Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Регуляция функционирования опиатных рецепторов ионами металлов 10
1.1 Современные представления о роли ионов металлов в функционировании рецепторов медиаторов и модуляторов Ц Н С 10
1.1.1 Влияние ионов щелочных металлов на рецепторы 11
1.1.2 Влияние ионов щелочноземельных и переходных металлов на рецепторы 13
1.2 Опиатные рецепторы и их лиганды 15
1.2.1 Методы исследования опиатной рецепции... 15
1.2.2 Взаимодействие лигандов с опиатными рецепторами 16
1.3 Ионы металлов и опиатные рецепторы 20
1.3.1 Влияние ионов щелочных металлов на опиатные рецепторы 20
1.3.2 Ионы Са + и действие опиатов в ЦНС 23
1.3.3 Влияние опиатов на транспорт ионов Са в синаптосомы , 25
1.3.4 Влияние ионов щелочноземельных и пере ходных металлов на опиатную рецепцию... 29
1.4 Современные представления о природе функциональных групп опиатных рецепторов... 35
1.5 Влияние ионов металлов на действие опиатных лигандов in viV~C 37
Глава 2. Методика эксперимента 41
2.1 Исходные вещества и материалы 41
2.2 Методы 43
2.3 Обработка результатов 49
Глава 3. Механизм регуляции рецепции энкефалина ионами щелочноземельных и переходных металлов 54
3.1 Влияние хелаторов на рецепцию Н-энкефалина.. 54
3.2 Эффект ионов металлов на связывание эн-кефалина с препаратом мембран, преинку-бированным с хелатором 61
3.3 Доказательства отсутствия комплексообра-зования энкефалина с ионами металлов 62
3.4 Равновесная схема влияния ионов металлов на рецепцию Н-энкефалина. Классификация катионов - активаторов 67
3.4.1 Влияние ионов Са+ на рецепцию Н - энкефалина 69
3.4»2 Влияние ионов Мл на рецепцию Н - энкефалина 82
3.4.3 влияние ионов на рецепцию Н- энкефалина 89
3.4.4 Классификация ионов металлов - активаторов энкефалиновой рецепции 94
3.5 Механизм влияния ионов металлов на связывание %-энкефалина с низкоаффинным рецептором 95
3.5.1 рН - зависимость связывания Н-энкефалина с низкоаффинным рецептором и эффект ионов металлов 95
3.5.2 Температурная зависимость связывания Н-энкефалина с низкоаффинным рецептором... 105
3.5.3 Конкурентные ингибиторы процесса активации катионами низкоаффинного рецептора Н-энкефалина - ионы Са 106
3.6 Механизм влияния ионов металлов на связывание Н-энкефалина с высокоаффинным рецептором 108
3.6.1 рН - зависимость связывания ^Н-энкефалина с высокоаффинным рецептором и эффект катионов металлов 108
3.6.2 Температурная зависимость связывания ЧНг-энкефалина с высокоаффинным рецептором 117
3.7 Селективные ингибиторы рецепции энкефалина антагонист Са - верапамил и ионы Zn 118
Глава 4. Механизм регуляции рецепции мошина ионами щелочноземельных и переходных металлов 122
4.1 Влияние ЭГТА на рецепцию аН-морфина 122
4.2 Влияние ионов Са2+ и ионов переходных металлов на рецепцию морфина 126
4.2.1 Влияние ионов Gsr+ на рецепцию Н-морфина 128
4.2.2 Влияние ионов переходных металлов на рецепцию 3Н-морфина 130
4.3 рН - зависимость рецепции морфина и влияние ионов металлов 135
Глава 5. Кинетические закономерности влияния опиатов на транспорт ионов Са2+ В синаптосомы 137
5.1 Кинетические закономерности транспорта ионов Са в синаптосомы 137
5.2 Влияние агонистов и антагонистов опиатных рецепторов на К*" - стимулируемый транспорт ионов Са в синаптосомы 142
5.3 Связаны ли регуляторные катионсвязывающие участки опиатных рецепторов с потенциал зависимыми кальциевыми каналами нейромембраны ? 146
Глава 6. Природа катионсвязшающих групп опиатных рецепторов 147
6.1 Функциональные группы различных типов опиатных рецепторов. Зависимость между силой влияния ионов металлов на рецепцию и константами нестойкости их комплексных соединений 147
6.2 Химическая модификация опиатных рецепторов 152
6.2.1 Химическая модификация опиатных рецепторов диэтилпирокарбонатом 152
6.2.2 Химическая модификация высокоаффинного рецептора энкефалина молибдатом аммония 160
6.3 О природе катионной регуляции опиатных рецепторов 162
Глава 7. Влияние ионов металлов на анальгегический эффект опиатов 162
