Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Биокоррозия 9
Объекты, подверженные биокоррозии 9
Участие сульфат-восстанавливающих бактерий в процессах биокоррозии 10
Другие бактерии, участвующие в процессах биокоррозии 14
1.2. Коррозионно активные биопленки 19
1.2.1.Формирование коррозионно активных биопленок: состав и взаимосвязь
с коррозионными процессами 19
1.2.2. Факторы, влияющие на формирование коррозионно активных биопленок 22
Влияние кислорода на развитие биопленок , 22
Влияние протока на формирование коррозионно активных биопленок 24
Влияние химических свойств металла, на поверхности которого формируются биопленки 25
1.3. Методы исследования биокоррозии 28
1.3.1. Методы дифференцированного исследования планктонных культур 29
Микробиологические методы 29
Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) 30
Косвенные методы определения клеток 31
Флуоресцентные и иммунологические методы 32
1.3.2. Методы исследования коррозионно активных биопленок 33
1.4. Подходы к предотвращению процессов биокоррозии 35
Применение ингибиторов коррозии с биоцидной активностью 35
Биоцидные вещества в нефтяной промышленности 40
Ингибирущая роль биопленок в развитии коррозии 46
Применение дотированных сталей 48
Удаление накапливающихся загрязнений, нефтяные сорбенты 49
1.5. Биолюминесцентный метод определения внутриклеточного АТФ 54
Каталитические реакции, лежащие в основе биолюминесцентного метода 54
Практическое применение биолюминесцентного метода определения АТФ 58
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 64
2.1. Материалы 64
Химические реактивы 64
Ингибиторы коррозии 64
Пробы нефти 65
Нефтесорбент 65
Металлические купоны 65
Приборы 66
Микроорганизмы 66
2.2. Методы 66
Хранение и культивирование бактерий 66
Микробиологическое определение численности бактерий 68
Определение концентрации внутриклеточного АТФ биолюминесцентным методом 68
Определение с помощью биолюминесцентного метода концентрации клеток в грунте, загрязненном нефтью 70
Экстракция внутриклеточного АТФ из клеток в составе биопленок 71
Определение удельной скорости роста клеток 71
Определение концентрации сульфида в среде и в составе биопленок 72
Определение концентрации сульфата в среде 73
Определение концентрации фосфат-ионов в среде 73
Определение концентрации железа в среде 74
Определение массового показателя коррозии 74
Покрытие металлической поверхности сульфидной пленкой 75
Определение минимальных ингибирующих концентраций ингибиторов коррозии по отношению к планктонным клеткам и биопленкам 75
Подготовка проб грунта/песка для экспериментов 75
Определение концентрации растворенного кислорода в среде 76
Ультразвуковая дезинтеграция клеток для определения полноты экстракции АТФ 77
Определение органических кислот в сточных водах 77
Проточная система 78
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕНИЕ . 79
3.1. Применение биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования
кинетики роста и численности микроорганизмов, участвующих в
процессах биокоррозии 79
3.1.1. Определение удельной концентрации внутриклеточного АТФ в
клетках, участвующих в процессах биокоррозии . 79
3.1.2. Применение биолюминесцентного метода для исследования кинетики
роста планктонных клеток, участвующих в процессах биокоррозии 80
3.1.3. Оптимизация условий применения биолюминесцентного метода
для исследования кинетики роста гетеротрофных бактерий в
загрязненных нефтью пробах песка и грунта 84
3.1.3.1. Исследование удельной концентрации АТФ в клетках бактерий
с использованием хлороформа в качестве экстрагирующего агента 84
Определение численности бактерий в модельных системах на основе грунта, загрязненного нефтью 85
Исследование кинетики роста бактерий в грунте, загрязненном нефтью 86
3.1.4. Оптимизация условий применения биолюминесцентного метода для
исследования кинетики формирования коррозионно активных биопленок 89
3.1.5. Разработка дифференцированного метода анализа состава смешанных
бактериальных планктонных клеток и коррозионно активных биопленок 90
3.1.6. Применение разработанных методик для анализа численности
коррозионно активных клеток в пробах из реальных объектов 96
3.2. Исследования закономерностей формирования и факторов, влияющих на
формирование коррозионно активных биопленок 100
Кинетические закономерности формирования биопленок в зависимости от микробного состава среды 100
Исследование кинетики накопления сульфида железа и анализ его
роли в формировании биопленок 104
Кинетические закономерности химической коррозии различных металлов в процессе формирования биопленок 107
Влияние присутствия нефти в среде на кинетику формирования биопленок.... 111
Влияние скорости протока и типа системы на кинетику
формирования биопленок 113
3.3. Разработка подходов к подавлению процессов биокоррозии 117
3.3.1. Исследование возможности применения ингибиторов коррозии
для предотвращения биокоррозии 117
3.3.1.1. Исследование влияния различных ингибиторов коррозии на
кинетические параметры люциферазной реакции 117
Определение биоцидной активности ингибиторов коррозии по отношению к планктонным клеткам биолюминесцентным методом 123
Определение биолюминесцентным методом биоцидной активности ингибиторов коррозии по отношению к биопленкам 129
3.3.2. Использование нефтяных волокнисто-пористых сорбентов для
снижения скорости биокоррозионных процессов 133
3.3.2.1. Исследование способности сорбента «Мегасорб» удалять сульфид
железа из среды 133
3.3.2.2. Исследование возможности удаления бактериальных клеток
из среды Мегасорбом 135
3.3.2.3. Исследование влияния фильтрации модельных сточных вод Мегасорбом
на кинетику формирования биопленок 137
3.3.2.4. Совместное использование Мегасорба и ингибиторов коррозии
для элиминирования факторов, приводящих к развитию
коррозионно активных биопленок 138
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 139
ВЫВОДЫ 142
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 143
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СВБ - сульфат-восстанавливающие бактерии
ГБ - гетеротрофные бактерии
ЖОБ - железоокисляющие бактерии
ЭПС - экзополисахариды
ПММА - полиметилметакрилат
ПЦР - полимеразная цепная реакция
МИК - минимальная ингибирующая концентрация
ЧАС - четвертичные аммонийные соединения
ХТО - химико-термическая обработка
ДМСО - диметилсульфоксид
ПАВ - поверхностно-активное вещество
ДМП - н,н-диметил-п-финилендиамин
ИК - ингибиторы коррозии
КОЕ - колонне образующие единицы
ДСН - додецилсульфат натрия
АРК - агент, разрушающий клетки
Введение к работе
В настоящее время наличие биоактивности, проявляемой микроорганизмами, может быть обнаружено практически везде на различных объектах, подверженных коррозии и биодеградации под воздействием ферментов, каталитически активных в отношении различных материалов (металла, пластика и др.) Коррозию металла, возникающую под воздействием микроорганизмов, принято называть биокоррозией.
