами. С одной
стороны, ферменты, входящие в состав данных препаратов, должны обладать способностью к существенному гидролизу некрахмальных полисахаридов, с другой - быть устойчивыми к действию ингибиторов, содержащихся в кормовых злаках. Даны рекомендации по применению конкретных ферментных препаратов на основе Т. reesei в кормовых рационах, содержащих в качестве основных питательных компонентов пшеницу, пшеничные отруби, ячмень, рожь.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на следующих конференциях: 219 совещании Американского Химического Общества (Сан-Франциско, США, 2000), школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), международных конференциях "Биокатализ-1998" (Пущино, 1998), "Биокатапиз-2000" (Москва, 2000) и "Биокатализ-2002" (Москва, 2002), втором международном симпозиуме "Биотехнология в текстильной промышленности" (Афины, США, 2002), втором Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и развитие" (Москва, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), экспериментальной части (1 глава), изложения результатов и их обсуждения (5 глав), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 191 ссылку. Работа изложена на 201 странице машинописного текста, содержит 80 рисунков и 16 таблиц.
Полисахариды матрикса
Продуктивность природных штаммов микроорганизмов в большинстве случаев недостаточно высока для их использования в крупномасштабных биотехнологических процессах. Существует два подхода для увеличения их продуктивности: генетические изменения штаммов, направленные на увеличение секреции белков, а также подбор оптимальных для синтеза интересующих ферментов условий ферментации и состава питательной среды [21,23]. Остановимся подробно на этих подходах применительно к Т. reesei. В данной главе мы не будем подробно рассматривать теоретические аспекты способов ферментации микроорганизмов. Основы проведения твердофазной ферментации подробно изложены в работах [21-33], глубинной ферментации - в работах [21-24,34-39]. 2.1. Влияние условий ферментации на эффективность биосинтеза ферментов Т. reesei.
Основными факторами ферментационного процесса, влияющими на эффективность биосинтеза ферментов Т. reesei (а также и других микробных продуцентов) являются: тип ферментации, состав питательной среды и условия ферментационного процесса (температура и рН ферментации, уровень аэрации и др) Тип ферментационного процесса. Для ферментации Т. reesei можно использовать как твердофазную ферментацию, так и различные типы глубинной ферментации. Несмотря на то, что условия проведения твердофазной ферментации максимально приближенны к естественным, в которых полностью реализуется биопотенциал микроорганизма, в промышленности ферментацию Т. reesei, а также большинства других микроорганизмов, проводят глубинным способом. Это обусловлено тем, что в условиях промышленного производства трудно контролировать параметры твердофазной ферментации, такие как рН, температура, уровень аэрации и влажность. Кроме того, проведение твердофазной ферментации по сравнению с глубинной занимает больше времени [24-26,40-43].
Сравнение различных типов глубинной ферментации Т. reesei между собой показывает, что наиболее высокая производительность достигается при осуществлении ферментации с подпиткой субстратом. Так, например, глубинная ферментация с подпиткой субстратом штамма Т. reesei RUT-C30 позволяет достичь производительности ферментера 130 едхл хч"1 целлюлазной активности [40,41].
Состав питательной среды. Т. reesei секретирует целлюлазы при выращивании на средах, содержащих производные глюкозы в качестве источника углерода, а также кальций и следовые количества других элементов. Кальций и следовые количества железа, марганца, цинка и кобальта требуются для синтеза ферментов, но не для роста культуры [22]. Наиболее часто для ферментации Т. reesei используются питательные среды, в основе которых лежит среда с целлюлозой, разработанная в лаборатории Натика (табл. 2).
Выход целлюлаз с увеличением концентрации целлюлозы в питательной среде возрастает, однако содержание ее при использовании глубинных способов ферментации не может быть поднято выше 10% из-за возникающих вследствие нерастворимости субстрата проблем с перемешиванием среды. Выход ферментов при использовании очищенной целлюлозы выше, чем при использовании природных целлюлозных материалов, в то же время предобработка природных материалов (например, щелочью или паровым взрывом) позволяет свести к минимуму эту разницу.