7.1 Кинетические закономерности потенцирования опиатной анальгезии ионами металлов 163
7.2 Корреляционный анализ физико-химических характеристик влияния ионов металлов на опиатную рецепцию и анальгезию 165
Выводы 171
Литература 173
- Опиатные рецепторы и их лиганды
- Эффект ионов металлов на связывание эн-кефалина с препаратом мембран, преинку-бированным с хелатором
- Механизм влияния ионов металлов на связывание %-энкефалина с низкоаффинным рецептором
- Механизм влияния ионов металлов на связывание Н-энкефалина с высокоаффинным рецептором
Введение к работе
В последнее время большое внимание исследователей привлекает модуляция функционирования центральной нервной системы (ЦНС) опиатами и нейропептидами. Вещества из группы опиатов ( морфин и его аналоги ) известны давно и широко применяются в медицине. Группа эндогенных модуляторов ЦНС - нейропептидов -была обнаружена сравнительно недавно [ I ] и включает энкефали-ны и эндорфины ( соответственно пяти- и 31- аминокислотные пептиды ), а также некоторые другие соединения. Опиаты и нейропеп-тиды оказывают мощные эффекты на организм: повышают порог болевой чувствительности, влияют на эмоциональное состояние и память. Изменения, вызываемые в организме экзогенными опиатами, лежат в основе наркомании; эндогенные пептиды оказывают влияние на течение целого ряда психических заболеваний. Столь широкий спектр проявлений физиологической активности эти вещества реализуют через взаимодействие со специфическими опиатными рецепторами [2 - 4J , что и определяет актуальность и практическую ценность исследования последних. Особое значение имеет регуляция функционирования опиатных рецепторов, которая осуществляется многими факторами. К числу наиболее эффективных регуляторов опиатных рецепторов принадлежат ионы металлов. Тот факт, что ионы металлов могут оказывать сильное влияние на опиатную рецепцию, был известен давно, однако природа этого явления не изучена. В этой связи значительный интерес представляет физико-химическое исследование катионной регуляции опиатной рецепции. Перспективным представляется также применение физико-химических методов для выяснения закономерностей влияния опиатной рецепции на взаимодействие катионов с нейромембраной, на трансмембранные потоки универсальных клеточных регуляторов - ионов Са .
В этой связи основной задачей настоящей работы является изучение физико-химических закономерностей и определение параметров регуляции опиатнои рецепции ионами двух- и трехвалентных металлов на основе применения физико-химических подходов и методов исследования. В работе эта задача решалась на примере рецепции классического опиата - морфина и стабильного аналога лейцин-энкефалина - D - Ала , J) -Jlevr- энкефалина. В работе решались также задачи исследования кинетических закономерностей влияния опиатов на транспорт ионов Са в нервные окончания и действия ионов металлов на анальгетический эффект опиатов in viva.
Опиатные рецепторы и их лиганды
Ранние (фармакологические) исследования опиатной рецепции базировались на основном эффекте опиатов - анальгетическом (повышение порога болевой чувствительности) [36J . Анальгетическое действие опиатов анализировалось с помощью нескольких методов -теста горячей пластинки, теста отдергивания хвоста, нескольких типов тестов корчи [37 - 39] . В литературе отмечается, что результаты, полученные с помощью различных методов, могут отли -чаться [38] . Так как наблюдаемый анальгетический эффект является следствием сложной последовательности реакций организма, вызванных введением препарата, на него могут влиять многие факторы. Фармакологические исследования опиатов ІП 1/ІІҐСГ проводятся в основном на препаратах периферических органов животных [_3j . Биохимический анализ связывания опиатов с рецепторами описан для систем in viVQ и l/l vitptf . В первом случае радиоактивный препарат лиганда вводится в организм до того, как животное забивается и из него извлекается мозг. Далее с помощью специальных методик быстрого фильтрования оценивается количество связавшегося препарата [40, 4l] .