Исследования показали, что коррозия под воздействием микроорганизмов представляет собой проблему большой экономической важности. Установлено, что 20% потерь от коррозии приходится именно на долю биокоррозии [1]. Нефтяная промышленность относится к тем отраслям, основные фонды которых в наибольшей степени подвергаются воздействию биокоррозии [2-4].
Коррозионно активные планктонные культуры могут существовать в сточных водах, грунте, загрязненном нефтью и в других объектах нефтяной промышленности. Микроорганизмы могут изменять характер коррозии, создавая на поверхности металлов условия для появления концентрационных электрохимических элементов, либо влиять на изменение агрессивности среды или непосредственно на кинетику электродных реакций [5].
Биопленки, представляющие собой самоиммобилизующиеся бактериальные ассоциации сложного состава, играют важную роль в развитии процессов биокоррозии [6,7]. Биопленки практически всегда состоят из различных видов бактерий, которые взаимодействуют друг с другом и окружающей их средой.
Несмотря на важность проблем, связанных с формированием коррозионно активных биопленок, из-за недостатка высокочувствительных, экспрессных и удобных для исследования биокоррозии методов, до сих пор остаются мало изученным ряд вопросов, касающихся выявления основных факторов, влияющих на формирование и состав биопленок. В частности, открытыми остаются вопросы, связанные с изучением влияния скорости протока, химической природы металла, микробного состава планктонной культуры, присутствия нефти и сульфида железа в среде на кинетические закономерности формирования коррозионно опасных биопленок. Изучение этих факторов может существенно влиять на стратегию эксплуатации промышленных систем, обработки загрязненных нефтью вод и контроля коррозионно активных культур.
В течение нескольких последних десятилетий большое внимание уделяется вопросам ингибирования и подавления процессов биокоррозии. Очевидно, что биокоррозия и процессы химической коррозии действуют в комплексе, поэтому скрининг веществ, действие которых одновременно направлено против химического корродирования и вызывает подавление роста и метаболизма микроорганизмов,
способствующих развитию коррозионных процессов, является важной задачей исследований.
Основные характеристики биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ (высокая чувствительность, специфичность и экспрессность) представляют большой интерес [8-11] с точки зрения их применения для фундаментальных исследований особенностей кинетики роста планктонных клеток в различных объектах коррозии и клеток, входящих в состав биопленок.
АТФ является универсальным внутриклеточным метаболитом, который содержится во всех жизнеспособных клетках любых микро- и макроорганизмов, поэтому может рассматриваться как универсальный индикатор живых клеток в анализируемых образцах. АТФ можно определять с помощью биолюминесценции с высокой точностьюй даже при ультрамалом содержании вещества в образце - до Ю-12—Ю-14 М [152].
В связи с этим актуальной является разработка новых подходов на основе биолюминесцентного метода определения внутриклеточного АТФ к анализу кинетики роста коррозионно активных клеток в пробах воды и грунта, в том числе объектах, загрязненных нефтью, а также к исследованию влияния различных факторов на кинетику формирования коррозионно опасных биопленок.
Биолюминесцентный метод позволяет определить как делящиеся, так и неделящиеся клетки, что позволяет определять численность всех живых клеток в анализируемых образцах. В связи с этим актуальным является разработка подходов на основе биолюминесцентного метода анализа к определению биоцидной активности ингибиторов коррозии (ИК) по отношению к коррозионно активным клеткам и биопленкам, а также выяснение возможности применения ИК в качестве биоцидов.
Разработка новых экологически безопасных технологий, предотвращяющих или снижающих скорости развития биокоррозии, является одним из основных требований промышленности. С этой точки зрения удаление основных компонентов среды, влияющих на формирование биопленок, является важной задачей. Применение нефтяных сорбентов для удаления нефти из сточных вод с целью уменьшения риска развития коррозионно опасных микроорганизмов, участвующих в формировании биопленок, также может быть актуальным с точки зрения предотвращения развития процессов биокоррозии.
Таким образом, разработка новых подходов на основе ферментативного биолюминесцентного метода определения внутриклеточного АТФ к анализу основных факторов, влияющих на кинетику формирования коррозионно опасных биопленок, с последующей разработкой экологически безопасных методов элиминирования этих факторов является весьма актуальной и представляет большой интерес с научной, а также с экономической и экологической точек зрения.