Целлюлоза является одновременно и источником углерода, и индуктором синтеза целлюлаз (и некоторых других ферментов) Т. reesei. Помимо целлюлозы в качестве индукторов синтеза целлюлаз используют лактозу, целлобиозу, софорозу, в качестве индукторов синтеза ксиланаз — ксиланы и ксилозу. На практике, в промышленных процессах из перечисленных индукторов наиболее часто используют целлюлозу, лактозу, ксилан и ксилозу (ввиду их доступности). При этом использование лактозы и ксилозы целесообразно только для мутантов, устойчивых к катаболитной репрессии [22].
Для удовлетворения потребности штаммов Т. reesei в азоте для синтеза ферментов, в принципе, достаточно использования иона аммония, тем не менее добавление пептона или дрожжевого экстракта играет положительную роль[40,44].
Синтез ферментов Т. reesei (а также других грибных продуцентов) увеличивается при добавлении в среду неионогенных ПАВ, таких как Твин 80. Предполагается, что ПАВ улучшает проницаемость клеточных мембран для ферментов [22], хотя механизм данного эффекта до конца не ясен.
Температура ферментации. Т. reesei относится к мезофильным микроорганизмам, соответственно оптимальная температура роста данного гриба составляет около 35С. В то же время данная температура не всегда является оптимальной для синтеза ферментов. Так, у некоторых штаммов Т. reesei наилучший выход ферментов отмечен при температуре ферментации 25С. У других штаммов Т. reesei оптимум синтеза целлюлаз наблюдается при следующем температурном режиме: 0-2 суток 31 С (фаза наработки клеток биомассы), далее ферментация при 28 С (фаза биосинтеза ферментов). Оптимальная температура ферментации определяется для каждого штамма индивидуально [45]. рН ферментации. Рост микробных клеток сильно зависит от рН питательной среды, на которой культивируется продуцент, во многих случаях рН-оптимум роста культуры отличается от рН-оптимума синтеза ферментов. Особенно сильно влияние рН ферментации проявляется в случае синтеза ферментов Т. reesei. В ходе ферментации на среде Натика, содержащей 0,75% целлюлозы, по мере поглощения иона аммония рН падает от первоначального значения 5,7 до 2,7. При этом значении рН рост клеток замедляется, и, кроме того, возможна инактивация синтезируемых ферментов. При концентрациях целлюлозы выше 1% падение рН в ходе ферментации становится более значительным, приводя к заметной инактивации ферментов. Проведение ферментации с контролем рН таким образом, чтобы избежать падения рН ниже 3, позволяет использовать более высокие концентрации целлюлозы и, следовательно, получать более высокие выходы ферментов. Однако, если поддерживать значение рН равное 3 в ходе ферментации, наблюдается низкий выход ферментов из-за медленного роста клеток гриба. Увеличение рН приводит к повышению роста клеток, но замедлению синтеза ферментов. Данная особенность поведения Т. reesei при ферментации до сих пор до конца не объяснена. Оптимум роста клеток Т. reesei приходится на рН 4, оптимум синтеза целлюлаз - на рН 3 [40,46,47]. Поэтому ферментацию Т. reesei часто проводят следующим образом: наработку клеток биомассы ведут при более высоких значениях рН - от 3,75 до 6 (наиболее часто при рН 4), для биосинтеза ферментов рН уменьшают до 3,5-3. Использование подобного двухстадийного режима ферментации позволяет увеличить финальный выход ферментов [45].
Природные (дикие) штаммы микроорганизмов вырабатывают ограниченное количество ферментов - ровно столько, сколько нужно, чтобы обеспечить пищевые потребности продуцента. Уровень секреции ферментов природными штаммами в большинстве случаев слишком низок, для того, чтобы использовать их в крупномасштабных биотехнологических процессах. Поэтому природные штаммы, подвергают генетическим изменениям, направленным на увеличение продукции интересующих ферментов. Существует два основных способа улучшения природных штаммов продуцентов ферментов: ненаправленный (классический) мутагенез и генетическая инженерия [48,49].
Ненаправленный мутагенез. Ненаправленный мутагенез - классический способ увеличения эффективности синтеза ферментов природными микроорганизмами, до сих пор является одним из основных способов улучшения штаммов. Для получения продуцента с высокой продуктивностью по заданному ферменту (или ферментам) его подвергают мутагенезу. Для этого споры микроорганизмов подвергают воздействию мощных мутагенов: химических (нитрозогуанидин, нитрозометилмочевина) или физических (УФ-облучение, у-облучение, облучение ускоренным пучком электронов). В результате такого воздействия выживает очень небольшая часть клеток. Эти клетки имеют нарушения в генетическом аппарате, в них могут быть ослаблены регуляторные механизмы, и поэтому они могут быть основой для получения новых высокопродуктивных штаммов [21].