Однако изучать физико-химические параметры влияния эффекторов на ошатную рецепцию в настоящее время наиболее удобно лишь ІП VXtrv- на мембранных препаратах мозга животных. При этом для отделения связавшегося с мембранами радиоактивного лиг-анда от свободного используется центрифугирование [42] , а также наиболее быстрый метод -вакуумное фильтрование [43] . Физико-химические параметры процесса связывания лиганда - равновесная константа диссоциации комплекса с рецептором и концентрация центров связывания (ре цепторов) в большинстве работ определяются с помощью анализа изотерм связывания в координатах Хилла [44] или Скэтчарда [45.] . Сродство немеченых лигандов оценивается косвенным образом по значению константы ингибирования ( Aj ) связывания меченого лиганда с использованием уравнения Ченга - Прусоффа [4б]: rfleLLJ- концентрация меченого лиганда, К - равновесная константа диссоциации его комплекса с рецептором, IC Q -концентрация немеченого лиганда, вполовину снижающая связывание меченого. Однако, интерпретация данных, полученных с помощью таких оценок, значительно осложняется при наличии в системе нескольких типов центров связывания [47] . В настоящее время широко используются также нелинейные методы наименьших квадратов, позволяющие анализировать параметры процесса рецепции как по изотерме связывания, так и по кривым конкурентного вытеснения различных лигандов [48] . Для выбора моделей взаимодействия лиганда с рецептором ( количество типов центров связывания, наличие кооперативности и т.д.) используются методы имитационного моделирования [49] . Анальгезия не является единственным проявлением физиологической активности опиатов и опиоидов. Подавление дыхания, гипотермия, снотворное действие, абстиненция (синдром, возникающий при "острой" отмене действия опиатов),- вот далеко не полный перечень эффектов этих веществ на организм. Множественность ви дов физиологического ответа стимулировала поиски соответствующих типов рецепторов.
Первые представления о неоднородности опиатных рецепторов сложились по результатам фармакологических исследований ( 1Л VIVV ). В ранних работах Мартина и др. L50J было продемонстрировано наличие в ЦНС трех типов опиатных рецепторов - М , /f и Т- . Для М - рецепторов типичным агонистом является морфин, для /f - кетациклазоцин и этилкетациклазоцин, а для (Г - Н - аллилнорметазоцин 10047 ). Перечисленные соединения обладают как анальге-тической активностью, так и целым рядом характерных для опиатов свойств. В то же время между ними не наблюдалось перекрестных фармакологических эффектов таких, как снятие абстинентного синдрома у зависимых животных. Это и легло в основу представлений о фармакологической гетерогенности опиатных рецепторов. В дальнейшем, отличия в реакциях животного на различные дозы СГ -агонистов позволили предположить существование высокоаффинных ( (TV ) и низкоаффинных ( (5л ) СТ - рецепторов [4 J Правомерность этого предположения до сих пор спорна. Так, в работе [_5IJ отмечается, что аналогичным действием характеризуется фенциклидин; есть указания на то, что обнаруженный эф -фект связан с участием дофаминовых рецепторов [52] . Новые фармакологические типы опиатных рецепторов были описаны с открытием эндогенных опиоидных пептидов - энкефалинов и эндорфинов. В работах Лорда и др. [53] было показано, что в периферических органах существуют опиатные рецепторы, различающиеся по сродству к опиатам ( морфину и его аналогам) и опиоидным пептидам. Так, если препарат кишечника морской свинки содержит в основном рецепторы, обладающие большим сродством к морфину и его антагонистам { Д - рецепторы), то препарат семявыносящего про тока мыши - рецепторы, селективно взаимодействующие с энкефалинами. Последние были отнесены к О - типу. И, нако нец, исследования действия А-эндорфина на препаратах протока крысы позволили предположить наличие селективного по отношению к этому соединению - типа рецепторов [54,. 55 J . Резуль таты многочисленных исследований связывания опиатных лигандов с препаратами мозга животных хорошо коррелируют с существовани ем М - и О типов опиатных рецепторов [42, 56, 57J .
На это указывают следующие данные. I) Культуры нервной ткани /V4TS/ к/\148Т62 [59, 60] и гибридные клетки нейроблас томы - глиомы (NGf08-f5 ) [бі] содержат гомогенную по пуляцию энкефалиновых рецепторов. 2) Гуанозинтрифосфат (ГТФ) селективно снижает сродство к опиатным агонистам. Этот эффект сильнее выражен для № - рецепторов [б2, бз] . 3) Многочис ленные периферические ткани содержат преимущественно различные типы рецепторов [б4] . 4) Продемонстрировано отсутствие пере крестной зависимости-толерантности между М - и О - агонис тами после хронического введения их в организм животного [бб]« 5) Морфин селективно защищает от необратимой инактивации фенок сибензамином [бб] и А/ - этилмалеимидом [б7] рецепторы М -, но не О - типа, а энкефалин - наоборот. Кроме того, А - фумарат метилового эфира налтрексона инактивирует А рецепторы более эффективно, чем другие типы центров связывания [68]. Особого обсуждения заслуживают работы Пастернака с со трудниками [б9 - 70] , в которых развиваются представления о множественности Ж - типов опиатных рецепторов. На основе данных по конкуренции различных лигандов в работе [70] дается биохимическая характеристика так называемого "сверхвысокоаффин ного" рецептора ( Д ), характеризующегося значением кон
Эффект ионов металлов на связывание эн-кефалина с препаратом мембран, преинку-бированным с хелатором
В ряде работ влияние ионов металлов на рецепцию опиатов изучали на препаратах мембран, не преинкубированных с хелато рами [5,6,115] . Как было показано в 3.1 , эндогенные ионы металлов, сохранившиеся в препарате после процедуры выделения, могут вносить существенный вклад в уровень связывания исследуемого лиганда. В этой связи представляет интерес изучение влия-ния ряда солей в широком диапазоне концентраций на рецепцию Н--энкефалина. На рис.6 представлены данные по влиянию ионов различных металлов на уровень связывания лиганда. Видно, что все исследованные ионы, кроме 2ztt 1 увеличивают уровень связывания; ионы zzn ингибируют рецепцию. Обращает на себя внимание факт существенного отличия в силе действия для разных катионов. Так, значительное увеличение уровня связывания лиганда в присутствии ионов лантаноидов наблюдается уже при микромолярных их концентрациях; в присутствии Са - активация значительно слабее. Кривая зависимости уровня связывания лиганда от концентрации солей выходит на плато ( Св , Мб 7 пП ) . При повышении концентра-ции ионов металлов более 10 мМ уровень связывания Н-энкефалина снижается. Для проверки обратимости эффектов катионов препарат мембран отделяли от среды инкубации, содержащей ионы металлов,и промывали буфером или раствором ЗГТА. Результаты этого эксперимента приведены в табл.4. Видно, что действие ионов обратимо : после промывки буфером - частично, после промывки 3 мМ - раствором ЗГТА - полностью. Природа влияния ионов металлов на рецепцию Н-энкефалина представляет большой интерес. Эффект ионов может быть связан с их комплексообразованием как с лигандом, что приводит к измене характера процесса его взаимодействия с центром связывания, так и самой мембраной или рецептором в мембране.
Для проверки первого предположения была изучена возможность связывания ионов с энкефалином в условиях инкубации. Комплексообразование ионов металлов с молекулой энкефалина в настоящей работе исследовалось несколькими физико-химическими методами: I) Измерение с помощью ион - селективного( кальций-селективного) электрода концентрации ионов Са в присутствии и в отсут -ствие избытка энкефалина. Из данных эксперимента, представленных на рис.7 , видно , что добавление энкефалина в среду инкубации не изменяет свободной концентрации ионов Са в растворе. Это указывает на отсутствие комплексообразования Са с энке-фалином. 2) Исследование возможности изменения конформации пептида (энкефалина) в присутствии ионов металла с использованием метода кругового дихроизма (КД). На рис. 8 приведены спектры ВД лиганда в условиях инкубации в отсутствие (кривая I) и в присутствии (кривая 2) ионов металла. Видно, что существенных отличий в спектрах в исследуемом диапазоне длин волн не наблюдается. Эти данные подтверждаются результатами ряда работ [l57, 158] , где исследовались спектры БД аналогов энкефалина в водной и органической (диоксан, ацетонитрил) средах. Отмечалось, что в водной среде в присутствии ионов металлов не происходит изменений конформации пептидов - аналогов энкефалина. В работе [I57J координация иона металла, приводящая к изменению конформации энкефалина только в условиях сильно гидрофобного окружения, которое может реализоваться, по-видимому, в комплексе лиганда с опиатным рецептором. 3) Изучение возможности комплексообразования ряда исследуемых ионов с энкефалином с использованием спектрофотометрических индикаторов - Арсеназо-Ш и Цинкон.