Получение генетически измененных штаммов Т. reesei
Целлобиогидролаза II (СВН II). Целлобиогидролаза II составляет приблизительно 20% от общего содержания белков, секретируемых Т. reesei. СВН II гидролизует микрокристаллическую целлюлозу так же хорошо, как и аморфную, но имеет низкую активность по отношению к КМЦ [100,101]. В отличие от СВН I, СВН II гидролизует р-глюкан ячменя [90]. СВН II действует на р-1,4-гликозидные связи с невосстанавливающих концов целлюлозной цепи, образуя главным образом целлобиозу. В отличие от СВН I, СВН II является инвертирующим ферментом, который изменяет р-конфигурацию аномерного атома углерода на а- во время гидролиза [98]. Гидролиз целлоолигосахаридов под действием СВН II протекает с заметной скоростью только в случае тетра- и более протяженных целлоолигосахаридов. Фермент также гидролизует хромогенные целлоолигосахариды, но разрушая при этом гомозидную (глюкоза-глюкоза) связь, в то время как СВН I и эндоглюканаза I способны разрушать гетерозидную (глюкоза-хромогенная группа) связь [97]. По сравнению с СВН I, СВН II выступает как более упорядоченная экзоглюканаза [101], что потверждается наблюдаемым изменением молекулярно-массового распределения при анализе продуктов гидролиза растворимых и нерастворимых субстратов.
Трехмерная структура каталитического домена СВН II хорошо изучена [68]. Она представляет собой т. н. центральную а/р "бочкообразную" структуру, схожую, но не идентичную той, которую имеет триозофосфатизомераза. Каталитический домен СВН II состоит из пяти а-спиралей и семи р-листов. Активный центр СВН II расположен у С - конца р-листов, и, подобно СВН I, имеет форму туннеля, образованного белковыми петлями протяженностью 20 А, в котором содержатся адсорбционные центры связывания субстрата [68]. Прочие свойства СВН II отражены в таблице 3.
Эндоглюканаза I (EG I). Эндоглюканаза I является ферментом, который обладает высокой активностью по отношению к растворимым производным целлюлозы и имеет низкую активность по отношению к кристаллической целлюлозе. EG I гидролизует внутренние Р-1,4-гликозидные связи полимерной целлюлозной цепи. Подобно СВН I, эндоглюканаза I является ферментом, который сохраняет конфигурацию аномерного атома углерода [102]. Он также катализирует реакции трансгликозилирования, что потверждается синтезом более высокомолекулярных продуктов, чем исходный субстрат. При действии на хромогенные 4-метилумбеллиферильные производные целлоолигосахаридов EG I расщепляет гетерозидную связь, при этом от субстрата отщепляется флуоресцентное производное фенола, аналогично СВН I. Однако в отличие от СВН I, данная реакция не ингибируется целлобиозой, и это может быть использовано для отличия EG I от СВН I [97,103]. EG І гидролизует КМЦ, Р-глюкан ячменя, глюкоманнан, авицел и предобработанную фосфорной кислотой целлюлозу, ксилан и ксилоглюкан, но не гидролизует целлобиозу [91,102,104]. Основными низкомолекулярными продуктами гидролиза КМЦ, авицела и предобработанной фосфорной кислотой целлюлозы под действием EG I являются глюкоза и целлобиоза [92]. EG I является единственной эндоглюканазой Т. reesei, способной эффективно гидролизовать целлотриозу [92], фермент также гидролизует целлотетраозу и целлопентаозу.
Структура каталитического домена EG I была определена на основе рентгеноструктурных данных при разрешении 3,6 А (невысокое разрешение, для сравнения структура каталитического домена СВН I Т. reesei была определена при разрешении 1,8 А) с использованием известных структур гомологичных по аминокислотному составу ферментов - СВН I Т. reesei и EG I Humicola insolens [67]. В отличие от СВН I, активный центр EG I представляет собой "расщелину", а не тоннель. Гидролиз субстратов протекает с участием двух остатков глутаминовой кислоты, расположенных по разные стороны "расщелины", по механизму двухстадийного замещения [67]. Прочие свойства EG I отражены в таблице 3.
Эндоглюканаза II (EG II). Эндоглюканаза II является специфической эндоглюканазой, атакующей нерастворимую целлюлозу. Предполагается, что N-концевой домен EG II схож с аналогичным доменом СВН II [87,105]. EG II обладает высокой активностью по отношению к КМЦ, р-глюкану ячменя, глюкоманнану и хромогенным производным целлоолигосахаридов, но не гидролизует целлобиозиды, лактозиды и ксилоглюкан. Предполагается, что EG II содержит протяженный субстрат-связывающий сайт с пятью центрами связывания [116]. В пользу данного предположения указывают следующие факты: гидролиз радиоактивно меченной целлобиозы под действием EG II с образованием радиоактивной глюкозы протекает гораздо медленнее в отсутствие целлотриозы, в тоже время гидролиз целлотриозы под действием EG II в заметной мере протекает лишь в присутствии радиоактивно меченной целлобиозы, причем дает радиоактивную глюкозу. Это указывает на сложный характер реакции разложения субстрата. Гидролиз целлоолигосахаридов под действием EG II протекает с сохранением аномерной конфигурации продуктов [106,107], при этом активность практически отсутствует в случае целлотриозы и максимальна для целлопентаозы. Основными низкомолекулярными продуктами гидролиза КМЦ, авицела и предобработанной фосфорной кислотой целлюлозы под действием EG II являются глюкоза, целлобиоза и целлотриоза [92]. Прочие свойства EG II отражены в таблице 3.
Эндоглюканаза III (EG III). Эндоглюканаза III является минорной низкомолекулярной эндоглюканазой Т. reesei. Содержание фермента в комплексе составляет не более 1-2%. В отличие от других эндоглюканаз и целлобиогидролаз Т. reesei EG III не содержит целлюлозосвязывающего домена. Фермент хорошо гидролизует КМЦ, ГЭЦ, р-глюкан ячменя, ксилоглюкан, но практически не гидролизует кристаллическую целлюлозу. Фермент гидролизует хлорнитрофенил-производные Сахаров, причем активность возрастает с увеличением числа глюкозных звеньев в цепи: она практически отсутствует в случае хлорнитрофенил-глюкозида и максимальна для хлорнитрофенил-целлотриозида [91,92]. Активность EG III по отношению к целлотетраозе и целлопентаозе существенно ниже по сравнению с EG I и EG П. Гидролиз протекает с сохранением аномерной конфигурации продуктов. Основными низкомолекулярными продуктами гидролиза КМЦ, авицела и предобработанной фосфорной кислотой целлюлозы под действием EG III (также, как и в случае EG II) являются глюкоза, целлобиоза и целлотриоза [92].
Структура каталитического домена EG III аналогична структуре EG I и представляет собой "расщелину", гидролиз субстратов протекает с участием двух остатков глутаминовой кислоты, расположенных по разные стороны "расщелины", по механизму двухстадийного замещения [74]. Прочие свойства EG III отражены в таблице 3.
Эндоглюканаза IV (EG IV ). Данная эндоглюканаза на сегодняшний день является наименее изученным ферментом целлюлазного комплекса Т. reesei. Фермент обладает характерным для других эндоглюканаз комплекса набором целлюлазных активностей (гидролизует КМЦ, ГЭЦ, Р-глюкан ячменя, авицел, предобработанную фосфорной кислотой целлюлозу, целлотетраозу и целлопентаозу), однако все указанные активности EG IV на 4 десятичных порядка меньше, чем, например, у EG I [55]. В связи с этим не ясно, для чего данный фермент необходим грибу, глубокий гидролиз целлюлозы вполне осуществим и без EG IV. Фермент относится к 61 - одной из наименее изученных семей глюкозид гидролаз, обладает целлюлозосвязывающим доменом [55,71]. Прочие свойства EG IV отражены в таблице 3.