Концентрация ионов измерялась в среде инкубации в присутствии и в отсутствие энкефалина. Концентрации компонентов исследуемой системы выбирались, исходя из соотношения концентраций иона, оказывающего действие на рецепцию энкефалина и эффективной равновесной константы нестойкости комплекса этого иона с соответствующим индикатором ( см. табл.5 ). В условиях эксперимента при наличии комплексообразования пептида с ионом металла большая часть ионов должна быть связана с энкефалином. В табл. 5 представлены данные по поглощению комплексов ионов с индикаторами на характерных длинах волн в присутствии и в от -сутствие избытка энкефалина. Видно, что добавление избытка пептида в среду инкубации не приводит к изменению оптической плотности растворов, пропорциональной свободной концентрации ионов металлов. Таким образом, на основании комплекса экспериментальных данных можно сделать вывод, что в присутствии исследуемых ионов металлов в концентрациях, оказывающих влияние на рецепцию энкефалина, комплексообразования ионов с лигандом не происходит. Следовательно, наблюдаемый эффект катионов металлов на peon s цию не может быть обусловлен связыванием иона металла с Н -энкефалином.
Механизм влияния ионов металлов на связывание %-энкефалина с низкоаффинным рецептором
Регуляция энкефалиновой рецепции ионами металлов осуществляется через взаимодействие иона с определенным участком мембраны или рецептора %-энкефалина - так называемым катионсвязыг вашим участком. Высокие константы связывания ионов металлов с рецепторами (табл. 7) позволяют предположить присутствие ионо-генных групп, в частности кислотно - основной природы, в кати-онсвязывающих участках. С целью выяснения природы этих групп представляло интерес изучить влияние рН, а также двух- и трех-валентных ионов металлов на связывание Н-энкефалина с рецепторами препарата мембран головного мозга крыс, преинкубирован-ных с ЗГТА. Для исследования рН-зависимости рецепции - лиганда воспользуемся схемой анализа, предложенной в 3.4.3. На рис. 21 представлены преобразования изотерм специфического связывания Н --энкефалина при рН 6,8 (кривая I), 5,5 (кривая 2) и 8,0 (кривая 3) в координатах Скэтчарда.
Видно, что изменения значений равновесных констант диссоциации комплексов лигандов с рецептором наблюдается в области как высоко-, так и низкоаффинного свя зывания. Результаты анализа сверхвысокоаффинного связывания в координатах разностного метода (3), приведенные на рис.22., свидетельствуют о неизменности значений КіЗ ИР11 различных рН. Смещение кривых на рис. 22 друг относительно друга связано о с изменением вклада связывания Н-энкефалина с высокоаффинным рецептором. Действительно, обработка данных на ЭВМ свидетельствует о следующем. Значения изменяются от4,4 нМ при рН 6,8 до 59 нМ и 40 нМ при рН 8,0 и 5,5 соответственно. Значения ftzg меняются от III нМ при рН 6,8 до 512 нМ и 557 нМ при рН 5,5 и. 8,0 соответственно. При этом значения Q#/ tQoZ и Qoj не изменяются. Зто позволяет использовать "метод фиксированных концентраций лиганда" для подробного анализа влия-ния рН среды на параметры связывания иН-энкефалина. Важным этапом исследования влияния рН на рецепцию Нгэн-кефалина является проверка возможности инактивации мембранного препарата при различных значения рН. Результаты проверки представлены на рис.23, иллюстрирующем данные по влиянию трех различных условий инкубации мембранного препарата на рН-зависи-мость значений ftjg . На кривой I представлена рН-зависимость /f после преинкубации мембранного препарата в течение 30 мин. в контрольных условиях - рН 7,4; рецепция 3Н-энкефалина измерялась при различных рН. Зависимость, представленная на кривой 2, получена после преинкубации препарата при различных значениях рН в течение 30 мин.; количество связанного лиганда в, этом случае определялось при рН 7,4. И, наконец, на кривой 3 представлена рН зависимость Л Э » полученная с препаратом, не преинкубированным перед измерением связывания лиганда. Видно, что при рН 6,0происходит значительное увеличение /\ЗЭ Кривые 1-3 при рН 5,0-6,0 совпадают; значения К{}$ saP при рН 6,0 - 8,5 после преинкубации препарата мембран при различных рН (кривая 2). не изменяются. Следовательно, инкубация препарата в среде с рН 6,0 приводит к необратимому изменению низкоаффинного рецептора энкефалина; изменения значений /\33 при рН 6,0 обратимы и, по-видимому, определяются положением протонных равновесий ионогенных групп.