Эндоглюканаза V (EG V ). Эндоглюканаза V является низкомолекулярной эндоглюканазой Т. reesei. Фермент гидролизует КМЦ, ГЭЦ, Р-глюкан ячменя, авицел и предобработанную фосфорной кислотой целлюлозу, но не гидролизует ксилан, 4-метилумбеллиферил-Р-В-целлобиозид или лактозид. EG V не гидролизует целлотриозу, целлотетраозу и целлопентаозу [90,102]. Гидролиз КМЦ, авицела и предобработанной фосфорной кислотой целлюлозы под действием EG V резко отличается от гидролиза под действием остальных эндоглюканаз комплекса. Так, максимальная глубина гидролиза данных субстратов под действием EG V не превышает 1%, основным низкомолекулярным продуктом при этом является целлотетраоза, также в продуктах гидролиза содержатся целлотриоза и целлопентаоза [92]. EG IV (в отличие от EG I, EG II и EG III) является инвертирующим ферментом, который изменяет Р-конфигурацию аномерного атома углерода на а- во время гидролиза [71]. Еще одним отличием EG V от других эндоглюканаз является более высокая активность по отношению к глюкоманнану, чем р-глюкану ячменя [92]. Прочие свойства EG V отражены в таблице 3.
Структурная организация карбогидраз
Т. reesei продуцирует широкий набор гемицеллюлаз, необходимый для глубокого гидролиза практически любых видов гемицеллюлоз, встречающихся в природе. В то же время следует отметить, что доминирующими ферментами комплексов Т. reesei являются целлюлазы. Гемицеллюлазный комплекс Т. reesei, являясь значительно менее изученным по сравнению с целлюлазным, интенсивно исследуется в настоящее время. В его состав входят две эндо-1,4-Р-Б-ксиланазы (КФ 3.2.1.8), 1,4-р-0-ксилан-ксилогидролаза (р-ксилозидаза, КФ 3.2.1.37), cc-L-арабинофуранозидаза (КФ 3.2.1.55), ацетилксилан эстераза (КФ 3.1.1.72), а-глюкуронидаза (КФ 3.2.1.139), эндо-1,4-р-0-маннаназа (КФ 3.2.1.78), 1,2-a-D-маннозидаза (КФ 3.2.1.113), три a-галактозид галактогидролазы (а-галактозидазы, КФ 3.2.1.22) [56, 76]. Ниже будут рассмотрены основные свойства известных на данный момент гемицеллюлаз Т. reesei.
Ксиланаза I и ксиланаза II (XYL I и XYL II). Ксиланаза I и ксиланаза II являются частью ксиланолитической системы Т. reesei. Оба фермента относятся к эндодеполимеризующим ксиланазам одного семейства, поэтому уместно будет провести совместную сравнительную характеристику их свойств. Регуляция экспрессии генов данных ксиланаз осуществляется различным образом. Так, экспрессия гена XYL I контролируется посредством двух механизмов: индукции и катаболитной репрессии, экспрессия гена XYL II зависит только от присутствия индуктора. Индукторами синтеза XYL II являются ксилан, ксилобиоза, софороза, индуктором синтеза XYL I является только ксилоза [111]. (Следует отметить, что у новых мутантных штаммов регуляция может быть отличной от приведенной здесь).
Оба фермента хорошо гидролизуют основную цепь различных природных ксиланов, при этом более эффективно разрушаются более разветвленные и, следовательно, более растворимые типы ксиланов [109]. Гидролиз незамещенного ксилана под действием обеих ксиланаз протекает одинаково, с образованием олигомеров от ксилотриозы до ксилогептаозы в качестве продуктов. Гидролиз деацетилированного глюкуроноксилана протекает более эффективно в случае XYL И, напротив, ацетилированный глюкуроноксилан более эффективно разрушается в случае XYL I [109,110]. Состав продуктов гидролиза деацетилированного глюкуроноксилана под действием ксиланаз несколько отличается. Так, основными продуктами гидролиза обоих ферментов являются ксилотриоза и олигомеры с степенью полимеризации от 2 до 5, также присутствует ксилоза и ксилобиоза. XYL II при этом образует менее замещенные олигомеры, чем XYL I. По данным [109] ни одна из ксиланаз не гидролизует ксилотриозу, ксилопентаозу или ксилогексаозу, но оба фермента способны незначительно гидролизовать ксилотетраозу и ксилогептаозу. рН-оптимум действия ферментов заметно различается - слабокислый в случае XYL I и близкий к нейтральному в случае XYL И. XYL II при определенных условиях способна проявлять трансгликозилирующую способность [ПО]. Прочие свойства XYLI и XYL II отражены в таблице 3. Р-Ксилозидаза (P-XYL). Р-Ксилозидаза является частью ксиланолитической системы Т. reesei. P-XYL является ключевым ферментом комплекса, гидролизующим ксилобиозу до ксилозы [112]. Фермент способен гидролизовать р 1,4-ксилоолигосахариды (со степенью полимеризации 2-7), при этом скорость гидролиза возрастает с увеличением длины цепи. P-XYL гидролизует неразветвленный ксилан бука и 4-О-метилглюкуроноксилан, образуя ксилозу в качестве единственного продукта. Фермент также обладает oc-L арабинофуранозидазной активностью, измеренной по отношению к л-нитрофенил ct-L-арабинофуранозиду. p-XYL гидролизует Р-1,4-замещенные ксилоолигосахариды предпочтительнее Р-1,3-замещенных и не гидролизует Р-1,2-замещенные ксилоолигосахариды. По аналогии с р-глюкозидазами комплекса р XYL обладает трансферазной активностью, а также ингибируется глюконолактоном [73,121]. Прочие свойства P-XYL отражены в таблице 3.
cc-L-Арабинофуранозидаза (a-L-Ara). a-L-Арабинофуранозидаза является частью ксиланолитической системы Т. reesei. a-L-Ara гидролизует концевые невосстанавливающие a-L-арабинофуранозидазные группы в a-L-арабинофуранозидах, арабинанах, арабиноксиланах и арабиногалактанах [56]. Фермент гидролизует арабинан свеклы и л-нитрофенил-а -арабинофуранозид с образованием арабинозы. Гидролиз различных типов арабиноксиланов под действием a-L-Ara приводит к отщеплению до 50% арабинозных групп, основная цепь, образованная остатками ксилозы, остается при этом нетронутой. Ксилоолигосахариды, замещенные арабинозой, являются лучшим, чем арабиноксиланы, субстратом для a-L-Ara, в пользу этого факта свидетельствует существенное увеличение выхода арабинозы при гидролизе ct-L-Ara арабиноксиланов в присутствии ксиланаз Т. reesei [56]. Совместное действие a-L-Ага и ксиланаз T.reesei приводит также к увеличению выхода ксилозы и ксилобиозы, это свидетельствует о синергизме между ct-L-Ara и ксиланазами Т. reesei при гидролизе арабиноксиланов [56,62]. Прочие свойства a-L-Ara отражены в таблице 3.
Ацетилксилан эстераза (АХЕ). Ацетилксилан эстераза является частью ксиланолитической системы Т. reesei. АХЕ Т. reesei является специфической эстеразой, деацетилирующей боковые цепи ацетилированных ксиланов и ксилоолигосахаридов [79]. Примечательно, что каталитический домен данного фермента не обнаруживает сходства по аминокислотному составу с другими известными ацетилксиланэстеразами и имеет сходство (особенно в области активного сайта) с грибными кутиназами, являющимися сериновыми эстеразами. АХЕ обладает целлюлозосвязывающим доменом (С-конец), его удаление приводит к уменьшению способности фермента адсорбцироваться на целлюлозе, однако активность по отношению к ацетилированному ксилану при этом остается неизменной [71,79]. Прочие свойства АХЕ отражены в таблице 3. сс-Глюкуронидаза (a-GLUR). a-Глюкуронидаза является частью ксиланолитической системы Т. reesei. Фермент отщепляет 4-О-метилглюкуроновую кислоту от глюкуроноксиланов [71]. Прочие свойства a-GLUR отражены в таблице 3.
Р-Маннаназа (P-MAN). р-Маннаназа является эндодеполимеразой, участвующей в деградации глюкоманнанов, ассоциированных с целлюлозой в клеточных стенках растений. Фермент расщепляет Р-1,4-связи D-маннозных производных, образованных маннозой и глюкозой. Маннозные производные при этом могут быть замещены галактозой [113,114]. Типичными полисахаридами, гидролизуемыми р-MAN, являются глюкоманнаны и галактоманнаны, присутствующие в эндосперме многих растений в качестве запасных полисахаридов, а также ацетилированныи галактоглюкоманнан, присутствующий в древесине мягких пород деревьев. Фермент гидролизует маннопентаозу. Низкомолекулярными продуктами глубокого гидролиза Р-MAN галактоглюкоманнана сосны являются дисахарид и трисахарид [114]. Основной дисахарид при этом представляет собой маннобиозу, также присутствует небольшое количество 4-0-Р-Б-глюкопиранозил-0-маннопиранозы (GlcMan). Основные трисахариды представляют собой 4-0-P-D маннопиранозил-[6-0-а-галактопиранозил]-0-маннопиранозу (Gal Мапг) и 4-0-Р-0-глюкопиранозил-4-0-р-Б-глюкопиранозил-В- маннопиранозу (Glc2Man). Также в продуктах гидролиза содержится некоторое количество маннотриозы, 4-O-p-D-глюкопиранозил-4-0-р-В-маннопиранозил-0- маннопиранозы (GlcMan2) и 4-0-P-D-глюкопиранозил-[6-0-а-галактопиранозил]-В-маннопиранозы (Gal GlcMan) [114]. Примечательно, что фермент содержит целлюлозосвязывающий домен (С-конец), который связывается с целлюлозой, но не с маннаном [ИЗ]. Прочность связывания P-MAN с целлюлозой сравнима с EG I. Удаление целлюлозосвязывающего домена р-маннаназы не изменяет реакционную способность по отношению к маннанам, однако скорость гидролиза маннан/целлюлозного комплекса резко уменьшается по сравнению с исходным ферментом [113,114]. Прочие свойства P-MAN отражены в таблице 3.