Поскольку такие ионогенные группы могут в принципе присутствовать как в лиганде, так и в рецепторе, необходимо было выяснить, к какому из участвующих в связывании компонентов они относятся. С этой целью было проведено титрование энкефалина в диапазоне рН 6,0-- 8,5. Результаты титрования показывают, что рКа ионогенной группы энкефалина (по-видимому,// -концевого тирозина) равно 7,9. Обработка кривых 1,3 при рН 6,0(рисх23) с использованием ЭШ показывает, что процесс низкоафСфинного связывания контролируется одной ионогенной группой с рКа = 7,9. Это обстоятельство позволяет предположить, что увеличение Лзэ при переходе к слабощелочной среде обусловлено депротонированностью )\ - концевой группы молекулы Нгэнкефалина. В 3.4 было показано, что наличие в среде инкубации катио нов , лантаноидов приводит к уменьшению п з в 7-8 раз. В этой связи большой интерес пред ставляло исследование возможности участия катионов металлов в протонных равновесиях, определяющих взаимодействие Н-энкефа лина с низкоаффинным рецептором. Результаты влияния присутствия в среде избытка МґіОЬ и СвіСІ , на рН-зависимость /( 3 приве дены на рис. 24 (кривая 2,3).Видно, что Са + в указанных кон центрациях не изменяет значений Л33 на БСЄМ интервале рН. В присутствии Мп рН-зависимость константы А ЗЭ имеет тот же самый вид, однако параллельно смещена вверх по сравнению с кривой в отсутствие ионов металла. То есть значения Д Э в казкдой точке рН-зависимости уменьшаются в одинаковой степени.
Для выяснения,конкурирует ли протон(Н)и ион металла за ка-тионсвязывающий регуляторний участок рецептора "%-энкефалина, было исследовано влияние рН на константу действия иона металла на низкоаффинный рецептор "А А/ЄЛ - Удобства был выбран ион І\ІІ , оказывающий активирующее влияние только на низкоаффинный рецептор %-энкефалина. На рис. 25 приведена зависимость значения константы диссоциации комплекса Nt с ка-тионсвязываюшим участком низкоаффинного рецептора (АД/5/ ОТ концентрации протонов. Видно, что значение г\Ш1 меняется с изменением [В. ] , зависимость линейна в координатах Кмд от [н ] . Этот факт позволяет сделать вывод о конкуренции Н и ионов - активаторов низкоаффинного рецептора. Таким образом, равновесия, характеризующие взаимодействие Н-энкефалина с низкоаффинным центром связывания при рН 6,0, представляются в виде схемы: иона ме
Механизм влияния ионов металлов на связывание Н-энкефалина с высокоаффинным рецептором
В 3.5.1 были представлены данные , свидетельствующие об изменении константы диссоциации комплекса Н-энкефалина с вы сокоаффинным рецептором препарата мембран головного мозга крыс-( А 29 ) при различных рН. Подробное изучение рН-зависи-мости К2.Э проводили модифицированным методом фиксированной концентрации лиганда. На рис. 28 представлены результаты проверки стабильности препарата мембран в средах с различным значением рН. На кривой I представлена рН-зависимость f\ g после преинкубации мембран в течение 30 мин. в среде с рН 7,4 (кон- троль), рецепция измерялась при различных рН Зависимость, представленная на кривой 2, получена после ЗО -ти минутной преинкубации препарата при различных рН; количество связанного лиганда в этом случае измерялось при рН 7,4. Наконец, кривая 3 иллюстрирует рН-зависимость /\2Э ДО препарата, не преинку-бированного перед измерением связывания лиганда. Из рис. 28 видно, что, как и в случае низкоаффинного рецептора, при рН 6,0 происходит увеличение А29 Кривые 1-3 при рН 5,0 - 6,0 совпадают; значения /\9 при рН 6,0 - 8,5 после преинкубации препарата мембран при различных рН (кривая 2) не изменяются.Таким образом, как и в случае низкоаффинного рецептора, инкубация мембран при рН 6,0 приводит к необратимому изменению высокоаффинного рецептора Н-энкефалина.