Биодепигментация и биополировка хлопчатобумажных изделий
Натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) средней вязкости, глюкуроноксилан из березы, ламинарии из водорослей Laminaria digitata, калиевая соль полигалактуроновой кислоты (ПГУ), цитрусовый пектин, «-нитрофенил-p-D лактопиранозид, л-нитрофенил-р-О-глюкопиранозид, я-нитрофенил-P-D целлобиозид, я-нитрофенил-а-В-галактопиранозид, и-нитрофенил-a-L арабинофуранозид, я-нитрофенил-ацетат, о-нитрофенил-р-В-ксилопиранозид производства фирмы "Sigma" (США). Арабиноксилан из пшеницы, р-глюкан из ячменя, ксилоглюкан из тамаринда производства фирмы Megazyme" (Австралия). Бумага хроматографическая №1 производства фирмы "Whatman" (Англия), микрокристаллическая целлюлоза - Авицел (МКЦ) производства фирмы "Serva" (ФРГ). Частично деполимеризованный галактоманнан из глетрана получен в институте Биохимии им Н.А. Баха РАН и любезно предоставлен В. Д. Щербухиным.
Биоотварку хлопчатобумажной ткани под действием препаратов и индивидуальных ферментов проводили с использованием суровой хлопчатобумажной бязи российского производства (арт. 216, поверхностная плотность 125 г/м), расшлихтованной сс-амилазой (препаратом Амилосубтилин ГЗХ).
Биодепигментацию окрашенной хлопчатобумажной ткани проводили с использованием образцов джинсовой хлопковой ткани стандартных размеров и веса производства "Cotton Inc." (США), Биополировку хлопчатобумажной ткани проводили с использованием ткани "TIC-460", окрашенной красителем Red 80 (Textile Innovators Corp., США).
Оценку эффективности действия ферментов на корма проводили с использованием пшеницы, ячменя, ржи и пшеничных отрубей российского производства, а также сои американского производства.
Биоотбеливание целлюлозной пульпы под действием ферментов проводили с использованием эвкалиптовой пульпы, произведенной на национальной фабрике бумаги (Уругвай). Реактивы для определения биохимических характеристик ферментов. При изготовлении пластин (70x80x0,75 мм) с полиакриламидным гелем (ПААГ) для электрофореза в денатурирующих условиях (ДЦС-ЭФ) с концентрирующим (4%) и разделяющим (12%) гелями, а также для изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в 4% ПААГ (125x65x0,75 мм) использовали реактивы и наборы фирм "Reanal" (Венгрия), "Sigma" и "Bio-Rad". Окраску белка в гелях производили красителем Coomassie-Brilliant Blue R-250 фирмы "Ferak" (Германия) Перед электрофорезом исследуемые растворы ферментов предварительно обрабатывали 1% додецилсульфатом натрия (ДЦС-Na) и 5% р-меркаптоэтанолом при 100С в течение 5-10 мин.
В качестве стандартов для ДЦС-ЭФ использовали смеси белков фирмы "Sigma", включающие а-лактоальбумин, (14,2 кДа), соевый ингибитор трипсина (20,1 кДа), гидролизованный бычий трипсиноген (24,0 кДа), карбоангидразу (29,0 кДа), глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу (36,0 кДа), овальбумин (45,0 кДа), БСА (66,0 кДа), фосфорилазу В (97,4 кДа), р-галактозидазу (116,0 кДа) и миозин(205,0 кДа).