В области значений рН 6,0 К%Э изменяется обратимо. Представляло интерес выяснить как влияют на рН-зависимость ионы металлов при рН 6,0. Для удобства работы был выбран _ 2+ ион Са т -представитель группы катионов, селективно увеличивающих сродство высокоаффинногорецептора к лиганду (см. 3.4.1) На рис. 29 (кривая 2,3приведены результаты по влиянию присут _ 9+ ствия в среде ионов Са т на рН-зависимость отрицательного логарифма А23 Из рисунка видно, что, во-первых, увеличение крнцентрации ионов Са т приводит к тому, что ослабление срод ства лиганда к рецептору наступает при более высоких значениях рН (кривая 2); во-вторых, ионы Са не влияют на максимальное значение /\9 ЦРИ этом в присутствии насыщающих концентраций Са + рН-зависимость, как показывает анализ кривой 3 (рис. 29) с использованием стандартной программы на ЭВМ, контролируется одной ионогенной группой с рКа= 7,9. Это позволяет предположить, что при высоких концентрациях Са + рН-зависимость определяется состоянием ионизации лиганда. Обсчет на ЭВМ кривой I (рис. 29) с учетом этого предположения свидетельствует об участии в процессе взаимодействия -энкефалина с высокоаффинным рецептором еще одной ионогенной группы с рКа= 7,0. Так как по данным титрования энкефалина в его молекуле нет группы с таким значением рК , она должна присутствовать в рецепторе. Причем ионы Са конкурируют с протонами за группу с рК =7,0. Взаимодействие Н-энкефалина с высокоаффинным рецептором в присутствии катионов металлов, таким образом, характеризуется установлением следующих равновесий: характеризуют состояние ионизации высокоаффинного центра связывания ( о(. и A/fe2 ) и высокоаффинного центра и лиганда ( Л ). Цри рН 7,4 значение ( . ), вычисленное с использованием выражения (20), равно 3,95 , что близко к значениям (oL ) f представленным в табл. 7.
Дополнительным подтверждением справедливости схемы (ІУ) являются экспериментальные данные , представленные на рис.30. Эффективная константа Л//е2 в соот -ветствии с уравнением(14) должна линейно зависеть от концентрации протонов. Как видно из рис. 30, значения /\а2 » определенные при различных рН, линейно зависят от [HJ . Это дает возможность определить определить также "истинное", рН- независимое значение I\QQQ_ , а также значение константы 1\(ю . Р/ч?2 = »0 что полностью совпадает со значением константы, определенной при изучении рН- зависимости в отсутствие ионов металлов. Аналогично А з2 определены 1\MQ2. И для РяДа ДРУГИХ ионов ( см» табл. 9), Выражение (19) и данные табл. 9 позволяют рассчитать теоретические кривые зависимостей РА2Э от рН (в отсутствие и в присутствии ионов металлов). Как видно из рис. 29 , теоретические кривые (сплошные линии) хорошо соответствуют экспериментальным результатам, что говорит в пользу справедливости схемы (ІУ) в исследуемом диапазоне рН. Таким образом, характер влияния ионов металлов на комплекс сообразование %- энкефалина с выеокоаффинным центром связывания существенным образом отличается от влияния ионов металлов на низкоаффинный центр. В то время, как в случае низкоаффинного центра параметр оС характеризует эффект усиления ионами сродства рецептора к лиганду, в случае высокоаффинного центра параметр С отражает протонные равновесия рецептора. Л//е2 и Ддда зависят не только от сродства иона к центру , с кото рым связываются ионы металлов, но и от концентрации ионов водорода. При этом /\jg и Л23 соотношений (16) и (20) в обоих случаях отражают не только сродство связывающей формы рецептора к связываемой форме лиганда LH , но и протонные равновесия лиганда и центров связывания, характеризуемые константами l\Q » Hi, (схемы(Ш) и(1У)).