В качестве стандартов для ИЭФ использовали смеси белков IEF-M1A (pi 3,6-9,3) и IEF-M2 (pi 3,6-6,6) фирмы "Sigma", включающие амилоглюкозидазу (pi 3,6), глюкозооксидазу (pi 4,2), соевый ингибитор трипсина (pi 4,6), Р-лактоглобулин А (pi 5,1), карбоангидразы І и II из бычьих эритроцитов (pi 5,4 и 5,9), карбоангидразу I из эритроцитов человека (pi 6,6), миоглобин (pi 6,8 и 7,2), лектин (pi 8,2, 8,6 и 8,8) и трипсиноген (pi 9,3).
Для приготовления буферных растворов при проведении электрофореза и изоэлектрофокусирования использовали реактивы фирм "ICN", "Bio-Rad" и "Sigma". Реактивы общего назначения.
В качестве стандартов для построения градуировочного графика для гель-проникающей хроматографии (ГПХ) высокого давления при разделении полисахаридов использовали: декстраны с массами 20-250 кДа фирмы "Pharmacia Biotech" (Швеция), мальтопентаозу, мальтотетраозу и мальтотриозу фирмы "Sigma". В качестве стандартов для построения градуировочного графика для распределительной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке с привитой аминофазой при разделении моно- и олигосахаридов использовали: D-ксилобиозу, D-ксилозу, D-целлобиозу и ct-L-арабинозу фирмы "Merck" (Германия); D-глюкозу и D-галактозу фирмы "Реахим" (Россия). В качестве компонента подвижной фазы для ВЭЖХ использовали ацетонитрил фирмы "Реахим".
Для приготовления буферных растворов использовали реактивы марок х.ч., ч.д.а. и о.с.ч. фирм "Реахим", "Pharmacia Biotech", "Sigma", "ICN" и "Bio-Rad". Растворы, использовавшиеся в качестве элюентов для хроматографии, фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и тщательно дегазировали с помощью водоструйного насоса.
Восстанавливающие сахара (ВС) определяли модифицированным методом Шомоди-Нельсона [4,187] и динитросалициловым (ДНС) методом [4,187], содержание глюкозы — глюкозооксидазно-пероксидазным методом [4,187] с использованием наборов "Фотоглюкоза" (ООО "Импакт", Россия).
Состав низкомолекулярных продуктов гидролиза высокомолекулярных субстратов исследовали методом ВЭЖХ на колонке с привитой аминофазой. Для исследований использовали жидкостной хроматограф высокого давления Chromatography Workstation 700 фирмы "Bio-Rad". В качестве элюента использовали смесь ацетонитрила с водой в соотношении 7:3. Для лучшего разрешения пиков ксилозы, арабинозы и ксилобиозы это соотношение меняли до 8:2. Хроматографию проводили при скорости потока 1 мл/мин. Детекцию осуществляли с помощью дифференциального рефрактометра фирмы "Knauer" (Германия).
Содержание белка в пробах определяли модифицированным методом Лоури [187] или по поглощению на длине волны 280 нм. Калибровку проводили, используя препарат Т. reesei COG-1 с известной концентрацией белка (220 г/л). Для спектрофотометрических измерений использовали спектрофотометры UV-150-02 фирмы "Shimadzu" (Япония) и PU 8636 фирмы "Philips" (Англия).
Выделение и очистка индивидуальных компонентов Т. reesei. Обессоливание и анионообменную хроматографию низкого давления проводили с помощью хроматографической системы Econo System ("Bio-Rad"). Для обессоливания использовали колонки (1,2x29 см или 0,7x16 см) фирмы "Bio-Rad" с носителем биогель Р-4. Колонки уравновешивали 0,1 М Na-ацетатным буфером, рН 5,0, или 0,025 М имидазол/НС1 буфером, рН 7,5, белки элюировали стартовыми буферами. Анионообменную хроматографию низкого давления проводили на колонке (1,2x29 см) фирмы "Bio-Rad" с носителем ДЭАЭ-сферон, уравновешенной 0,1 М Na-ацетатным буфером, рН 5, или 0,025 М имидазол/HCl буфером, рН 7,0. Связавшиеся в стартовых условиях белки элюировали далее в градиенте концентрации NaCl.
